一种低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，包括如下步骤：(1)取新鲜的液体样品；(2)先将液体样品进行程序降温贮藏：在13～17℃下贮藏1～2h，然后将温度降至3～7℃贮藏1～2h；(3)将液体样品升温至35～40℃，立即进行脉冲电场处理。本发明能在较低的脉冲电场强度下达到有效杀灭单增李斯特菌的效果，更加高效，安全，节能。
【专利说明】一种低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品非热加工领域，特别涉及一种低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法。
【背景技术】
[0002]脉冲电场杀菌高压脉冲电场杀菌(PEF)作为一种非热杀菌技术，与传统的热加工相比，以其能够很好地保持食品营养成分、色泽、风味，有效延长食品的货架期等特点备受关注，是一种非常有前景实现工业化应用的食品非热加工技术。目前人们就脉冲电场对微生物的杀菌效果方面已有了大量深入的研究，并证实脉冲电场对微生物的营养体细胞均有较好的杀灭作用，但对脉冲电场抗性较高的单增李斯特菌，芽孢的杀灭效果不十分理想。
[0003]研究表明脉冲电场对微生物的杀灭作用主要作用位点为微生物的细胞膜，广泛认可的机理为:由镶嵌蛋白质的磷脂双分子层构成的微生物细胞膜，它带有电荷，具有一定的通透性和机械强度。膜的内外表面间具有一定的电势差，当细胞膜上外加一个电场时，这个电场将使膜内外的电势差增大。由于细胞膜两表面堆积的异号电荷相互吸引，引起膜的挤压；当电场强度增大到一个临界值时，细胞膜的通透性剧增，壁上出现许多小孔，使膜的强度降低；电场强度进一步增大使细胞膜产生不可修复的大穿孔，使细胞组织破裂、崩溃，导致微生物失活，从而达到灭菌的效果。
[0004]单增李斯特菌是一种短小的革兰氏阳性无芽胞杆菌，具有强嗜冷性，其最适生长温度为37°C，但其生存环境可塑性大，能在2-42°C下生存、繁殖，是一种人畜共患病的致病菌，该菌在自然界中广泛存在，土壤是主要的贮主，各种野生和家养动物以及健康人群被认为是该菌的携带者，家庭环境和多种食品均可被污染，如果汁，牛奶，豆奶，液态蛋等液体食品。食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有危险，该菌在4°C的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。近年来，单增李斯特菌在法国、美国、加拿大等国曾多次引起食物中毒，轻者为一般胃肠炎症状，重症者主要表现为败血症、脑膜炎、神经症状及单核细胞增多等，临床死亡率高达20% -70%，因此引起了世界各国的高度关注。
[0005]已有研究表明，微生物细胞膜作为微生物与外界交流的屏障，保持稳定适宜的流动性，为微生物生长及与外界环境进行物质，能量的交换，对维持其正常功能是十分重要的。为适应特殊的生长环境冲击，如温度，渗透压，酸碱度等的极端变化，微生物通过调节细胞膜磷脂双分子层中脂肪酸链组成，如在低于正常生长温度的情况下，细胞膜磷脂脂肪酸链的不饱和脂肪酸，脂肪酸支链，短链脂肪酸的含量增加等，从而使细胞膜的流动性增加和相变温度降低以适应低温环境，维持细胞膜膜蛋白正常的生理功能及细胞膜可溶性物质正常的通透性。这种变化机制对环境的反应非常快，通常在几小时内完成。
[0006]单增李斯特菌作为一种嗜冷，强致病菌，其对环境的适应性强。特别是对低温的适应能力特别强。大量的研究表明单增李斯特菌对低温的适应能力来自于其对磷脂脂肪酸链饱和度，支链数目，脂肪酸链长度的迅速的调节。相比其它微生物如酵母菌，金黄色葡萄球等更能适应低温环境。Russell, Piiettman, Annous, Mastronicolis等人的研究表明，当单增李斯特菌在低于最适生长温度(37°C )7°C培养，其C15:0/C17:0比例显著增大，同时C18:1的比例增加。单增李斯特菌磷脂双分子层磷脂脂肪酸链变化及不饱和度增加使磷脂双分子层的相变温度降低，从而使细胞膜在低温下保持其正常生长所需的流动性。
