一种快速检测制药用水中微生物的方法
【专利摘要】一种快速检测制药用水中微生物的方法，包括：(1)过滤待检测的制药用水，转移Milliflex膜至含培养基的平板上；(2)转移短期培养Milliflex膜至含有染色溶液的平板上；(3)使用染色试剂盒所配置的染色液染色30min；(4)用观察装置对发出荧光的微生物菌落进行计数，记为FC；(5)转移Milliflex膜至含培养基的平板上再培养至5天，计数记为RIC，长期培养5天的Milliflex膜使用常规菌落计数，记为CC；(6)考察不同时间点的FC，减低剂量预处理(RIC)的结果与CC比较。本发明可以更快地确认制药用水中否存在污染，避免产品的生产中断。更早得到微生物实验结果以对生产用水有更好的了解和掌握。该发明适用于微生物实验室，制药厂使用。
【专利说明】一种快速检测制药用水中微生物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物检测方法，具体涉及一种快速检测制药用水中微生物的方 法。
【背景技术】
[0002] 微生物快速检测方法是微生物学中的一个快速发展的方向，无论是对食品，药品 用水安全的监督和管理，都需要一种较为快速的微生物检测方法。
[0003] 目前，对于微生物菌含量的检测，主要是依照传统的方法，将待检测的对象，接种 到适合的培养基中，进行培养，观察和计数。
[0004] 但是目前的这种方法由于需要长期的培养，需要数天，这对于需及时检测到待检 对象中的含菌量是不利的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，提供一种快速检测制药用水中微生物的方法，以克服现有技 术所存在的上述缺点和不足。本发明建立Milliflex Quantum方法快速检测制药用水中微 生物的含量，可以更快地确认制药用水中否存在污染，避免产品的生产中断。更早得到微生 物实验结果以对生产用水有更好的了解和掌握。该发明适用于微生物实验室，制药厂使用。
[0006] Milliflex Quantum基于突光染色法的，设计用于可过滤产品的快速微生物计数 检测的技术。这一简单易用的系统应用标准的工业薄膜过滤技术来培养单个样品中低至 1CFU活的可培养的微生物。该方法是基于传统的薄膜过滤法，因此任何实验室都可以对此 快速检测系统进行验证。
[0007] 本发明是一种快速检测微生物的Miliflex Quantum试剂盒的使用方法，该方法将 传统的微生物肉眼观察方法转化为使用荧光显微镜对荧光的检测。
[0008] 本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
[0009] 一种快速检测制药用水中微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010] (1)过滤待检测的制药用水，转移Milliflex膜至含培养基的平板上，根据微生物 的种类培养42小时，66小时和5天；
[0011] (2)转移短期培养包括24,42,66小时的Milliflex膜至含有染色溶液的平板上；
[0012] (3)使用染色试剂盒所配置的染色液染色30min ;
[0013] (4)用观察装置对发出荧光的微生物菌落进行计数，记为FC ;
[0014] (5)转移Milliflex膜至含培养基的平板上再培养至5天，计数记为RIC，长期培 养5天的Milliflex膜使用常规菌落计数，记为CC ;
[0015] (6)考察不同时间点的荧光计数结果FC，减低剂量预处理RIC与传统膜过滤法计 数结果CC比较，最终确定在42小时，各种微生物的FC值与CC值无显著性差异。
[0016] 进一步，步骤（1)中，所述染色溶液采用Miliflex Quantum试剂盒，包括：复溶剂、 荧光剂和染色缓冲液，首先将复溶剂与荧光剂混匀，然后再与染色缓冲液混匀制成。
[0017] 进一步，步骤（2)中，所述染色溶液使用量为2ml/平板。
[0018] 进一步，步骤（3)中，所述染色的温度为30_35°C。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 1、本发明与传统的方法细菌培养相比较，该方法在42小时就可以将待检微生物 检出，比较传统的5天培养法，较为快速，将污染的检出提前。
[0021] 2、本发明Milliflex Quantum基于突光染色法的，设计用于可过滤产品的快速微 生物计数检测的技术，检测过程易于操作和观察。这一简单易用的系统应用标准的工业薄 膜过滤技术来培养单个样品中低至1CFU活的可培养的微生物。该方法是基于传统的薄膜 过滤法，因此任何实验室都可以对此快速检测系统进行验证。
[0022] 3、本发明检测结果的准确性高。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0024] 图2为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0025] 图3为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0026] 图4为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0027] 图5为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0028] 图6为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0029] 图7为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0030] 图8为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0031] 图9为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
