细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分析方法
【专利摘要】一种细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分析方法，包括以下步骤：步骤1：细菌DNA样本提取，步骤2：细菌16S?rDNA500片段基因扩增，步骤3：纯化PCR产物，步骤4：循环测序反应，步骤5：纯化测序反应产物，步骤6：制备毛细管电泳样品并电泳，和7.1基因测试质量分析接受标准。本发明具有方法便利，批量处理，数据准确，稳定性高的优点。
【专利说明】细菌1 6SrDNA500片段基因测序及db I ast数据库分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种数据库分析方法，具体涉及一种细菌16SrDNA500片段基因测序 及dblast数据库分析方法。
【背景技术】
[0002] 检测环境中的细菌，以及细菌的多样性，做DGGE，去做高通量测序，测它几万几 十万条。
[0003] DGGE在用来分析菌群结构简单的环境样品时有着非常明显的优势，比如传统发酵 食品,再比如青贮饲料菌群变化。
[0004] DGGE的缺点非常明显的，尤其在用来分析复杂环境样品的时候。特别是一个非常 复杂的环境，微生物的种类成百上千种。而DGGE的分辨率非常低，往往能分开30个条带。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，提供一种细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分 析方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
[0006] 本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
[0007] -种细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分析方法，其特征在于，包括 以下步骤：
[0008] 步骤1 :细菌DNA样本提取
[0009] DNA 提取试剂盒：PrepMan? Ultra Sample Preparation Reagent
[0010] 1. 1预加热：打开恒温混匀仪，设置温度为99°C ;
[0011] 1. 2在试管上标记样品名称，向每个试管中各加入PrepMan Ultra样品制备试剂 100μ 1 ；
[0012] 1. 3从长有菌落的琼脂培养基上挑取单一克隆到上一步加入的样品制备试剂中， 制成悬液；
[0013] 1. 4每个试管充分混悬振荡10到30秒；
[0014] 1. 5样品置99°C加热10分钟，然后冷却到室温；
[0015] 1. 6样品置微型离心管中，以12000rpm的转速离心2分钟；
[0016] 1.7立即转移上层液50 μ 1到新的已标记的微型离心管中；
[0017] 1. 8吸取无核酸酶水495 μ 1到微型离心管；
[0018] 1. 9从第7步所制备溶液转移5 μ 1到495 μ 1的水中，获得1:100的DNA样品溶 液；
[0019] 1. 10涡旋离心管，以混合溶液，1:100的溶液可保存于4°C (1个月）或-20°c ( - 年）；
[0020] 步骤2 :细菌16S rDNA500片段基因扩增
[0021] 16S rDNA500 基因扩增试剂盒：ABFast MicroSeq? 50016S rDNA PCRKit
[0022] 2. 1将试剂盒中的三管试剂置室温下解冻；
[0023] 2. 2试剂使用前温和地混悬5秒，分别吸取15 μ 1的PCR Master Mix试剂到96孔 快速PCR板或PCR管上；需加试剂的孔数量或管数为所有样品数量加上阳性和阴性对照的 总数
[0024] 2. 3取步骤一制得的1:100的样品DNA15 μ 1，转移到样品孔或管中；
[0025] 2. 4吸取15 μ 1的阳性和阴性对照至相对应的孔或管中；
[0026] 2. 5将粘膜覆盖在96孔板上并封严，或盖紧管盖；
[0027] 2. 6打开PCR仪，按试剂盒指导设置PCR仪的热循环参数；
[0028] 热循环参数：初始阶段：95°C维持10秒钟；
[0029] 循环阶段：95°C融解变性0秒；64°C退火15秒；
[0030] 循环数30个；
[0031] 最终扩增阶段：72 °C维持1分钟；
[0032] 结束阶段：降至4°C保温；
[0033] 设置反应体积为30 μ 1 ;