[0007]中国发明专利CN1354018A公布了一种脉冲电场杀菌方法及其装置。中国发明专利CN1014854484A公布了一种高压脉冲电场对浓缩苹果汁进行灭菌的方法。该方法使用5-100kV/cm的脉冲电场强度，脉冲频率1-120HZ，脉冲数2-150个，能达到有效杀灭浓缩苹果浊汁的有害微生物，最大限度保持食品原有的风味效果。中国专利CN101297712A公布了一种液态物料低温电场杀菌的方法，该方法先将液态物料浓缩并降温到其温度介于零度和浓缩液的冻结点温度之间，再用脉冲电场杀菌处理。其利用在电导率受温度影响大，低温果汁的电导率小原理，从而利用高强度脉冲电场杀菌处理过程中产生的电流小，达到减小电场处理过程中温升对果汁品质的影响。
[0008]近年来，脉冲电场对液体食品杀菌灭酶效果，及食品品质的影响进行大量的研究，为脉冲电场杀菌技术工业化应用奠定了良好的基础，但现行研究仍处在实验室小规模的条件下，要实现工业化应用仍有很多的不足之处:
[0009](I)现行脉冲电场所用杀菌的场强高，高的脉冲电场强度对设备要求高，同时高的电场强度对脉冲电场设备中关键元件的损伤大，减低使用寿命，增加生产成本。
[0010](2)液体食品电解质含量高，从而电导率大，在高电场强度场强作用下，物料升温大，对液体食品的品质广生影响。
[0011](3)对脉冲电场抗性高的致病菌，单增李斯特菌、芽孢等杀灭效果不明显。
[0012](4)脉冲电场杀菌过程中产生的潜热没有综合利用。
【发明内容】
[0013]为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，能在较低的脉冲电场强度下达到有效杀灭单增李斯特菌的效果，更加高效，安全，节能。
[0014]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0015]一种低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，包括如下步骤:
[0016](I)取新鲜的液体样品；
[0017](2)先将液体样品进行程序降温贮藏:在13?17°C下贮藏I?此，然后将温度降至3?7°C|C藏I?2h ;
[0018](3)将液体样品升温至35?40°C，立即进行脉冲电场处理。
[0019]步骤(3)所述脉冲电场处理的参数为:
[0020]电场强度15?30kV/cm，脉冲数50?200个，频率为100Hz，脉宽为2?100 μ S。
[0021]步骤(3)所述将液体样品升温至35?40°C，具体为:
[0022]在I?2min内将所述液体样品通过热交换器升温至35?4(TC。
[0023]在需要多批次处理液体样品时，将经步骤(I)?(3)处理后的上一批次的液体样品和经步骤(I)?(2)处理后的下一批次的液体样品泵入热交换器，使下一批次的液体样品升温至35?40°C。
[0024]步骤(3)之后还包括以下步骤:
[0025](4)对脉冲处理后的液体样品进行无菌灌装保存。
[0026]本发明的利用单增李斯特菌嗜冷，在低温环境下能正常生长的特性，利用冷激的预处理增强脉冲电场对单增李斯特菌的杀灭效果。其技术原理为:单增李斯特菌为适应低温的贮藏条件，维持细胞膜正常的流动性。细胞膜磷脂的脂肪酸的结构发生相应的变化，不饱和脂肪酸、支链脂肪酸、短链脂肪酸的含量增加，从而使细胞膜流动性增加，相变温度降低。当单增李斯特菌在低于最适生长温度(37°C )7°C培养时，其C15:0/C17:0比例显著增大，同时C18:l的比例增加。单增李斯特菌磷脂双分子层磷脂脂肪酸链变化及不饱和度增加使磷脂双分子层的相变温度降低，从而使细胞膜在低温下保持其正常生长所需的流动性。大量研究表明微生物细胞膜磷脂双分子的相变温度比生长温度一般低2-5 °C。在37°C培养的单增李斯特菌其相变温度在32-35°C之间。