一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌及其应用。该兰黑紫色杆菌被命名为ZSJ，已于2014年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9465，经发酵培养即可产生紫色杆菌素。发酵培养基的溶质及浓度为：蛋白胨8.0～12.0g/L、牛肉粉2.0～4.0g/L、氯化钠4.0～6.0g/L、葡萄糖为0.5～1.5g/L；发酵培养基的PH为4～8；发酵培养的温度是7℃～30℃、时间为48h～240h。该菌株分泌生产的紫色杆菌素属纯天然色素，没有人工色素潜在的危害，有很好的广谱抗菌性、抗病毒性、抗肿瘤等生物活性，可广泛应用于医学、工业等各领域中。
CGMCC No.9465
2014.07.16
【专利说明】一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌及其 应用。
【背景技术】
[0002] 色素一般分为人工合成色素和天然色素。人工合成色素是指用化学合成方法所制 得的有机色素，主要是从煤焦油中提取或以苯、甲苯、萘、苯胺等芳烃类化合物为原料合成。 因性能优异、价格低廉、使用方便而占据色素市场的绝对优势。但由于其存在安全性问题， 各国使用合成色素的产品品种在逐渐减少。
[0003] 天然色素是利用自然界存在的物质或培养方法生产得到的次生代谢物质进行一 定加工而制成，具有无毒副作用、安全可靠、色调自然和大多具备一定的营养价值等优点， 其开发利用越来越受到各领域人们的广泛认可。目前天然色素主要以红、黄色调为主，兰紫 色素非常稀少，因此加快对兰紫色素的开发研究具有重要意义。天然色素的主要来源为：植 物、动物、微生物。利用微生物资源生产天然色素，克服以动植物为原料生产天然色素受季 节、气候、产地等诸多因素限制的缺点，并且易于工业化。因此采用微生物生产天然色素将 逐渐成为天然色素来源的主流。
[0004] 紫色杆菌素（Violacein，略写为Vio)是细菌合成的一种次级代谢产物，由两个色 氨酸分子氧化缩合而成，属于吲哚衍生物。自19世纪首次从紫色色杆菌中发现这一色素以 来，又有不同的产紫色杆菌素的微生物陆续被发现。人们对紫色杆菌素的生物活性进行了 大量的探索，目前很多实验已证明紫色杆菌素具有很强的生物活性：（1)抗原生动物活性； (2)光谱抗菌性；(3)抗病毒性；(4)抗肿瘤细胞；（5)其他功能，如能抗可见光辐射。另外 还可代替合成色素作染料，对天然原料和合成原料具有很好的着色效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌 (Janthinobacterium Iividum)〇
[0006] 上述所述的兰黑紫色杆菌被命名为ZSJ，已于2014年7月16日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9465。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种兰黑紫色杆菌在制备紫色杆菌素中的应用。
[0008] 本发明还有一个目的是提供一种生产紫色杆菌素的方法。
[0009] 上述所述的方法，包括如下步骤：首先将兰黑紫色杆菌进行发酵培养；再用有机 溶剂提取紫色杆菌素。
[0010] 上述方法中，所述的发酵培养基的溶质及其浓度为：蛋白胨8. 0?12. Og/L、牛肉 粉2. 0?4. Og/L、氯化钠4. 0?6. Og/L、葡萄糖为0? 5?I. 5g/L，溶剂为水。
[0011] 上述方法中，所述的发酵培养基具体为蛋白胨10. 〇g、牛肉粉3. 0g、氯化钠5. 0g、 葡萄糖I. 0g，使用蒸馈水定容至lOOOmL。
[0012] 上述方法中，所述发酵培养基的PH为4?8 ;具体为7。
[0013] 上述方法中，所述发酵培养时间为48h?240h ;具体为168h。
[0014] 上述方法中，所述发酵培养温度为7°C?30°C ;具体为21°C。
[0015] 上述方法中，所述提取紫色杆菌素的有机溶剂为无水甲醇或无水乙醇或无水异丙 醇或无水四氢呋喃；具体为无水甲醇。
[0016] 本发明最后一个目的是提供上述任一所述的方法在生产紫色杆菌素中的应用。
[0017] 本发明的兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum),保藏编号为CGMCC No. 9465。该兰黑紫色杆菌经发酵培养即可产生紫色杆菌素。该菌株分泌的紫色杆菌素属纯 天然色素，没有人工色素潜在的危害，有很好的广谱抗菌性、抗病毒性、抗肿瘤等生物活性， 可广泛应用于医学、工业等各领域中。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum)保藏号9465的分离培养基 上菌落图。
[0019] 图2为兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum)保藏号9465的液体培养基 静置培养图。
[0020] 图3为兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum)保藏号9465的液体培养基 摇床培养图。
[0021] 图4为兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum)保藏号9465在光学显微镜 下照片。
[0022] 图5为兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum)保藏号9465产生的色素酸 碱稳定性结果。图5A为紫色杆菌素在不同PH的甲醇溶液中的颜色变化；图5B为紫色杆菌 素在不同PH的甲醇溶液中置于自然光下照射36h后的颜色变化。