[0034] 2. 7放置96孔板或管到PCR仪，并运行PCR程序；
[0035] 完成后，PCR产物可存储于-15?-25°C，需要时取用，PCR产物在-20°C可保持稳 定状态至少6个月而不降解；
[0036] 步骤3 :纯化PCR产物
[0037] PCR产物纯化试剂盒：AxyPrep PCR清洁试剂盒
[0038] 3. 1使用前，取Buffer W2concentrate浓缩物，按试剂瓶上指定的体积加入无水 乙醇，使用前注意检查Buffer PCR-A是否出现沉淀，如有沉淀，用65°C温浴加热至沉淀完 全溶解并冷却至室温后使用；
[0039] 3. 2向步骤二获得的PCR产物中，加入3倍体积的Buffer PCR-A(若不足100 μ 1， 补足至100 μ 1)，混匀后转移至DNA制备管，将DNA制备管置于2ml离心管（试剂盒提供） 中，以12000g离心1分钟，弃滤液；
[0040] 3. 3将制备管放回2ml离心管中，加700 μ 1的Buffer W2,以12000g离心1分钟， 弃滤液；
[0041] 3. 4将制备管放回2ml离心管中，加400μ 1的Buffer W2,以12000g离心1分钟， 弃滤液；
[0042] 3. 5将制备管置于洁净的1. 5ml离心管（试剂盒提供）中，在制备管的膜中央加 25?30 μ 1的Eluent或去离子水，室温静置1分钟，以12000g离心1分钟洗脱收集DNA ;
[0043] 步骤4 :循环测序反应
[0044] 测序试剂盒：ABMicroSeqk Full Genel6S rDNA Sequencing Kit
[0045] 4. 1使用前，取出试剂盒中各管试剂在室温下解冻后，置冰浴中；
[0046] 4. 2试剂使用前，温和地混悬5秒，分别吸取13 μ 1的PCR Master Mixl的正向测 序反应试剂和反向测序反应试剂到96孔快速PCR板或PCR管上，PCR Master Mix2和3同 法操作，对于每个样品，一共为6孔或管；
[0047] 4. 3向上一步加好PCR Master Mix的各管中加入步骤三所获得的纯化产物7 μ 1 ;
[0048] 4. 4吸取相应的阳性对照和阴性对照7 μ 1按样品孔同法操作；
[0049] 4. 5将粘膜覆盖在96孔板上并封严，或盖紧管盖；
[0050] 4. 6打开PCR仪，按试剂盒指导设置PCR仪的热循环参数；
[0051] 热循环参数：初始阶段：96°C维持1分钟；
[0052] 循环阶段：96°C融解变性10秒；50°C退火5秒；60°C扩增1分15秒；
[0053] 循环数25个；
[0054] 结束阶段：降至4°C保温；
[0055] 设置反应体积为20 μ 1 ;
[0056] 4. 7测序反应完成后，测序反应中过量染料和底物需要清除；
[0057] 步骤5:纯化测序反应产物
[0058] 测序反应产物纯化试剂盒：QIANGEN DyeEx? 2. OSpin Kit
[0059] 5. 1温和混悬过滤柱内的树脂，去掉过滤柱的盖子，将其放置到DyeEx试剂盒提供 的收集管中；
[0060] 5. 2以3000rpm的转速离心3分钟，树脂凝胶形成斜面，将形成斜面的柱子转移到 到一个新的微型离心管中；
[0061] 5. 3缓慢地将每份测序反应产物直接加入斜面柱的凝胶斜面表面中心部位，注意 不要触碰到凝胶表面；
[0062] 5. 4以每分钟3000转离心3分钟；
[0063] 5. 5丢弃斜面柱，洗出液中含有纯化后的DNA ;
[0064] 步骤6 :制备毛细管电泳样品并电泳
[0065] 6. 1移取10微升Hi-Di甲酰胺到96孔测序板，按排好的顺序转移10微升纯化后 的DNA样品到含有Hi-Di甲酰胺的孔中；
[0066] 6. 2运行电泳；
[0067] 步骤7 :使用测序仪产生并分析细菌序列，从商业数据库dblast中比对序列，生成 报告
[0068] 核酸测序仪：Applied Biosystems3130Genetic Analyzer
[0069] 7· 1基因测试质量分析接受标准：
[0070] 对于16S rDNA500 -致性序列长度<400bp ;
[0071] 基线，过滤和装配显示绿方框；
[0072] 样本分值大于等于35 ;
[0073] 7. 2将生成的.fsta文件倒入数据库进行序列比对，最后生成报告；
[0074] 7. 3 数据库网：--Η :http://serverl. diagnostic-blast, com/ ：
[0075] 7. 4对于种水平鉴定要大于等于99. 00 % ;