本发明采用程序降温贮藏条件，使单增李斯特菌细胞膜磷脂脂肪酸链结构发生变化，从而相变温度进一步减低，其中程序的降温目的在于使其能更快的适应低温环境，避免迅速的降温对单增李斯特菌造成亚致死，而使其处于休眠状态。经过冷激处理，后续升温过程，使细胞膜的流动性对温度的变化更为敏感。在脉冲电场处理前，提高液体样品的温度，使处于凝胶相的细胞膜向液晶相转变，转变过程中，细胞膜磷脂双分子层变得疏松、厚度减小，流动性增加，疏水的脂肪酸链的无序度增加，细胞膜的粘弹性增加，机械强度降低。细胞膜的厚度变小，使得脉冲电场在细胞膜上的产生的跨膜电压相应增大，细胞膜的机械强度降低，粘弹性增加，使其更容易压缩。从而导致细胞膜穿孔的临界跨膜电压降低，使其在较低的脉冲电场强度下就能穿孔，使胞内物质泄漏，达到杀灭微生物的效果。
[0027]与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果:
[0028](I)本发明在进行脉冲电场之前，首选进行程序降温贮藏，先在13?17°C下贮藏l-2h，然后将温度降至3?7°C贮藏I?2h，再将液体样品升温至35?40°C进行脉冲电场处理，与普通的脉冲电场杀菌相比，能在较低的脉冲电场强度下达到有效杀灭单增李斯特菌的效果，从而减低对设备的要求，及杀菌过程中的能耗。
[0029](2)本发明在需要多批次处理液体样品时，综合利用了脉冲电场杀菌过程产生的热量，到达降低能耗的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为不同的处理条件下单增李斯特菌减少对数与脉冲数的关系图。。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0032]实施例1
[0033]新鲜的荔枝汁分成两份，一份不接种单增李斯特菌，另一份接种单增李斯特菌使其数量达到1.0X107Cfu/Cm;对两份新鲜的荔枝汁进行程序降温贮藏:先在15°C下贮藏lh，然后在5°C下贮藏lh。然后，将荔枝汁升温至40°C，整个升温过程在Imin内完成；立即进行脉冲电场处理，脉冲电场处理的电参数为:电场强度30kV/cm，脉冲数200个，频率为1000Hz，脉宽为2μ s ;经脉冲电场处理后的荔枝汁用蠕动泵入热交换器，另外将已经过程序降温贮藏但未经过脉冲电场处理的荔枝汁也泵入热交换器，使已经过程序降温贮藏但未经过脉冲电场处理的荔枝汁升温至40°C ;经脉冲电场处理后的荔枝汁在热交换后立即在无菌的条件下进行灌装；已经过程序降温贮藏但未经过脉冲电场处理的荔枝汁则进行后续的脉冲电场处理。采用热交换器对上一批次经脉冲电场处理的荔枝汁和下一批次的需要升温的荔枝汁进行热交换，综合利用了脉冲电场杀菌过程产生的热量，到达降低能耗的效果。
[0034]同时用平板计数法测定接种单增李斯特菌的荔枝汁的单增李斯特菌的数量，测定不接种单增李斯特菌的荔枝汁的菌落总数。
[0035]为说明本发明的方法的效果，本实施例将本发明的方法与以下方法的杀菌效果进行对比:1、处理条件:不加脉冲电场、不经程序降温贮藏过程、升温至40°C ;2、处理条件:脉冲电场强度30kV/cm、不经程序降温贮藏过程、在25°C下杀菌；3、处理条件:脉冲电场强度30kV/cm、经程序降温贮藏过程、升温至40°C杀菌。对比结果如图1所示。可知，与未经过程序降温贮藏预处理的脉冲电场杀菌方法相比，本实施例的经过程序降温贮藏预处理的脉冲电场杀菌方法对单增李斯特菌的杀灭效果增加约2个对数级，当脉冲处理数为200个时，由
6.06降至4.21 ;同时温度与脉冲电场的协同作用能有效增加李斯特菌杀灭效果，与室温处理相比(25°C )，协同处理温度为40°C时对李斯特菌杀灭效果增加约I个对数级，当脉冲处理数为200个时，由4.21降至3.07。
[0036]本实施例的未接种李斯特菌荔枝汁菌落总数测定结果:没有检出。
[0037]实施例2