[0023] 图6为紫色杆菌素在不同溶剂中的溶解程度及颜色。
[0024] 图7为兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum)保藏号9465产生的色素的 主要成分HPLC分离图谱。I为紫色杆菌素；II为脱氧紫色杆菌素。
[0025] 图8为兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium Iividum)保藏号9465色素主要成分 (I )的核磁氢谱谱图。
[0026] 图9为紫色杆菌素粗产品图。
[0027] 图10为紫色杆菌素的分子结构图。
【具体实施方式】
[0028] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 实施例1、菌株的分离与鉴定
[0031] 一、分离
[0032] 1、样品采集
[0033] 从北京市昌平区小汤山火鸡老店采集关中羊奶，迅速冷藏，送回实验室进行实验。
[0034] 2、菌株的分离和筛选
[0035] 配制分离培养基：胰蛋白胨5. 0g、酵母浸膏2. 5g、葡萄糖I. 0g、脱脂奶粉I. 0g，使 用蒸馏水定容至1000ml，加入18. Og琼脂，80°C水浴溶解。准备干净平皿若干，用废旧报纸 包好。将培养基及平皿121°C灭菌15min。灭菌后，将培养基及平皿保温至50?60°C。
[0036] 将样品用生理盐水进行10倍梯度的稀释，取10-2、10-3、10-4梯度的样品液I. Oml 分别加入灭菌后的平皿中，再倒入20?25ml保温着的培养基，混匀、待凝。倒置平板于TC 培养箱，培养10天。
[0037] 培养后观察发现有兰紫色单菌落，挑取该菌落，进行划线分离。重复划线分离，直 至为单一纯菌株（如图1所示）。将上述获得的菌株命名为ZSJ。
[0038] 二、鉴定
[0039] 1、形态鉴定
[0040] 液体培养基：胰蛋白胨5. 0g、酵母浸膏2. 5g、葡萄糖I. 0g、脱脂奶粉I. 0g，使用蒸 馈水定容至1000ml，121°C灭菌15min。
[0041] 将菌株ZSJ接种于液体培养基，菌株于液体培养基静置培养（图2)，摇床培养如图 3所示。培养48h后，挑取单菌落，做革兰氏染色实验，在光学显微镜下观察见图4。
[0042] 结果表明：在分离培养基的平皿上，菌落呈深蓝紫色，圆形，表面光滑，边缘整齐； 显微镜观察该菌株呈短杆状，无芽孢、荚膜，无鞭毛，不运动，无孢子，革兰氏阳性。
[0043] 2、分子鉴定
[0044] 采用北京天根生化科技有限公司的TIANnamp Bacteria细菌基因组DNA提 取试剂盒提取本发明筛选的ZSJ菌株的基因组DNA。以获得的ZSJ菌株基因组DNA 为模板，采用下述引物PCR扩增菌株ZSJ的16s rDNA序列。引物序列如下：27f: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ;1492r :5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。
[0045] PCR反应条件：
【权利要求】
1. 一种高产紫色杆菌素的兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium lividum)，该菌株被命 名为ZSJ，已于2014年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No. 9465。
2. 权利要求1所述兰黑紫色杆菌（Janthinobacterium lividum)在制备紫色杆菌素中 的应用。
3. -种生产紫色杆菌素的方法，包括如下步骤：首先对权利要求1中所述兰黑紫色杆 菌进行发酵培养；再用有机溶剂提取紫色杆菌素。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中溶质及其浓度为：蛋白 胨8. 0?12. Og/L、牛肉粉2. 0?4. Og/L、氯化钠4. 0?6. Og/L、葡萄糖为0. 5?1. 5g/L， 溶剂为水；具体为蛋白胨10. 〇g、牛肉粉3. 0g、氯化钠5. 0g、葡萄糖1. 0g，使用蒸馈水定容至 lOOOmL。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的PH为4?8 ;具体 为7。
6. 根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养时间为48h?240h ; 具体为168h。
7. 根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养温度为7°C?30°C ; 具体为21°C。
8. 根据权利要求3-7任一所述的方法，其特征在于：所述提取紫色杆菌素的有机溶剂 为无水甲醇或无水乙醇或无水异丙醇或无水四氢呋喃；具体为无水甲醇。
9. 权利要求3-8任一所述的方法在生产紫色杆菌素中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104293703SQ201410487660
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】吕加平, 张书文, 刘鹭, 薛海晓, 逄晓阳, 芦晶 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所