Kap26.1基因作为引入绒山羊细胞改善绒毛细度的外源基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明发现了KAP26.1基因对辽宁绒山羊绒细度产生调控作用，即KAP26.1基因表达量越高，则绒毛细度越小；同时，KAP26.1基因的高表达会促使KAP7.1，KAP11.1等基因的表达量增高，这些基因的增高同样会降低绒毛细度，从而改善绒毛品质，从而发明了KAP26.1基因作为引入绒山羊细胞改善绒毛细度的外源基因的应用，将KAP26.1基因过表达慢病毒注射雄性辽宁绒山羊睾丸，通过病毒感染将KAP26.1基因作为外源基因引入绒山羊细胞之后选育K26.1基因表达量高的辽宁绒山羊个体作为种羊，进而可改善绒山羊绒毛细度，提高绒毛品质。
【专利说明】KAP26.1基因作为引入绒山羊细胞改善绒毛细度的外源基
因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种KAP26.1基因的新用途，尤其是一种KAP26.1基因作为引入绒山羊细胞改善羊绒细度的外源基因的应用。
【背景技术】
[0002]绒山羊毛被含有粗毛和绒毛，粗毛由初级毛囊产生，而绒毛(山羊绒)由次级毛囊产生。绒毛具有纤细、轻盈、滑柔、保暖、光泽柔和、富有弹性、纺织性能优良等其他纤维无法比拟的特性，是世界纺织工业生产最珍贵的天然纤维原料，素有“软黄金”的美誉。提高绒毛品质和增加绒毛产量是提高绒山羊经济价值的两项主要指标，而绒毛细度又是衡量绒毛品质的主要指标，即绒毛越细，质量越优。2011年，金梅等人发现辽宁绒山羊中存在基因K26，KAP8.2，KAP7.1,KAPl1.1，KAP26.1等，这些基因属于高甘氨酸/酪氨酸型角蛋白(K26)和角蛋白关联蛋白(HGT-KAPs)，主要分布于绒山羊皮肤细胞中。本领域技术人员都知道，外源基因是通过基因工程技术或病毒感染等途径引入靶细胞中的DNA序列，但是，迄今为止，还没有关于以KAP26.1基因为外源基因通过基因工程技术或病毒感染等途径引入绒山羊细胞，以改善羊绒细度的相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明是发现了 KAP26.1基因对辽宁绒山羊绒细度产生调控作用，即KAP26.1基因表达量越高，则绒毛细度越小；同时，KAP26.1基因的高表达会促使K26，KAP7.1, KAPl1.1等基因的表达量增高，这些基因的增高同样会降低绒毛细度，从而改善绒毛品质，从而发明了 KAP26.1基因作为引入绒山羊细胞改善绒毛细度的外源基因的应用。
[0004]本发明是以KAP26.1基因为外源基因，构建辽宁绒山羊KAP26.1基因的慢病毒过表达载体并经病毒包装，形成KAP26.1基因过表达慢病毒。将KAP26.1基因过表达慢病毒注射雄性辽宁绒山羊睾丸，通过病毒感染将KAP26.1基因作为外源基因引入绒山羊细胞。之后选育K26.1基因表达量高的辽宁绒山羊个体作为种羊，进而可改善绒山羊绒毛细度，提闻续毛品质。
【专利附图】
【附图说明】
[0005]图1是本发明实施例Lent1-EGFP病毒感染羊原代皮肤细胞的不同MOI值照片。
[0006]图2 是 KAP26.1 慢病毒过表达载体(pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP)菌落 PCR 鉴定电泳图。
[0007]图3是KAP26.1慢病毒过表达载体(pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP)酶切鉴定电泳图。
[0008]图4是KAP26.1基因过表达慢病毒(Lenti-KAP26.1-IRES-EGFP)慢病毒滴度测定结果图。
[0009]图5是目的基因KAP26.1过表达慢病毒的表达柱形图。
