一种用于预测磺脲类药物疗效的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于预测磺脲类药物疗效的试剂盒。本发明所提供的用于预测磺脲类药物疗效的试剂盒，含有用于检测MTNR1B基因的rs10830963位点的单核苷酸多态性的物质，如由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。本发明从使用最为广泛的磺脲类降糖药物入手，开发出一种新的、能够提前预测磺脲类药物的疗效的产品，以指导实施更有效、更安全的糖尿病诊疗。从而进一步提高药物的疗效并减少因为药物在一些不敏感个体的微弱治疗效果而带来的病情延误和不必要的医疗花费。推进更有效的新型“个体化用药”进程，最终达到视“每个人的遗传学状况”而用药，使患者在获得最大药物疗效的同时，只面临最小的药物不良反应危险。
【专利说明】一种用于预测磺脲类药物疗效的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种用于预测磺脲类药物疗效的试剂盒。
【背景技术】
[0002]在糖尿病的治疗领域，磺脲类药物是一类非常重要的，使用最广泛的降糖药物。目前我国上市的磺脲类药物主要为格列苯脲、格列美脲、格列齐特、格列吡嗪和格列喹酮。磺脲类药物和β细胞上的受体结合，促进β细胞分泌胰岛素而起到降糖作用。临床研究显示，磺脲类药物可以使HbAlc降低I % -2 %，是目前许多国家和国际组织制定的糖尿病指南中推荐的控制2型糖尿病患者高血糖的主要用药。
[0003]在临床上可以观察到不同患者对磺脲类药物的反应不一。部分患者对磺脲类药物非常敏感，在小剂量下就可能出现低血糖。但是也约有10-20%的患者磺脲类治疗无效。然而，目前在给患者使用磺脲类药物之前，尚没有明确的检测手段来预测患者用药之后的反应，无法提前预估药物的疗效，因此无法做到个体化治疗。最新流行病学调查显示在中国人群中2型糖尿病的患病率高达9.7%，而只有约30%的糖尿病患者的血糖水平得到满意的控制。因此，开发能够预测药物疗效的产品，更好的进行个体化的治疗是提高糖尿病患者血糖控制率的一个重要因素。
[0004]药物作用的个体差异在很大程度上是个体鉴于药物作用和代谢相关的遗传背景差异所决定的。
[0005]MTNRlB (Melato nin rec印torlB，褪黑素受体 1B)基因位于 11 号染色体 q21_q22。基因ID为4554。编码褪黑素受体1B，属于G蛋白偶联受体家族。基础研究显示MTNRlB基因mRNA除了在视网膜、脑内表达之外，还可在人胰岛细胞表达，并且免疫组化显示主要分布在胰岛β细胞。rsl0830963位点位于MTNRlB基因上，Hapmap数据库中rsl0830963位点次要等位基因(G)频率是47.8%。近来研究发现MTNRlB基因rsl0830963位点和β细胞功能相关(Η0ΜΑ-Β，Ρ= 1.1 ΧΙΟ—15)，并且该位点是MTNRlB基因相关性分析中信号最强的位点。在一篇纳入18236例糖尿病患者和64453例正常血糖对照的荟萃分析中，rsl0830963位点还和糖尿病的发病风险增加相关(OR = 1.09,95% CIl.05-1.12，P = 3.3X10-7)。但是，目前的研究仅发现MTNRlB基因和β细胞功能以及糖尿病存在关联，国际和国内均未将该基因用于糖尿病药物疗效的预评估。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的试剂盒。
[0007]本发明所提供的用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的试剂盒，含有用于检测MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性的物质。
[0008]其中，所述用于检测MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性的物质可为任何能够检测所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性的物质。
[0009]所述MTNRlB基因的核苷酸序列为GenBank:NC_000011.10的第1-13160位；相应的，所述 MTNRlB 基因的 rsl0830963 位点对应 GenBank:NC_000011.10 的第 5922 位。
[0010]在本发明中，所述用于检测MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性的物质为引物对；所述引物对为用于扩增所述MTNRlB基因上包含所述rsl0830963位点的DNA片段的引物对。
[0011]更加具体的，所述引物对为由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
[0012]在所述试剂盒中，还可含有如下中的至少一种:DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP。
[0013]所述磺脲类药物可选自格列苯脲、格列美脲、格列齐特、格列吡嗪和格列喹酮。
[0014]在本发明的一个实施例中，所述磺脲类药物具体为格列苯脲。
[0015]另外，所述试剂盒中还可含有记载有如下内容的说明书:
[0016]所述磺脲类药物对所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为G/G的所述待测糖尿病患者的疗效在统计学上显著强于所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/C或C/G的所述待测糖尿病患者。
[0017]在本发明中，所述疗效具体体现在所述待测糖尿病患者用药后空腹血糖与用药前空腹血糖相比的下降幅度上。
[0018]进一步，可按照如下步骤确定所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型:
[0019](I)以所述待测糖尿病患者的基因组DNA为模板，采用由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增；
