专利名称：：一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌。
背景技术：
：<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物的代谢产物，它属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化縮合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，发现它具有很强生物功能，越来越受人们关注。研究证明，紫色杆菌素具有很强的生物活性(1)具有广谱的抗菌活性，如抗stsp7oy7ococcoiASswrew51、jaci7Jw51sp，streptococcyssp，/HycoZacferj'"/z，yVeisse".g，j09ei/flb/ff。;73s(Sanchezetal.，ReevaluationoftheViolaceinBiosyntheticPathwayanditsRelationshiptoIndolocaxbazoleBiosynthesis.Journal2006.7，1231-1240);(2)抗氧化(Konzenetal.，Antioxidantpropertiesofviolacein:possiblerelationonitsbiologicalfunction.Journal2006.14，8307-8313);(3)抗肿瘤细胞(deCarvalhoetal.，Cytotoxicactivityofviolaceininhumancoloncancercells.Journal2006.);(4)抗病毒性；(5)抗原生动等等，还可以作为染料加工各种材质布料(AkiraSHIRATA,IsolationofBacteriaProducingBluish—PurplePigmentandUseforDyeing.JapanAgriculturalResearchQuarterly.2000.34)，总之，紫色杆菌素具有很高的医学价值及工业应用前景。在己发现的产紫色杆菌素的菌株中，对紫色色杆菌(C.violaceum)的研究最为广泛。2003年，C.violaceum全基因组测序完成，为紫色杆菌素合成途径解析及应用提供了保证。但起初认为有4个相关基因控制整个紫色杆菌素的生物合成，直到最近，第5个基因才得以发现，整个代谢途径基本明朗化。紫色杆菌素的生物合成涉及一个基因簇，长约7.3kb，包括5个基因，分别是VioA、VioB、VioEVioC和VioD。脱氧紫色杆菌素是紫色杆菌素合成途径的副产物，产量很低，分离困难，因此对其性质及生物活性研究较少。目前急需一种便利的方法来生产脱氧紫色杆菌素，加强对脱氧紫色杆菌素的研究和应用。
发明内容本发明的目的是提供生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌。本发明所提供的生产脱氧紫色杆菌素的方法，是将脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的重组菌，该重组菌以色氨酸为底物发酵生产脱氧紫色杆菌素。其中，所述的脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇，是将由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE组成的紫色杆菌素合成基因簇中的VioD基因敲除，获得重组基因簇。其中，所述基因簇具体为如下l)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子；3)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子。所述步骤3)中的DNA分子，与l)的DNA分子最好有95X以上的同源性。上述严格条件可为在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在68。C下杂交,然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。本发明的另一个目的是提供一种产脱氧紫色杆菌素的重组大肠杆菌。本发明所提供的产脱氧紫色杆菌素的重组大肠杆菌，是将所述的基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的重组菌，命名为大肠杆菌BL-DV;大肠杆菌BL-DV已于2008年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2557。含有所述基因簇的表达盒和含有所述基因簇或所述表达盒的重组表达载体也属于本发明的保护范围。其中，所述重组表达载体具体可为在原核表达载体的多克隆位点插入所述的基因簇或含有所述基因簇的表达盒。大肠杆菌BL-DVCGMCCNo.2557具体可用如下方法构建将所述的重组表达载体导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得产脱氧紫色杆菌素的重组菌。本发明的大肠杆菌BL-DVCGMCCNo.2557能以L-色氨酸为底物发酵生产脱氧紫色杆菌素。所述L-色氨酸的浓度优选为0.3-0.5g/L;所述发酵温度为10-37。C。脱氧紫色杆菌素与紫色杆菌素均为蓝紫色，且产量很少，分离困难。用本发明的大肠杆菌BL-DVCGMCCNo.2557生产脱氧紫色杆菌素的产率较高，可以达到0.17g/L发酵液，且提取方便，分离纯化简单；并且，本发明的重组菌BL-DVCGMCCNo.2557是大肠杆菌，方便控制，便于工业化生产。图1为重叠延伸PCR重组脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇。图2为PCR扩增获得紫色杆菌素合成相关基因簇片段A、B和C的结果。图3为色素高效液相色谱结果图。具体实施例方式实施例l、产脱氧紫色杆菌素的重组菌BL-DV1)构建脱氧紫色杆菌素合成途径的相关酶的重组表达载体将杜擀氏菌属(Zfe卵77eWa印.)B2CGMCCNs2056转接入液体培养基(淀粉15g/L、硫酸亚铁0.03g/L、硝酸钾lg/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁0.5g/L、色氨酸0.5g/L，调节pH为7.0)，25°C，200rpm培养36小时，按上海生工基因组DNA提取试剂盒说明书提取杜擀氏B2菌基因组DNA。根据紫色杆菌素基因簇序列，采用01igo7.10软件设计3对引物，引物序列如表l，其中P1、P2扩增vioA及部分vioB基因部分序列，扩增产物命名为片段A;P3、P4扩增部分vioB及vioC基因，扩增产物命名为片段B;P5、P6扩增vioE基因，扩增产物命名为片段C;P4和P5两条引物之间有48bp的重复序列(图l)。表l.PCR引物设计<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>P45'-TGGCGTGCGGTGGCATGGCGTCTCCTTAGTTTACCCTTCCAAGTTTGTACC-3'—P55'-GGTACAAACTTGGAAGGGTAAACTAAGGAGACGCCATGCCACCGCACG-3'—P65'-GGAATGTCCTCGAGTTCCGACACGAAAACGCTGGC-3'I分别使用Pl和P2、P3和P4及P5和P6引物及高保真PfuDNA聚合酶对杜擀氏B2菌基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为50uL，DNA模板为0.5ug，上下游引物各25pmol，2.5UPfuDNA聚合酶。扩增片段A和B采用表2中的PCR程序I，扩增片段C采用表2中的PCR程序II。_表2.PCR扩增程序_PCR程序~~^~~循环次温度设定及时间骤数1194°C，3minI23094。C1min，57°C1min,72°C3min3172。c10min1194°c，3minII23094°c1min，68°C172°C1min3172°c10minIII1194°c，3min2294。c1min，50°C1min，72°C5min33094。c1min，50°C1min，72°C5min4172°c10minPCR扩增获得紫色杆菌素基因簇片段A、B和C的结果如图2所示。PCR产物片段B和C按1:1的体积比混合，然后稀释10倍，作为进一步PCR扩增的模板。PCR反应体系为50L，上述含有片段B、C的混合物1.5uL，2.5UTaKaRaPfuDNA聚合酶。PCR反应程序为PCR程序m，当运行完第2步时停止程序，向反应体系中加入P3、P6引物各25pmol后接着运行PCR程序III中的3、4步骤，将片段B和C连接在一起形成片段D。用PCR产物试剂盒纯化片段D，将片段D克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-D载体，领^序，测序结果表明片段D的核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第3058-6198位所示。用AeI和I双酶切片段A、yfetI和J力o/1双酶切pMD18-T-D载体及NdeI和XholI双酶切表达载体pET30a，回收3057bp的片段A、3140bp的片段D和pET30a载体酶切后的大片段，将上述回收的三个片段在T4DNA连接酶的作用下连接构建重组表达载体pET30aVioAD。将重组表达载体pET30aVioAD转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化产物涂于含氨苄青霉素(100txg/ml)的LB平板上，挑取转化子培养后采用碱裂解法提取质粒，筛选含插入片断的阳性克隆，进行测序，测序结果表明VioAD片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1自5'末端第1-1308位为VioA基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioA酶；自5'末端第1305-4322位为VioB基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioB酶；自5'末端第4323-5612位为VioC基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioC酶；自5'末端第5622-6197为VioE基因，编码紫色杆菌素合成途径中的VioE酶。VioAD片段中不含有紫色杆菌素基因簇中的VioD基因。该VioAD即为脱氧紫色干菌素合成相关基因簇。2)表达宿主的选择将重组载体pET30aVioAD分别转入￡BL21及Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得重组菌￡BL21-VioAD及ABL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioAD，以pET30a载体分别转入Acoh'BL21及￡colz'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得的重组菌￡BL21-pET30a和￡BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a为对照。在LB培养基中37。C培养菌体浓度0D600为0.7，加入0.lmMIPTG，20。C诱导30h。