[0038]新鲜的牛奶分成两份，一份不接种单增李斯特菌，另一份接种单增李斯特菌使其数量达到1.0X 107cfU/cm ;对两份牛奶进行程序降温贮藏:先在15°C下贮藏lh，然后在5°C下贮藏2h。然后，用热交换器将牛奶升温至35°C，整个热交换过程在Imin内完成，立即进行脉冲电场处理，脉冲电场处理的电参数为:电场强度25kV/cm，脉冲数100个，频率为1000Hz，脉宽为40μ S。经脉冲电场处理后的牛奶用蠕动泵入热交换器，另外将已经过程序降温贮藏但未经过脉冲电场处理的牛奶也泵入热交换器，使已经过程序降温贮藏但未经过脉冲电场处理的牛奶升温至35°C ;经脉冲电场处理后的牛奶在热交换后立即在无菌的条件下进行灌装；已经过程序降温贮藏但未经过脉冲电场处理的牛奶则进行后续的脉冲电场处理。
[0039]同时用平板计数法测定接种单增李斯特菌的牛奶的单增李斯特菌的数量，测定不接种单增李斯特菌的牛奶的菌落总数。与不经程序降温贮藏的脉冲电场杀菌方法相比，本实施例的经过程序降温贮藏的脉冲电场杀菌方法对单增李斯特菌的杀灭效果增加3个对数级。
[0040]本实施例的未接种李斯特菌牛奶菌落总数测定结果:没有检出。
[0041]实施例3
[0042]新鲜的蛋液分成两份，一份不接种单增李斯特菌，另一份接种单增李斯特菌使其数量达到1.0X 107cfU/cm ;对两份蛋液进行程序降温贮藏；先在15°C下贮藏2h，然后在5°C下贮藏2h。然后，用热交换器将牛奶升温至38°C，整个热交换过程在1.5min内完成，立即进行脉冲电场处理，脉冲电场处理的电参数为:电场强度15kV/cm，脉冲数50个，频率为1000Hz，脉宽为100 μ S。脉冲电场处理后的蛋液用蠕动泵入热交换器与处理前的蛋液进行热交换后，立即在无菌的条件下进行灌装。
[0043]同时用平板计数法测定接种单增李斯特菌的蛋液的单增李斯特菌的数量，测定不接种单增李斯特菌的蛋液的菌落总数。
[0044]不经程序降温贮藏的蛋液，脉冲电场处理后其单增李斯特菌数量减少至1.2X106Cfu/Cm，经过程序降温贮藏的蛋液，脉冲电场后其单增李斯特菌数量减少至
4.3X104cfu/cmo与不经程序降温贮藏的脉冲电场杀菌方法相比，本实施例的经程序降温贮藏的脉冲电场杀菌方法对单增李斯特菌的杀灭效果增加约3个对数级。
[0045]本实施例的未接种李斯特菌蛋液菌落总数测定:没有检出。
[0046]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取新鲜的液体样品； (2)先将液体样品进行程序降温贮藏:在13?17°C下贮藏I?2h，然后将温度降至3?7°C贮藏I?2h ; (3)将液体样品升温至35?40°C，立即进行脉冲电场处理。
2.根据权利要求1所述的低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，其特征在于，步骤(3)所述脉冲电场处理的参数为: 电场强度15?30kV/cm，脉冲数50?200个，频率为100Hz，脉宽为2?100 μ S。
3.根据权利要求1所述的低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，其特征在于，步骤(3)所述将液体样品升温至35?40°C，具体为: 在I?2min内将所述液体样品通过热交换器升温至35?40°C。
4.根据权利要求1所述的低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，其特征在于，在需要多批次处理液体样品时，将经步骤(I)?(3)处理后的上一批次的液体样品和经步骤(I)?(2)处理后的下一批次的液体样品泵入热交换器，使下一批次的液体样品升温至 35 ?40°C。
5.根据权利要求1所述的低温应激强化脉冲电场杀灭单增李斯特菌的方法，其特征在于，步骤(3)之后还包括以下步骤: (4)对脉冲处理后的液体样品进行无菌灌装保存。
【文档编号】A23L2/50GK104222715SQ201410421710
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】曾新安, 刘志伟, 韩忠, 王启军 申请人:华南理工大学