专利名称：一种制备紫色杆菌素的方法及其专用菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备紫色杆菌素的方法及其专用菌。
背景技术：
I/-NHI /-NH
OO紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物自身产生的一种次级代谢产物，属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化缩合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，因其具有广谱抗菌性，抗原生动物活性，抗病毒性，抗肿瘤细胞活性以及独特的蓝紫色着色能力等功能特性和在医药、卫生、食品、印染等领域潜在的应用前景而受到越来越多的关注。甲基扭曲杆菌是一类能够利用甲醇等一碳化合物作为唯一碳源和能源的微生物，它们在自然界分布广泛。研究表明，甲基扭曲杆菌能够直接利用一碳化合物，将其转化成自身代谢的一碳单位，并为生物体提供能源和碳骨架，这作为一种新的代谢模式对于研究其工业应用具有重要意义。同时通过流加培养的方式，已经能够实现甲基扭曲杆菌高密度的连续培养，这也为进一步利用甲基扭曲杆菌独特的代谢途径实现高附加值产品的生产提供了广泛的前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组甲基扭曲杆菌。本发明所提供的重组甲基扭曲杆菌，是将紫色杆菌素生物合成相关基因簇导入宿主甲基扭曲杆菌中得到的。上述重组甲基扭曲杆菌中，所述紫色杆菌素生物合成相关基因簇是通过载体pCMllO导入的。上述任一所述重组甲基扭曲杆菌中，所述宿主甲基扭曲杆菌为甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens),具体为甲基扭曲杆菌(Methylobacteriumextorquens)AMl ATCC 14718。上述任一所述重组甲基扭曲杆菌中，所述紫色杆菌素生物合成相关基因簇为核苷酸序列如序列表中序列I所示的DNA分子。 其保藏号为CGMCC No. 4704的重组甲基扭曲杆菌也属于本发明的保护范围，该菌株的分类命名为甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens),菌株名称为AMl-pCM110vio。本发明的另一个目的是提供一种制备紫色杆菌素的方法。本发明所提供的制备紫色杆菌素的方法，包括如下步骤发酵培养上述任一所述重组甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens),得到紫色杆菌素。上述过程中，所述发酵培养中，所用的发酵培养基由Na2HPO4 · 12H20、(NH4)2SO4,K2HPO4 · 3H20, MgSO4 ·7Η20、CaCl2 · H2O、Na2MoO4'ZnSO4 · 7H20、H3BO3'MnSO4 · H2O, CoCl2 · 6Η20、FeSO4 · 7Η20、CuSO4 · 5Η20、甲醇、色氨酸、四环素和水组成；其中，Na2HPO4 · 12Η20在发酵培养基中的浓度为3. 5-4. 5g/L，(NH4)2SO4在发酵培养基中的浓度为O. 5-1.0g/L，K2HPO4 · 3H20在发酵培养基中的浓度为1.3-2. 5g/L， MgSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为O. 2-1. 2g/L，CaCl2 · H2O在发酵培养基中的浓度为l-5mg/L, Na2MoO4在发酵培养基中的浓度为30_50ug/L，ZnSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为100-150ug/L，H3BO3在发酵培养基中的浓度为10-40 μ g/L，MnSO4 · H2O在发酵培养基中的浓度为60-120 μ g/L, CoCl2 · 6H20在发酵培养基中的浓度为20-50 μ g/L, FeSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为O. 6-1. 5mg/L, CuSO4 · 5H20在发酵培养基中的浓度为20_50ug/L，甲醇在发酵培养基中的浓度为O. 5 % -2 % (体积百分含量)，色氨酸在发酵培养基中的浓度为O. 2g/L-0. 7g/L,四环素在发酵培养基中的浓度为8 μ g/ml-12 μ g/ml ；优选的，所述Na2HPO4 · 12H20在发酵培养基中的浓度为4. 02g/L，所述(NH4)2SO4在发酵培养基中的浓度为I. Og/L，所述K2HPO4 · 3H20在发酵培养基中的浓度为I. 3g/L，所述MgSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为O. 45g/L，所述CaCl2 · H2O在发酵培养基中的浓度为