[0010]图6是KAP26.1基因过表达慢病毒毒液感染羊皮肤细胞荧光检测照片。
[0011]图7是本发明实施例KAP26.1基因过表达后羊皮肤细胞中相关基因表达量示意图。
[0012]图8是本发明实施例KAP26.1基因在羊毛囊兴盛期相对定量柱形图。
[0013]图9是本发明实施例KAP26.1基因在羊毛囊退行期相对定量柱形图。
【具体实施方式】
[0014]1.辽宁绒山羊原代皮肤细胞培养
(1)在辽宁绒山羊一侧的臀部选取大约5cm2的地方，用羊毛剪剪去长的毛和绒，碘酒消毒，然后用75%的酒精脱典后，用刀片割取约0.5cm3大小的组织块，并立即放入75%的酒精中，清洗30s，用含100U/ml双抗的生理盐水冲洗三次，最后将羊皮组织块放入D-Hanks中，封口膜封口，于4°C保存并于4h内带回实验室。
[0015](2)把羊皮肤小块置于含有D-Hanks缓冲液中，用D-Hanks液漂洗三次，然后用眼科剪剪切成Imm3左右的小组织块。取组织小块置于培养瓶均匀分布在培养瓶底部。摆布完成后，瓶底向上，于37°C，5%C02培养箱中培养2-3h后，待小块微干涸。干涸后，加入含20%FBS的DMEM培养基10ml，将培养瓶置于37°C，5%C02培养箱中静置5-7天，待有细胞从组织块中游出后增加培养液继续培养。再2-3天后可去除组织块和死细胞，加入新鲜的培养基继续培养。
[0016](3)细胞传代培养:细胞布满瓶底70%-80%左右时可传代培养。去除原培养基，加入D-Hanks冲洗3次，吸出缓冲液，加入含0.02%EDTA的0.25%胰酶1ml，培养箱中培养Imin左右后取出，镜检，细胞松动变圆，加入2倍胰酶体积的10% FBS的DMEM培养基终止消化。用移液枪吹打，吹打结束后，将细
胞转移到离心管中，1000 r/min离心2min。吸去上清液。将2ml含20%FBS的DMEM培养基注入到离心管中，吹打均匀后，平分到两个培养瓶中，最后补加适量的20%FBS的DMEM培养基，放入培养箱中培养，一般在2天左右细胞就会贴壁。
[0017]2.确定辽宁绒山羊原代皮肤细胞的慢病毒感染最佳MOI值
利用滴度为1.0X 108TU/ml的Lent1-EGFP NC阴性病毒液，Lent1-EGFP病毒购自invitrogen公司，检测慢病毒的最佳感染复数即MOI值，实验方法如下:
(1)用0.25%胰酶将皮肤细胞消化lmin，吹打均匀，制成细胞悬液，血球计数板计数并计算细胞的密度。将3000个左右细胞接种到96孔板中，培养基充至120ul，封口，于37°C、5%C02培养过夜；
(2)培养第二天，细胞的汇合度最好为30%-50%，此时准备感染；
(3)感染羊原代细胞的MOI值的范围在f200之间，因此本实验将MOI值设定梯度为:
.O,1，10,30,50,100 ；
(4)将相应滴度的Lent1-EGFPNC阴性病毒液依次加入皮肤细胞中，同时加入Polybrene助染剂5ug/ml，增强病毒的感染效果。将细胞放入培养箱中继续培养12h，倒置显微镜下观察细胞状态:病毒以及Polybrene助染剂对细胞没有产生明显的毒性作用，则将细胞放回培养箱中继续培养，并在24h后更换新的20%FBS的DMEM培养基；(5)在感染后72h，将细胞置于荧光显微镜下，观察96孔板中各孔内的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况，拍照记录，计算各MOI值下的感染效率，选择感染效率达到80%以上的最佳MOI值。具体结果见图1。图1是10倍物镜镜检照片，A为MOI=O组，B为MOI=1组，C 为 MOI=1 组，D 为 M0I=30 组，E 为 M0I=50 组，F 为 MOI=10 组，1，2 为添加 Polybrene 组，3,4为未添加Polybrene组。