[0020](2)若经过所述PCR扩增得到如下(A)所示PCR产物，则所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为G/G ;若经过所述PCR扩增得到如下(B)所示PCR产物，则所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/C ;若经过所述PCR扩增得到如下(C)所示PCR产物，则所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/G ；
[0021](A)单一 PCR产物:核苷酸序列为序列表中序列3，第107位为G ；
[0022](B)单一 PCR产物:核苷酸序列为序列表中序列3，第107为C ;
[0023](C)两种PCR产物:一种的核苷酸序列为序列表中序列3，第107位C ;另一种的核苷酸序列为序列表中序列3，第107位为G。
[0024]在本发明中，所述糖尿病患者具体为2型糖尿病患者。
[0025]另外，所述的试剂盒在制备用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0026]所述磺脲类药物可选自格列苯脲、格列美脲、格列齐特、格列吡嗪和格列喹酮。
[0027]在本发明的一个实施例中，所述磺脲类药物具体为格列苯脲。
[0028]在本发明中，所述糖尿病患者具体为2型糖尿病患者。
[0029]本发明通过检测MTNRlB基因rs 10830963位点，给出患者对磺脲类降糖药物的反应的预测。从使用最为广泛的磺脲类降糖药物入手，开发出一种新的、能够提前预测磺脲类药物的疗效的产品，以指导实施更有效、更安全的糖尿病诊疗。从而进一步提高药物的疗效并减少因为药物在一些不敏感个体的微弱治疗效果而带来的病情延误和不必要的医疗花费。推进更有效的新型“个体化用药”进程，最终达到视“每个人的遗传学状况”而用药，使患者在获得最大药物疗效的同时，只面临最小的药物不良反应危险。
【具体实施方式】
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]实施例1、用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的试剂盒的制备及应用
[0033]一、用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的试剂盒的制备
[0034]本发明中，用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的试剂盒中最重要的组成为用于检测人MTNRlB基因的rsl0830963位点单核苷酸多态性的引物对。
[0035]本发明的发明人针对人MTNRlB基因的rsl0830963位点上下游的保守区序列涉及合成如下引物对:
[0036]上游引物:5’-GATTTGCTTGCTGAACAC-3’(序列 I)；
[0037]下游引物:5’-GCATCATTTGCTGTCTCA-3’ (序列 2)。
[0038]理论上，以人的基因组DNA为模板，采用该引物对进行PCR扩增，会得到序列表中序列3所示的DNA序列。其中，序列3的第107位对应所述MTNRlB基因的rsl0830963位点，可为G或C。
[0039]二、用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的试剂盒的应用
[0040]供试群体:全国15家三级甲等医院确诊的719名2型糖尿病患者(患者同意，并签署了知情同意书)。其中，男性389名，女性330名(男女比例接近1:1)。他们的平均年龄为54.5±8.6岁，平均体重指数(BMI) 24.9±2.8kg/m2。入选患者的上述临床特征和2008年发表在新英格兰杂志上中国糖尿病流行病学调查显示的我国糖尿病患者的临床特征类似(平均年龄为55.8 (54.2-57.4)岁，平均体重指数(BMI) 25.2 (24.9-25.6) kg/m2)，因此，入选人群具有普适性。
[0041]1、待测糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性的检测
[0042]采用步骤一设计合成的引物对对上述供试群体的MTNRlB基因的rs 10830963位点的单核苷酸多态性进行检测，具体如下:
[0043](I)从每个待测糖尿病患者的血液样本中提取基因组DNA。
[0044](2)以基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的引物对进行PCR扩增，得到大小为265bp的目的产物(序列3)。
[0045](3) PCR产物电泳合格后，使用Sanger法进行测序，获得rs 10830963位点的基因型?艮告。
[0046]若所得PCR产物为单一 PCR产物，序列3的第107位为G，则该待测糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为G/G ；
[0047]若所得PCR产物为单一 PCR产物，序列3的第107位为C，则该待测糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/C ；
[0048]若所得PCR产物为两种PCR产物，一种序列3的第107位为C，另一种序列3的第107位为G，则该待测糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/G。
[0049]结果显示:719例待测糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位点次要等位基因(G)频率为43.2%，基本符合Hapmap数据库中的检索结果(47.8%)。具体而言，719例待测糖尿病患者中共有155例MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为G/G ；253例MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/C ；311例MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/G。