[0076] 7. 5属水平鉴定大于等于97. 00 %小于99. 00 %。
[0077] 本发明的有益效果：
[0078] 本发明具有方法便利，批量处理，数据准确，稳定性高的优点。
【具体实施方式】
[0079] 以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
[0080] 实施例1
[0081] 细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分析流程
[0082] 步骤一：细菌DNA样本提取
[0083] (DNA 提取试剂盒：PrepManκ) Ultra Sample Preparation Reagent)
[0084] 1、预加热：打开恒温混匀仪，设置温度为99°C ;
[0085] 2、在试管上标记样品名称，向每个试管中各加入PrepMan Ultra样品制备试剂 100μ 1 ；
[0086] 3、从长有菌落的琼脂培养基上挑取单一克隆到上一步加入的样品制备试剂中，制 成悬液；
[0087] 4、每个试管充分混悬振荡10到30秒；
[0088] 5、样品置99°C加热10分钟，然后冷却到室温；
[0089] 6、样品置微型离心管中，以12000rpm的转速离心2分钟；
[0090] 7、立即转移上层液50 μ 1到新的已标记的微型离心管中；
[0091] 8、吸取无核酸酶水495 μ 1到微型离心管；
[0092] 9、从第7步所制备溶液转移5 μ 1到495 μ 1的水中，获得1:100的DNA样品溶液；
[0093] 10、涡旋离心管，以混合溶液。1:100的溶液可保存于4°C (1个月）或_20°C ( - 年）；
[0094] 步骤二：细菌16S rDNA500片段基因扩增
[0095] (16S rDNA500 基因扩增试剂盒：ABFast MicroSeq? 50016S rDNA PCRKit)
[0096] 1、将试剂盒中的三管试剂置室温下解冻；
[0097] 2、试剂使用前温和地混悬5秒，分别吸取15 μ 1的PCR Master Mix试剂到96孔 快速PCR板或PCR管上；（需加试剂的孔数量或管数为所有样品数量加上阳性和阴性对照 的总数。）
[0098] 3、取步骤一制得的1:100的样品DNA15 μ 1，转移到样品孔或管中；
[0099] 4、吸取15 μ 1的阳性和阴性对照至相对应的孔或管中；
[0100] 5、将粘膜覆盖在96孔板上并封严，或盖紧管盖；
[0101] 6、打开PCR仪，按试剂盒指导设置PCR仪的热循环参数。
[0102] 热循环参数：初始阶段：95°C维持10秒钟；
[0103] 循环阶段：95°C融解变性0秒；64°C退火15秒；
[0104] 循环数30个；
[0105] 最终扩增阶段：72 °C维持1分钟；
[0106] 结束阶段：降至4°C保温；
[0107] 设置反应体积为30 μ 1
[0108] 7、放置96孔板或管到PCR仪，并运行PCR程序；
[0109] 完成后，PCR产物可存储于-15?-25°C，需要时取用。PCR产物在-20°C可保持稳 定状态至少6个月而不降解；
[0110] 步骤三：纯化PCR产物
[0111] (PCR产物纯化试剂盒：AxyPr印PCR清洁试剂盒）
[0112] 1、使用前，取Buffer W2concentrate浓缩物，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙 醇。使用前注意检查Buffer PCR-A是否出现沉淀，如有沉淀，用65°C温浴加热至沉淀完全 溶解并冷却至室温后使用；
[0113] 2、向步骤二获得的PCR产物中，加入3倍体积的Buffer PCR-A(若不足100 μ 1， 补足至100 μ 1)，混匀后转移至DNA制备管，将DNA制备管置于2ml离心管（试剂盒提供） 中，以12000g离心1分钟，弃滤液；
[0114] 3、将制备管放回2ml离心管中，加700μ 1的Buffer W2,以12000g离心1分钟，弃 滤液；
[0115] 4、将制备管放回21111离心管中，加40(^1的81^€6112，以1200(^离心1分钟，弃 滤液；
[0116] 5、将制备管置于洁净的1.5ml离心管（试剂盒提供）中，在制备管的膜中央加 25?30 μ 1的Eluent或去离子水，室温静置1分钟。以12000g离心1分钟洗脱收集DNA ;
[0117] 步骤四：循环测序反应
[0118] (测序试剂盒：ABMicr〇SeqK'Full Genel6S rDNA Sequencing Kit)