[0018]通过实验结果发现,添加polybrene能明显促进病毒的感染效果,但同时还会发现对细胞有一定的毒副作用，会产生抑制细胞的增殖和细胞形态发生变化的副作用。因此，本实验的最佳MOI值选取30，并添加polybrene助染剂增强感染效率。
[0019]3.获得KAP26.1基因的PCR产物，建立KAP26.1慢病毒过表达载体pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP
(1)引物设计
根据KAP26.1基因CDS区序列设计合成18条寡聚核苷酸片段，基因3’端添加NheI酶切位点，5’端添加BamHI酶切位点。
[0020](2)基因全长PCR扩增
将所合成的寡居核苷酸序列片段按每相邻的4条进行PCR扩增。剩余的寡居核苷酸序列片段依次进行。取2ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。如果发现PCR产物出现杂带，则需进行切胶回收。第二轮PCR:第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，拼接KAP26.1全长基因。第三轮PCR:以第二轮PCR产物作为第三轮PCR模板，根据基因的首尾引物对基因全长进行扩增。
[0021](3)目的基因PCR产物及目的载体的酶切
将目的基因PCR产物和目的载体(Plenti6.3-MCS-1RES-EGFP)用BamHI和NheI分别进行双酶切。37°C酶切4-5h后，电泳分离酶切片段，切胶回收目的片段。
[0022](4)目的片段与目的载体的连接
T4 DNA Iigase连接上述酶切后的PCR产物及目的载体。将1ul的连接产物转化到DH5a感受态细胞中，涂布于含有氨苄的抗性LB平皿上，37° C培养过夜。第二天，挑取平板上的单菌落进行菌落PCR。
[0023]菌落PCR后，将PCR呈阳性的克隆接到LB液体培养基中，37°C摇菌过夜，第二天进行抽提质粒。菌落PCR呈阳性抽提出的质粒进行酶切鉴定。最后将菌落PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆送测序，并进行序列比对(见图2，3)，得到测序正确的pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP。
[0024]图2 中泳道 1:Marker DL5000 (从上到下分别为 5000，3000，2000，1500,1000,750，500，250，10(^?)，泳道2:阴性对照(水)，泳道3-10:K26-F1/ K26-R引物对重组子PCR扩增；
图 3 中泳道1 =Marker DL5000(从上到下分别为 5000，3000，2000，1500，1000，750，500，250，10bp),泳道2和3 =PacI和AscI酶对重组载体质粒进行双酶切。
[0025]4.制备KAP26.1基因过表达慢病毒
(l)将测序正确的pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP菌液划线培养后，挑单克隆菌接入30ml含氨苄的LB培养基中，37°C摇菌过夜。然后利用AXYGEN质粒抽提试剂盒进行质粒抽提。将质粒DNA最终溶于除菌的TE缓冲液中，用Thermo Nanodrop仪器检测质粒浓度和纯度。
[0026](2) 293T 细胞准备
在转染前一天，将生长状态良好的293Τ细胞弃掉旧培养液后，加入2 ml PBS溶液，使PBS洗涤细胞得生长面后弃去PBS溶液。每个培养皿中加入I ml0.25%胰酶消化液，制作细胞悬液，重悬均匀。将细胞传至被多聚赖氨酸(PDL)包被的1cm培养皿中，一共传20个培养皿，再向每皿中加入7 ml 10% FBS的DMEM培养基，于37 °C、5% CO2细胞培养箱中继续培养约24h。