3.3mg/L,所述Na2MoO4在发酵培养基中的浓度为40 μ g/L,所述ZnSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为130 μ g/L,所述H3BO3在发酵培养基中的浓度为30 μ g/L,所述MnSO4 · H2O在发酵培养基中的浓度为ΙΟΟμ g/L，所述CoCl2 · 6H20在发酵培养基中的浓度为40μ g/L，所述FeSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为I. 3mg/L,所述CuSO4 · 5H20在发酵培养基中的浓度为40 μ g/L,甲醇在发酵培养基中的浓度为1% (体积百分含量)，所述色氨酸在发酵培养基中的浓度为O. 5g/L，所述四环素在发酵培养基中的浓度为10 μ g/ml。上述发酵培养基中，L-色氨酸作为合成紫色杆菌素的底物，紫色杆菌素合成酶系可以通过两分子L-色氨酸缩合生成一分子紫色杆菌素。上述过程中，所述发酵培养包括如下步骤将所述重组甲基扭曲杆菌接种于所述发酵培养基，先在30°C条件下培养至发酵体系的0D_值为O. 6-1. 2，再将发酵体系在20°C发酵30-50h，具体为40h ;所述发酵体系为发酵容器内的所有物质；所述OD6tltl值具体为O. 8。30°C是甲基扭曲杆菌的最适生长温度，而紫色杆菌素合成酶系的催化最适温度为20°C，所以在发酵的过程中，先在30°C让甲基扭曲杆菌生长起来，并表达一定量的紫色杆菌素合成酶，然后再转至低温20°C，以便进一步的实现紫色杆菌素的合成。上述过程中，在所述发酵培养后，包括如下提取的步骤将所述发酵体系离心，收集菌体；将所述菌体与有机溶剂混合，破碎菌体，离心，收集上清液，即为紫色杆菌素的提取液；所述有机溶剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯。上述过程中，在所述提取后，包括将所述紫色杆菌素的提取液进行高效液相色谱分离的步骤；所述高效液相色谱分离中，所用的色谱柱为Agilent ZORBAX EclipseXDB-C18液相色谱柱，流动相为甲醇和水的混合溶液，混合溶液中甲醇和水的体积比为7 3，流动相的流速为I. Oml/min，收集保留时间为3. Omin的洗脱峰，即为紫色杆菌素。本发明的制备紫色杆菌素的方法成本低廉，一方面发酵生产所使用的培养基成分简单、价格低廉，另一方面使用本发明方法实现以甲醇作为碳源，发酵生产得到紫色杆菌素。甲醇作为一种能够通过石油、煤或者生物可再生资源实现工业化生产的工业产品，价格低廉，因此使用本发明方法可以为紫色杆菌素的生产提供新的途径；本发明方法操作简单，产率高，可达O. 15g/l发酵液。本发明的重组菌产紫色杆菌素的效果好。因此，本发明重组菌及紫色杆菌素的制备方法具有广阔的应用前景。
图I为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图2 为液质联用 Methylobacterium extorquens AMl-pCM110vio 产紫色杆菌素和 脱氧紫色杆菌素质谱结果。图3为核磁谱图结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、重组菌的制备载体pCMllO 在文献(Marx, C. J. , and Μ. E. Lidstrom. 2001. Developmentofimproved versatile broad—host—range vectors for use in me thylotrophs andotherGram-negative bacteria. Microbiology-Sgm 147 :2065-2075.)中公开过，公众可从清华大学获得；杜擀氏菌B2CGMCC No. 2056(中国专利号 ZL200710120074. 9)；甲基扭曲杆菌Methylobacterium extorquens AMl ATCC 14718,购自美国模式培养物集存库(American type culture collection, ATCC)；I)紫色杆菌素合成相关基因簇的克隆将杜擀氏菌属(Duganella sp. )B2CGMCC No. 2056转接入液体培养基(淀粉15g/L、硫酸亚铁O. 03g/L、硝酸钾lg/L、磷酸氢二钾O. 7g/L、硫酸镁O. 5g/L、色氨酸O. 5g/L, pH为7. O)，25°C，200rpm培养36小时，按上海生工基因组DNA提取试剂盒说明书提取杜擀氏菌 B2CGMCC No. 2056 基因组 DNA。以杜擀氏菌B2CGMCC No. 2056基因组DNA为模板，利用高保真Pyrobest DNA聚合酶PCR扩增vio-U片段和vio-L片段，扩增vio-U片段所用引物为Vio-U_280U37和Vio-U-3377L26 ;扩增 vio_L 片段所用弓丨物为 Vio-L_3026U27 和 Vio-L_7289L32，PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图I所示，图I中，“M”代表分子量标准，“U”代表vio-U片段，“L”代表vio-L片段。PCR产物经PCR纯化试剂盒回收。表I.引物序列Vio-U-280U375’ - ACTGGAGCTCCGCACCTTGGTTACCGGTTCTTGATTA-3’
Vio-U-3377L265’- CGTGGACTTGGCGGCCGCTTCGACCT-3’
Vio-L-3026U275’- ATCGCGCCTGTTCCTGAMTACCTGAC -3’
Vio-L-7289L325’ - ATATGGTACCTTATTCCGACACGAAAACGCTG-3’Sac I和NotI双酶切vio_U片段，NotI和KpnI双酶切vio_L片段，双酶切后的片段用回收试剂盒回收。用Sac I和Kpn I双酶切pCMllO，与酶切后的vio_U和vio_L在16°C过夜连接，连接产物用热激法转化入E. coli DH5a中，转化产物涂于含四环素抗性(12.5yg ml—1)的LB平板上，挑取转化子培养后采用碱裂解法提取质粒，筛选含插入片段的阳性克隆，插入片段经双向测序验证，结果插入的基因序列如序列表中序列1，表明插入的基因序列及方向均正确(vio-U片段为自序列I的5'末端其第1-3123位核苷酸，vio_L为自序列I的5'末端其第3069-7358位核苷酸)，阳性克隆所含的阳性重组表达载体命名 pCMllOvio。