将50mL发酵液在7000Xg下离心10min,弃上清液，在沉淀物中加入无水乙醇5mL，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡0.5h，将振荡液9000Xg离心5min，保留乙醇溶液。在￡coh'BL21-pET30a和￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a中没有得到蓝色物质；在Ecoh'BL21-VioAD中也没有得到蓝色物质，而在Ecoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioAD中能合成蓝色素，表明重组表达载体pET30aVio△D在￡BL21中合成脱氧紫色杆菌素的4个酶没有完全正确表达或者某些酶表达量很低，而在Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中合成脱氧紫色杆菌素的4个酶正确表达，说明脱氧紫色杆菌素合成基因簇中可能含有稀有密码子，将产脱氧紫色杆菌素的Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioAD命名为大肠杆菌BL-DV;大肠杆菌BL-DV已于2008年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2557。3)重组菌BL-DVCGMCCNo.2557中合成的色素鉴定重组菌BL-DVCGMCCNo.2557的菌体经破碎乙醇提取后得到蓝紫色物质，将色素甲醇溶液进行高效液相色谱分析，使用Agilent-1100高效液相色谱仪，色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18，150mmX4mm，5um;柱温30°C;洗脱剂为体积比为70%的甲醇水溶液;流速l.OmL/min;检测波长570nm。高效液相色谱检测结果如图3所示，由重组菌BL-DVCGMCCNo.2557合成的色素与杜擀氏菌属B2紫色杆菌素副产物——脱氧紫色杆菌素保留时间一致(4.9rain)，并且只有一个峰值。上述实验结果表明，构建的载体pET30aVioAD在菌株￡co7i'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL成功表达合成脱氧紫色杆菌素相关的酶，并在体内催化合成脱氧紫色杆菌素。图3中，I:杜擀氏菌属(Duganellasp.)B2CGMCCNs2056所产色素高效液相色谱图，第一峰为紫色杆菌素，第二峰为脱氧紫色杆菌素；II:重组菌BL-DVCGMCCNo.2557所产色素粗提物色高效液相谱图。实例2、重组菌BL-DVCGMCCNo.2557生产脱氧紫色杆菌素对重组菌BL-DVCGMCCNo,2557以L-色氨酸、加入诱导剂时的细胞浓度(0D6。。值)、诱导剂的量、诱导时间4因素为试验因素，以脱氧紫色杆菌素产量为指标，对上述四因素进行4因子3水平的正交试验，其结果见表3。色素的提取同实施例l;色素浓度的测定是通过测定色素的乙醇溶液在最大吸收波长的吸光度值来衡量，DuganellaspB2所产脱氧紫色杆菌素测定波长为562rai，以无水乙醇作空白对照，通过吸光度值——色素浓度标准曲线得到相对应的色素浓度值，每个试验重复3次，取平均值，得到的吸光系数e为9.09551g—'cm—'。表3.正交试验设计及结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3结果表明，在这4因素中，影响脱氧紫色杆菌素产量的主次顺序为细胞浓度〉L-色氨酸〉诱导时间〉诱导剂的量，根据计算结果可知最佳组合应为在LB培养基中添加L-色氨酸0.4g/L，诱导剂的量l.Ommol/L，加诱导剂时的细胞浓度为0D600=0.8，20。C诱导30h。在上述最佳条件下，进行三批验证试验，脱氧紫色杆菌素产量分别为0.183g/L、0.165g/L和0.153g/L，平均为0.167g/L。0.0900.1190.1270.1110.1110.0980.0370.0210.1200.1230.1210.1370.0870.0680.0340.069123值值值差均均均极序列表<110>清华大学<120〉一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌<130>CGGNARW81479〈160〉1<210〉1<211〉6197〈212〉醒<213>杜擀氏菌属(A^朋eWa砂.)<400〉1atgacaaattattctgacatttgcatagttggcgcaggcat鄉gggcctcagttgtgcg60acccagttgatcaacgccgccgccggc卿aMttacggatcagggtgttcgdcatggeit120acgscggtgggcgggcgcatccagtcgcataaagtagacgcgccgaactc180ggcgccgcccgctactcgccgcaactccatccgcatttcgagcaactcatgcaggaMgc240gggctggcgcatgcgacctaccctttcacccaggtggtgtcgctcgatcaggcgc鄉邓300肌actg3aggcaactctgctg3gCCtg3g"tgcgatgctgaaaaaacatccga已cg3ttcc360ttccttgaattcgtcagccagt織tgggcgccgccg肌gcgacccgcatgatc卿gcg420accggttacgacgccttgctgctgccggtggtctcggcagcgatggcctacgacatcatc480a^sagcacccggaaacacaaagctttaccgaaaacgccgccaacgagtggcgctatgcc540sccgacggctacagcgagctgctgcgtxagttgcagcgccsggcccaggacgccggcgtg600gaattccggctggggC3tCgcttgctgtcggttga肌agtccggc已ccgaccatgtcctc660gccttccgccatatgggcgatactcagatgcaccgggcgcgccatgtgatcacgaccctc720ccgccgaccgccatgaagcgcctgaacatggattttccggccgccttcagtcccttccag780tacgattxcctgcctttgttcaaaggattcctgaccttcgsaacagcctggtgggacgcg840ctcgggctgaccgacaaagtgctgatggccgataatcctcttcggaa肌tctacttcaag900ggcgacaaatacctggtgttctacaccgacagcgccagcgccacctattggcgggagtac960ctggagc卿ggga卿cgtttacctggaccgggtccgccatcacctgaa1020ccgctgaacggtcagccgctgccgcagatcaaggcgcatttttacaagcactggccgcat1080ggcgtcgagttcagcctgg已gccgg卿ccgagcatccagcaaccctgctccaccgcgac1140ggc已txatctcctgctcggacgcgtatacctcgcattgcggctgg已tggaaggcagcttg1200atcagcgccgggcacgctacccgcctgttgctggaacggctcagccatccgccagcaca31260tccgggcacgactttaccctcgccacctctcttactgagcgcgcatgagcattctcgact1320ttccccgctttcattttcgggggtttgcccgcgctaatgtgcccactgccaaccgcaata1380cgcacggccatatcgatatcgcgacgaatgcggtatcgatcgcgggcgaaccattcgacc1M0tgagccgcccgccgtcggaattccatgagcacatgaaacagcttgctcccaggttcgatg1500cggcgggcaagccggatccggagggcatcttcagcgaggcggccggctacaatttttgcg1560gcaacaatcacttttcgtgggaaaacgccaggatcaccggcgtccagctgcgcgatggcg1620aggtcgataccgaggacgcgctggtcggcgccaagctggccctgtggggacattacaacg1680actatctgcgcaccacggtcaax:cgcgccagatgggtcgacaacaaccccgccgagccgg1740acaccaccctcatttacgcgggccagttcacgctcagcggcaagcaagccacgcccaaca1800caccgagcctgttcagcgccgatatcgggcaggcgcattcggtacgctgggtcggcagcg1860gccatatcagcgagcgcagcgggcattttctcgacgatgaattcggccgttccaggctgt1920tccagttttccgtggcgaagctcgatccgcatttcctcttcaatccggacacaccgctgc1980cggccagcatgcgcgccttgcaagaggcgcttgccgacgaggatgtgctggggctgacgg2040tccagtatgcgctgttcaatatgtcgacgccgcaga^acccgattcgccggtgttctacg2100acctggccggcggcatcggcctgtggcgccgcgacgagctggccacctatccggccggcc2160gtttgctgctgccgcgccagagcagcctggggccggtactggtgaaggtgcatgcggacc2220gggtgtcggtgaatatgccgacggccatcccgttcaccacgcgcgaggccggcgccgtgt2280ccgaacagcatcctacccatgcgctgggcggcaagcttgcgctgggcgatctcatgctgc2340acggtgccaccggcaagctgatcgcccgcatcccgcaacagctgtacctcgactactggc2400gccatcatggtgtcttcgatgtgccgctgctccacccggccacggcctcgggt"tcgctca2460gcatgt:ccagcgcgcaggcgcagtgggacgaagccgactgggtgctgcagtccgacagca2520accatctgtatctggaagcgcccaaccggcaacgacagcaggactttccgcagacgatca2580cggtacaaagccgcttgcgcggcgagctggcggcgcatccggcgctgacggcgcaggcgc2640aggatggcgagatcgtcggcgtgcgcgtggcgccatcggcgctgggagttggctatgcgg2700acctgaccctcacgggccgccgttcaggcgcgacccgcatcatgctgggcgaggcacagg2760ggcagcagttcatcggcgcgagggtgctgcccgacgactggcatctggacgacataccgg2820ccgaacaggtcgattacgcctttctctaccagcacgtgatgagctactacgagctggtct2880atcccttcatgtcggacaaggtgttcagcctggcggaccactgcaagtgcgaaacctatt2940cgcgcctgatgtggcagatgtgcgatccgcagaaccgggacaagagctattacatgccga3000gcacgcgtgaactgtcgctgccgaaatcgcgcctgttcctgaaatacctgacccaggtcg3060aagcggccgccaagtccacgcttcctcaagcggtcgcaccgcatgtcatcggctgcaagg3120ccgagtggatcgccgagctgaaaaaggcgatcgacctggaactgtcgctcatgctgcagt3180acctgtacgccgcgtatgccattcccaactatgcgcagggagtgaaactggtcgaggccg3240gccgctggctgccggacgagctggagctggcctgcggcaccgaggaccggcgccgcaaca3300gcggagcgcgtggcgccctgctcgaaatcgcccatgaagaaatgattcactacctgatgg3360tcaacaatgtgctgatggcgctcggcgagccgttxtacgccggcgccccggcgctgggag3420aacaggcgcgccagcgcttcggcctggacacggaatttgccttcgacccttt"ttccgagc3480<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>aagacgacgaggtcacttccggctattgctggttcgactatgcccgcgacatttgccgca5760tcgacggcctgttcaatccctggtcggaaaaggagacgggacaccggctctggatgtcgg5820aaatcggcgacgccaggcgcggacaaagccgcaaacagaaagtcgcttatgccagggagg5880cggagccggccggcgtgaagctgtacgagcgggcgctggccgatgaggtcacgcccttcc5940acgagctgttcctgccgcaggcgatcctgatcgacggcgaagcgcgtcatgacggccgcc6000acacggtgctgggccaggcggccgacgcctgggtggtggagcggccgggcaaagccgcct6060cggtgttctatctccaggccggcggcaatcacttgctgcgcatggtcaccggcaacgacg6120cgcagcatcagtcggtacgcgactttccgaacttccttgccggcgacatcgcggccagcg6180ttttcgtgtcggaataa619权利要求1、一种脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇，是将由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE组成的紫色杆菌素合成基因簇中的VioD基因敲除，获得重组基因簇。2、根据权利要求1所述的基因簇，其特征在于所述基因簇为如下l)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子；3)与l)的基因具有90%以上的同源性，且编码紫色杆菌素合成途径中的VioA、VioB、VioC和VioE四种酶的DNA分子。3、一种重组大肠杆菌，是将权利要求1或2所述的基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的产脱氧紫色杆菌素的重组菌。4、根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL-DVCGMCCNo.2557。5、含有权利要求1或2所述基因簇的表达盒。6、含有权利要求1或2所述基因簇或权利要求5所述的表达盒的重组表达载体。7、根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在原核表达载体的多克隆位点插入权利要求1或2所述的基因簇或者权利要求5所述的表达盒。8、构建权利要求3或4所述重组大肠杆菌的方法，是将权利要求6或7所述的重组表达载体导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得产脱氧紫色杆菌素的重组菌。9、一种生产脱氧紫色杆菌素的方法，是以L-色氨酸为底物利用权利要求3或4所述的重组菌发酵生产脱氧紫色杆菌素。10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述L-色氨酸的浓度为0.3-0.5g/L;所述发酵温度为10-37°C。全文摘要本发明公开了一种生产脱氧紫色杆菌素的方法及其专用重组菌。该方法是将脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的重组菌，该重组菌以色氨酸为底物发酵生产脱氧紫色杆菌素。其中，脱氧紫色杆菌素合成相关基因簇，是将由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE组成的紫色杆菌素合成基因簇中的VioD基因敲除，获得重组基因簇。所述重组菌是将所述的基因簇导入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中获得的产脱氧紫色杆菌素的重组菌。本发明生产脱氧紫色杆菌素的方法产率较高，可以达到0.17g/L发酵液，且提取方便，分离纯化简单。文档编号C12P17/16GK101319219SQ20081011660公开日2008年12月10日申请日期2008年7月11日优先权日2008年7月11日发明者姜瑞波,恺娄,翀张,王海胜,蒋培霞,赵洪新,邢新会,东魏申请人:清华大学