[0032] 图10为微生物的FC，RIC以及CC菌落计数图。
【具体实施方式】
[0033] 以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
[0034] 实施例IMiliflex Quantum试剂盒的使用
[0035] Miliflex Quantum试剂盒包括：1复溶剂、2突光剂、3染色缓冲液。
[0036] 开始复溶前1小时从冰箱中取出Miliflex Quantum试剂盒。在层流罩下或微生 物安全柜下复溶。室温下振摇瓶1至复溶剂完全溶解，将瓶1中复溶剂转移至瓶2荧光剂 中，混匀。将瓶2中混匀的试剂转移至瓶3染色缓冲液中，混匀，作为染色溶液。
[0037] 将培养箱中的Milliflex培养平板取出，放入层流台或微生物安全柜内；用1块用 无菌变性乙醇70/30湿润的无纺布擦拭清洁膜转移装置的表面；将Milliflex液体培养基 平皿放在膜转移装置上；将Milliflex液体培养基平皿上的保护膜移除。根据微生物的种 类培养42小时，66小时和5天。
[0038] 用移液管，在Milliflex液体培养基平皿垫片的中心位置加2ml染色溶液。加入 染色液时，请勿触摸垫片；使用除膜支架，分开Milliflex固体培养基和Milliflex膜。膜 上的盖子不要取下；启动Milliflex泵；将Milliflex膜连同盖子一起装配至Milliflex液 体培养基平皿上；按"C"停止泵；压下膜转移装置的杆子，将Milliflex液体培养基平皿从 转移装置上取下。
[0039] 将Milliflex液体培养基平皿放置于30-35°C，倒置培养30min。使用观察装置对 Mi 11 if lex膜计数。染色步骤后，从培养箱中将Mi 11 if lex液体培养基平皿取出。
[0040] 确认观察装置处于正常状态，并可以使用；打开观察装置的抽屉，将装配了 Milliflex膜的Milliflex液体培养基平皿放置在抽屉中；关闭抽屉；观察装置的抽屉被关 闭后，观察装置开始照射Milliflex膜。屏幕上会显示出计数器；通过观察装置的窗口人工 观察Milliflex膜，按下计数按钮进行计数；计数完成后，记录计数结果，打开抽屉，从观察 装置中取出Milliflex膜。
[0041] 转移Milliflex膜至含培养基的平板上再培养至5天，计数记为RIC，长期培养5 天的Milliflex膜使用常规菌落计数记为CC，也称为荧光染色后的再培养计数结果。
[0042] 考察不同时间点的FC，减低剂量预处理（RIC)的结果与CC比较，最终确定在42小 时，各种微生物的FC值与CC值无显著性差异（如图1-10所示）。
[0043] 取出后的Milliflex膜可以继续培养。
[0044] 实施例2检测的微生物
[0045] 检测的微生物种类包括：哈替草螺菌、金黄杆菌属、贪铜菌属、皮氏罗尔斯通氏菌、 刺状鞘氨醇单胞菌、柄杆菌属、不动杆菌、血红鞘氨醇单胞菌、食酸菌属和斐氏棒杆菌。
[0046] 对照采用传统的薄膜过滤法。
[0047] 两种方法的参数比较见表1。
[0048] 表1两种方法的参数比较
[0049]
【权利要求】
1. 一种快速检测制药用水中微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 过滤待检测的制药用水，转移Milliflex膜至含培养基的平板上，根据微生物的种 类培养42小时，66小时和5天； (2) 转移短期培养包括24,42,66小时的Millif lex膜至含有染色溶液的平板上； (3) 使用染色试剂盒所配置的染色液染色30min ; (4) 用观察装置对发出荧光的微生物菌落进行计数，记为FC ; (5) 转移Milliflex膜至含培养基的平板上再培养至5天，计数记为RIC，长期培养5 天的Mi 11 if lex膜使用常规菌落计数，记为CC ; (6) 考察不同时间点的荧光计数结果FC，减低剂量预处理RIC与传统膜过滤法计数结 果CC比较，最终确定在42小时，各种微生物的FC值与CC值无显著性差异。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述染色溶液采用Miliflex Quantum试剂盒，包括：复溶剂、荧光剂和染色缓冲液，首先将复溶剂与荧光剂混匀，然后再 与染色缓冲液混匀制成。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，所述染色溶液使用量为2ml/ 平板。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，所述染色的温度为30-35°C。
【文档编号】C12Q1/04GK104099399SQ201410342511
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】马卫东, 张锦文, 吴国平 申请人:上海罗氏制药有限公司