[0119] 1、使用前，取出试剂盒中各管试剂在室温下解冻后，置冰浴中；
[0120] 2、试剂使用前，温和地混悬5秒，分别吸取13 μ 1的PCR Master Mixl的正向测序 反应试剂和反向测序反应试剂到96孔快速PCR板或PCR管上，PCR Master Mix2和3同法 操作，对于每个样品，一共为6孔或管；
[0121] 3、向上一步加好PCR Master Mix的各管中加入步骤三所获得的纯化产物7 μ 1 ;
[0122] 4、吸取相应的阳性对照和阴性对照7 μ 1按样品孔同法操作；
[0123] 5、将粘膜覆盖在96孔板上并封严，或盖紧管盖；
[0124] 6、打开PCR仪，按试剂盒指导设置PCR仪的热循环参数；
[0125] 热循环参数：初始阶段：96°C维持1分钟；
[0126] 循环阶段：96°C融解变性10秒；50°C退火5秒；60°C扩增1分15秒；
[0127] 循环数25个；
[0128] 结束阶段：降至4°C保温；
[0129] 设置反应体积为20 μ 1
[0130] 7、测序反应完成后，测序反应中过量染料和底物需要清除；
[0131] 步骤五：纯化测序反应产物
[0132] (测序反应产物纯化试剂盒：QIANGEN DyeEx? 2. OSpin Kit)
[0133] 1、温和混悬过滤柱内的树脂，去掉过滤柱的盖子，将其放置到DyeEx试剂盒提供 的收集管中；
[0134] 2、以3000rpm的转速离心3分钟，树脂凝胶形成斜面，将形成斜面的柱子转移到到 一个新的微型离心管中；
[0135] 3、缓慢地将每份测序反应产物直接加入斜面柱的凝胶斜面表面中心部位，注意不 要触碰到凝胶表面；
【权利要求】
1. 一种细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分析方法，其特征在于，包括以 下步骤： 步骤1 :细菌DNA样本提取， 步骤2 :细菌16S rDNA500片段基因扩增， 步骤3 :纯化PCR产物， 步骤4 :循环测序反应， 步骤5 :纯化测序反应产物， 步骤6 :制备毛细管电泳样品并电泳，和 7. 1基因测试质量分析接受标准。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，提取试剂盒为PrepMan? Ultra Sample Preparation Reagent，进一步包括以下步骤： 1. 1预加热：打开恒温混匀仪，设置温度为99°c ; 1.2在试管上标记样品名称，向每个试管中各加入PrepMan Ultra样品制备试剂 100μ 1 ； 1. 3从长有菌落的琼脂培养基上挑取单一克隆到上一步加入的样品制备试剂中，制成 悬液； 1. 4每个试管充分混悬振荡10到30秒； 1. 5样品置99°C加热10分钟，然后冷却到室温； 1. 6样品置微型离心管中，以12000rpm的转速离心2分钟； 1. 7立即转移上层液50 μ 1到新的已标记的微型离心管中； 1. 8吸取无核酸酶水495 μ 1到微型离心管； 1. 9从第7步所制备溶液转移5 μ 1到495 μ 1的水中，获得1:100的DNA样品溶液； 1. 10涡旋离心管，以混合溶液，1:100的溶液可保存于4°C，期限为1个月，或-20°C，期 限为一年。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中，16S rDNA500基因扩增试剂盒： ABFast MicroSeq? 50016S rDNA PCRKit，进一步包括以下步骤： 2. 1将试剂盒中的三管试剂置室温下解冻； 2. 2试剂使用前温和地混悬5秒，分别吸取15 μ 1的PCR Master Mix试剂到96孔快速 PCR板或PCR管上；需加试剂的孔数量或管数为所有样品数量加上阳性和阴性对照的总数 2. 3取步骤一制得的1:100的样品DNA15 μ 1，转移到样品孔或管中； 2. 4吸取15 μ 1的阳性和阴性对照至相对应的孔或管中； 2. 5将粘膜覆盖在96孔板上并封严，或盖紧管盖； 2. 6打开PCR仪，按试剂盒指导设置PCR仪的热循环参数； 热循环参数：初始阶段：95°C维持10秒钟； 循环阶段：95°C融解变性0秒；64°C退火15秒； 循环数30个； 最终扩增阶段：72°C维持1分钟； 结束阶段：降至4°C保温； 设置反应体积为30 μ 1 ; 2. 7放置96孔板或管到PCR仪，并运行PCR程序； 完成后，PCR产物可存储于-15?-25°C，需要时取用，PCR产物在-20°C可保持稳定状 态至少6个月而不降解。