[0050]2、磺脲类药物对不同待测糖尿病患者的实际疗效测定
[0051]格列苯脲是临床试验以及糖尿病药物比较研究中常用的经典的磺脲类药物的代表。本发明选择小剂量(1.25mg，一天一次)的格列苯脲对719例待测糖尿病患者进行实际疗效测定。整个随访过程中饮食、运动以及药物剂量不变，随访4周。测定待测患者治疗前后的空腹静脉血糖，进而计算血糖的下降幅度。
[0052]血糖的下降幅度=(治疗前空腹血糖-治疗后空腹血糖)/治疗前空腹血糖 X100%o
[0053]结果显示:G/G基因型患者(155例)格列苯脲的疗效最好，血糖下降幅度均值达到14%，显著高于C/C基因型患者(253例)的9.2%和C/G基因型患者(311例)的9.1%(P = 0.007)。根据《新药西药临床研究指导原则》，血糖下降幅度超过10%提示该降糖药物在该剂量下有效。本发明的检测结果提示G/G基因型患者血糖下降幅度达到14%，该结果和《新药西药临床研究指导原则》中疗效判定结果一致。因此，使用本发明可以从由719例2型糖尿病患者组成的供试群体中筛查出22% (155例)对小剂量格列苯脲最为敏感，属于血糖下降幅度最为明显的患者。这部分G/G基因型的患者将从磺脲类药物的治疗中得到最大的获益。
[0054]3,MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性与磺脲类药物疗效时间的关系分析
[0055]本发明的发明人结合步骤I和步骤2得到的每个待测糖尿病患者的MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型及其采用格列苯脲治疗后血糖的下降幅度两方面的结果，通过Binary Logistic回归分析观察rsl0830963位点不同基因型患者血糖下降幅度的差别。OR= 1，表示该基因型对疗效的变化不起作用；0R>1，表示该基因型是对药物的疗效即血糖的下降的有利因素；0R〈1表示该基因型是对药物的疗效不利的因素。
[0056]回归分析显示:MTNR1B基因rs 10830963位点在隐性遗传模式下和格列苯脲的疗效显著相关，G/G基因型患者(155例)格列苯脲的疗效最好(OR= 1.849,95 %CIl.283-2.665, P = 0.001)。
【权利要求】
1.一种用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的试剂盒，含有用于检测MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性的物质。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述用于检测MTNRlB基因的rsl0830963位点的单核苷酸多态性的物质为引物对； 所述引物对为用于扩增所述MTNRlB基因上包含所述rsl0830963位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述引物对为由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还含有如下中的至少一种:DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述磺脲类药物选自格列苯脲、格列美脲、格列齐特、格列吡嗪和格列喹酮。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中还含有记载有如下内容的说明书: 所述磺脲类药物对所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为G/G的所述待测糖尿病患者的疗效强于所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/C或C/G的所述待测糖尿病患者。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:按照如下步骤确定所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型: (1)以所述待测糖尿病患者的基因组DNA为模板，采用由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增； (2)若经过所述PCR扩增得到如下(A)所示PCR产物，则所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为G/G ;若经过所述PCR扩增得到如下(B)所示PCR产物，则所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/C ;若经过所述PCR扩增得到如下(C)所示PCR产物，则所述MTNRlB基因的rsl0830963位点的基因型为C/G ； (A)单一PCR产物:核苷酸序列为序列表中序列3，第107位为G ； (B)单一PCR产物:核苷酸序列为序列表中序列3，第107位为C ； (C)两种PCR产物:一种的核苷酸序列为序列表中序列3,第107位为C;另一种的核苷酸序列为序列表中序列3，第107位为G。
8.根据权利要求1-7中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述糖尿病患者为2型糖尿病患者。
9.权利要求1-8中任一所述的试剂盒在制备用于预测磺脲类药物对待测糖尿病患者疗效的产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104131090SQ201410342735
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】纪立农, 任倩, 韩学尧, 吴长海, 张春波, 邹琦, 耿春贤, 周杰, 刘珊珊 申请人:北京大学人民医院, 广州白云山中一药业有限公司