[0027](3)慢病毒包装
转染时，向灭菌的50ml离心管中加入1ml Opt1-ΜΕΜ,加入表达质粒(pLenti6.3-KAP26.1-1RES-EGFP) 120ug 和包装质粒(Plenti6.3-MCS-1RES-EGFP) 120ug,混合均匀后，室温下孕育5min。然后向另一支灭菌的50ml离心管中加入1ml Opt1-MEM，加A POLOdeliverer ? 3000 Transfect1n Reagent 480ul,轻轻混匀后，室温下温育 5 min。接着把稀释后的DNA和稀释后的POLOdeliverer ? 3000 Transfect1n Reagent混合后轻轻颠倒混匀，室温下孵育20min。以形成DNA与POLOdeliverer ? 3000 Transfect1nReagent混合复合物。在293T细胞中滴加Iml上述混合复合物，于37 V , 5% CO2中培养。
[0028](4)病毒收获和浓缩
在转染后48 h，进行第一次收液，收集293T细胞上清液于4 °C暂存。然后把细胞更换新鲜的完全培养基，继续培养至72-80h，进行第二次收液，收集293T细胞上清，并与第一次收集的混合，共计300ml。将收集的病毒于4 0C, 3000 rpm离心10 min,以除去细胞碎片。用0.45 μ m滤器过滤上清液于Beckman SW28离心管中。每个离心管中装36ml病毒，4° C,22000rpm离心2h。离心完毕后，小心取出离心管，弃掉上清液，每管用130ul的预冷DMEM基本培养基溶解沉淀。待病毒沉淀溶解完全后，收集到1.5ml离心管内，10ul/管分装，于-80° C保存。
[0029](5)荧光显微镜观察法测定慢病毒滴度
感染前，用胰酶消化细胞并计数，将5X10 5细胞/ml的293T细胞接种24孔板中，每孔0.5ml。第二天，根据病毒的预期滴度，10倍倍比稀释慢病毒浓缩液。例如:15 ul慢病毒原液加入135 ul DMEM配成KT1病毒液，15 ul KT1病毒液加入135 ul DMEM配成10 2病毒液，以上述方法配置10 3病毒液和10 4病毒液。加入病毒液之前将细胞换新鲜培养基，每孔内加入400ull0%FBS的DMEM培养基，除了 control组外其余各孔均加入polybrene助染剂至终浓度为8 ug/ml。再向各感染孔内分别加入相应稀释度的病毒液及病毒原液各100ul，于37°C、5% CO2培养箱内培养。在感染24小时后，将细胞换新鲜培养基，每孔内加入500ull0% FBS的DMEM含有1% P/S和l%Glutamax，然后继续放回培养箱内进行培养。在感染48h后，在荧光显微镜下观察荧光表达情况，照相。选取合适的稀释度所对应的孔，对GFP阳性的细胞进行计数，并依此计算待测慢病毒的滴度(见图4)。
[0030]图4中A、B为未感染细胞对照组，C、D为10 ―1病毒液感染组，E、F为10 -2病毒液感染组，G、H为10 -3病毒液感染组，1、J为10 -4病毒液感染组。
[0031](6)病毒液目的基因KAP26.1检测
将处于对数期的293T细胞用0.25%胰酶消化lmin，吹打均匀，制成细胞悬液。将细胞接种到12孔板中，于37°C 5%C02培养箱培养，待细胞融合度达50%左右。在各孔中分别加入20ul目的病毒液(KAP26.1病毒液)及对照病毒液(Lent1-EGFP NC病毒液)，同时加入8ug/ml的Polybrene助染剂，促进感染。感染72h后，在荧光显微镜下观察目的基因慢病毒GFP的表达情况，并拍照记录感染结果。弃掉细胞的培养基，抽提RNAJf RNA反转录成cDNA。然后进行荧光定量检测，用ΛΛ Ct法对各基因进行相对定量。