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中，PCR产物纯化试剂盒：AxyPrep PCR清洁试剂盒，进一步包括以下步骤： 3. 1使用前，取Buffer W2concentrate浓缩物，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇， 使用前注意检查Buffer PCR-A是否出现沉淀，如有沉淀，用65°C温浴加热至沉淀完全溶解 并冷却至室温后使用； 3. 2向步骤二获得的PCR产物中，加入3倍体积的Buffer PCR-A(若不足100 μ 1，补足 至100 μ 1)，混匀后转移至DNA制备管，将DNA制备管置于2ml离心管（试剂盒提供）中，以 12000g离心1分钟，弃滤液； 3. 3将制备管放回2ml离心管中，加700 μ 1的Buffer W2,以12000g离心1分钟，弃滤 液； 3. 4将制备管放回2ml离心管中，加400 μ 1的Buffer W2,以12000g离心1分钟，弃滤 液； 3. 5将制备管置于洁净的1. 5ml离心管（试剂盒提供）中，在制备管的膜中央加25? 30 μ 1的Eluent或去离子水，室温静置1分钟，以12000g离心1分钟洗脱收集DNA。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4中，测序试剂盒：ABMicroSeq? Full Genel6S rDNA Sequencing Kit，进一步包括以下步骤： 4. 1使用前，取出试剂盒中各管试剂在室温下解冻后，置冰浴中； 4. 2试剂使用前，温和地混悬5秒，分别吸取13μ 1的PCR Master Mixl的正向测序反 应试剂和反向测序反应试剂到96孔快速PCR板或PCR管上，PCR Master Mix2和3同法操 作，对于每个样品，一共为6孔或管； 4. 3向上一步加好PCR Master Mix的各管中加入步骤三所获得的纯化产物7μ 1 ; 4. 4吸取相应的阳性对照和阴性对照7 μ 1按样品孔同法操作； 4. 5将粘膜覆盖在96孔板上并封严，或盖紧管盖； 4. 6打开PCR仪，按试剂盒指导设置PCR仪的热循环参数； 热循环参数：初始阶段：96°C维持1分钟； 循环阶段：96°C融解变性10秒；50°C退火5秒；60°C扩增1分15秒； 循环数25个； 结束阶段：降至4°C保温； 设置反应体积为20 μ 1 ; 4. 7测序反应完成后，测序反应中过量染料和底物需要清除。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5中，测序反应产物纯化试剂盒： QIANGENDyeEx? 2. OSpin Kit，进一步包括以下步骤： 5. 1温和混悬过滤柱内的树脂，去掉过滤柱的盖子，将其放置到DyeEx试剂盒提供的收 集管中； 5. 2以3000rpm的转速离心3分钟，树脂凝胶形成斜面，将形成斜面的柱子转移到到一 个新的微型离心管中； 5. 3缓慢地将每份测序反应产物直接加入斜面柱的凝胶斜面表面中心部位，注意不要 触碰到凝胶表面； 5. 4以每分钟3000转离心3分钟； 5. 5丢弃斜面柱，洗出液中含有纯化后的DNA。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6,进一步包括以下步骤： 6. 1移取10微升Hi-Di甲酰胺到96孔测序板，按排好的顺序转移10微升纯化后的DNA 样品到含有Hi-Di甲酰胺的孔中； 6. 2运行电泳。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7中，核酸测序仪:Applied Biosystems3130Genetic Analyzer，进一步包括以下步骤： 7. 1基因测试质量分析接受标准： 对于16S rDNA500 -致性序列长度<400bp ; 基线，过滤和装配显示绿方框； 样本分值大于等于35 ; 7. 2将生成的.fsta文件倒入数据库进行序列比对，最后生成报告； 7· 3 数据库网址：http://serverl. diagnostic-blast, com/ ； 7. 4对于种水平鉴定要大于等于99. 00% ; 7. 5属水平鉴定大于等于97. 00%小于99. 00%。
【文档编号】C12Q1/04GK104099420SQ201410342600
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】马卫东, 张锦文, 吴国平 申请人:上海罗氏制药有限公司