[0032]经计算KAP26.1基因过表达慢病毒(Lenti-KAP26.1-1RES-EGFP)的滴度为:
8.32X 107Tu/mlo感染293T细胞后，荧光定量结果显示KAP26.1的表达量为NC对照组的70549.68 倍(见图 5)。
[0033]5.KAP26.1基因过表达后羊皮肤细胞中相关基因表达qPCR检测
KAP26.1目的病毒及NC阴性对照慢病毒感染羊皮肤细胞，过程如下:将细胞用0.25%的胰酶消化后，制成细胞悬液接种于6培养板中，于37°C 5%C02培养箱培养。根据MOI值的检测，向细胞中加入适宜病毒滴度的病毒液的目的病毒和阴性对照病毒液，同时在培养板的各孔中加入8ug/ml的Polybrene助染剂。感染8h后更换无慢病毒病毒液的20%FBS的DMEM培养基继续培养。感染72h后，在荧光显微镜下观察目的基因慢病毒GFP的表达情况，拍照记录感染结果(见图6)。从病毒感染后的羊皮肤细胞中抽提总RNA。RNA反转录成cDNA。然后进行Real-time PCR,结果用ΛΛ Ct法进行各基因表达的相对定量。
[0034]图6显示的是KAP26.1基因过表达慢病毒转染对数期的羊原代皮肤后，在荧光倒置显微镜下的照片。A、B为未感染慢病毒细胞空白对照组；C、D为NC慢病毒感染靶细胞组；E、F为KAP26.1目的慢病毒液感染靶细胞;A，C，E为在光学镜下的照片；B，D，F为荧光镜下的照片。
[0035]KAP26.1基因过表达后羊皮肤细胞中相关基因表达量见图7。表明KAP 26.1基因过表达后，KAP 7.1和KAP11.1显著过表达(P〈0.01), KAP 8.2，K26基因则无显著变化。
[0036]对KAP 7.1和KAP11.1进行各时期初次级毛囊的表达含量的研究结果，这两个基因在兴盛期时次级毛囊的表达含量明显高于初级毛囊，对绒毛的细度起正调控作用。本发明使KAP26.1过表达后，能明显增加KAP 7.1和KAP11.1基因的表达量，使绒毛变细。
[0037]在辽宁绒山羊毛囊兴盛期，以内参基因β -actin作为对照，KAP26.1在次级毛囊中的表达较初级毛囊更为活跃，KAP26.1在次级毛囊中的表达量是初级毛囊的4.74倍。从结果中可以得出，KAP26.1基因在初次级毛囊中的表达差异极显著(p〈0.01)，如图8所示。
[0038]而在辽宁绒山羊毛囊退行期，这个基因在初次级毛囊中的表达趋势与兴盛期相反，KAP26.1在初级毛囊中的表达量是次级毛囊中的3.84倍，其表达差异极显著(p〈0.01)，如图9所示。
[0039]说明:实时荧光定量PCR的检测结果显示，在辽宁绒山羊毛囊兴盛期、退行期初次级毛囊中以及毛囊休止期皮肤中的内参基因(β -actin)和KAP26.1这个目的基因都得到了较好的扩增曲线和融解曲线，扩增效率较高，并且融解曲线峰形单一，说明反应特异性好，从而证明了该实验数据可用。
[0040]6.5X105TU KAP26.1基因过表达慢病毒注射睾丸的成年雄性辽宁绒山羊并选KAP26.1高表达的成年雄性辽宁绒山羊为种羊，培育绒毛品质优良的辽宁绒山羊
首先将KAP26.1基因过表达慢病毒注射成年雄性辽宁绒山羊睾丸，之后在其中选KAP26.1高表达的成年雄性辽宁绒山羊为种羊作为实验组，正常成年种羊作为对照组，对后代各组绒山羊的绒细度及绒产量等指标进行检测，结果见表1与表2。
[0041]表1绒山羊KAP26.1高表达实验组生产性能平均测试指标
【权利要求】
1.一种 KAP26.1基因作为引入绒山羊细胞改善绒毛细度的外源基因的应用。
【文档编号】C12N15/867GK104099371SQ201410342823
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】金梅, 赵凤琴, 朴敬爱, 朴君, 李秀娜 申请人:辽宁师范大学