2)构建重组菌将重组表达载体pCMllOvio通过电击转化转入Methylobacterium extorquensAMl菌株中，转化产物涂于含四环素抗性(10 μ g πιΓ1)的CHOI平板上，挑取转化子单克隆，接种于含四环素抗性(IOyg ml—1)的CHOI液体培养基中培养，采用碱裂解法提取质粒，分别利用表I中引物对进行PCR扩增和NotI、KpnI和SacI对质粒酶切的方法进行筛选验证，再进行测序验证，测得的序列如序列表中序列I所示，表明转入的重组质粒正确、重组菌中含有正确的重组质粒pCMllOvio,将含有重组表达载体pCMllOvio的Methylobacteriumextorquens AMl 菌株，记作甲基扭曲杆菌(Methylobacteriumextorquens) AMl-pCMl IOvio。同时将pCMl 10转入Methylobacterium extorquens AMl中，得到的重组菌记作Methylobacterium extorquens AMl-pCMllO,作为对照。将菌株甲基扭曲杆菌(Methylobacteriumextorquens) AMl-pCMl IOvio 于 2011 年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 4704,分类命名为甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)。含四环素抗性(10 μ g ml-1)的CHOI液体培养基的组成=Na2HPO4 · 12H20 4. 02g/L, (NH4)2SO4L Og/L, K2HPO4 · 3H20 I. 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 45g/L, CaCl2 · H2O 3. 3mg/L,Na2Mo0440 μ g/L, ZnSO4 · 7H20 130 μ g/L, H3B0330 μ g/L, MnSO4 · H2O 100 μ g/L, CoCl2 · 6H2040 μ g/L, FeSO4 · 7H20 I. 3mg/L，CuSO4 · 5H20 40 μ g/L,甲醇 1% (v/v)，抗生素四环素 10 μ gml、含四环素抗性(10μ g πιΓ1)的 CHOI 平板的组成=Na2HPO4 · 12H20 4. 02g/L, (NH4)2SO4L Og/L, K2HPO4 · 3H20 I. 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 45g/L, CaCl2 · H2O 3. 3mg/L, Na2Mo0440 μ g/L, ZnSO4 · 7H20 130 μ g/L, H3B0330 μ g/L, MnSO4 · H2O 100 μ g/L,CoCl2 ·6Η2040 μ g/L，FeSO4 ·7Η20 I. 3mg/L，CuSO4 ·5Η20 40yg/L，甲醇 1% (v/v)，琼脂 15g/L0实施例2、制备紫色杆菌素一、发酵菌
种子培养基为含四环素抗生素的CHOI液体培养基，组成为Na2HPO4 · 12H204. 02g/L, (NH4)2SO4L Og/L, K2HPO4 · 3H20 I. 3g/L, MgSO4 · 7H20 0. 45g/L, CaCl2 · H203. 3mg/L,Na2Mo0440 μ g/L, ZnSO4 · 7H20 130 μ g/L, H3B0330 μ g/L, MnSO4 · H2O 100 μ g/L, CoCl2 · 6H2040 μ g/L, FeSO4 · 7H20 I. 3mg/L，CuSO4 · 5H20 40 μ g/L,甲醇 1% (v/v)，抗生素四环素 10 μ gml、发酵培养基所用的发酵培养基由Na2HPO4 · 12H20、(NH4) 2S04、K2HPO4 · 3H20、MgSO4 · 7H20、CaCl2 · H2O、Na2MoO4'ZnSO4 · 7H20、H3BO3、MnSO4 · H20、CoCl2 · 6H20、FeSO4 · 7H20、CuSO4 · 5H20、甲醇、L-色氨酸、四环素和水组成；Na2HPO4 · 12H20在发酵培养基中的浓度为4. 02g/L, (NH4) 2S04在发酵培养基中的浓度为I. Og/L, K2HPO4 · 3H20在发酵培养基中的浓度为I. 3g/L，MgSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为O. 45g/L，CaCl2 · H2O在发酵培养基中的浓度为3. 3mg/L, Na2MoO4在发酵培养基中的浓度为40 μ g/L, ZnSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为130 μ g/L, H3BO3在发酵培养基中的浓度为30 μ g/L, MnSO4 · H2O在发酵培养基中的浓度为100 μ g/L, CoCl2 · 6H20在发酵培 养基中的浓度为40 μ g/L, FeSO4 · 7H20在发酵培养基中的浓度为I. 3mg/L, CuSO4 · 5H20在发酵培养基中的浓度为40 μ g/L，甲醇在发酵培养基中的浓度为1% (v/v)，色氨酸在发酵培养基中的浓度为O. 5g/L，抗生素四环素在发酵培养基中的浓度为IOyg πιΓ1.种子培养实验组将Methylobacterium extorquens AMl-pCMlIOvio 的单菌落接种至5mL种子培养基，3(TC，200rpm振荡培养10_48h，得到种子培养液。对照组将Methylobacterium extorquens AMl-pCM110 单菌落分别接种至 5mL 种子培养基，30 °C,200rpm振荡培养10_48h，得到种子培养液。发酵培养按lml/lOOml的接种量，将实验组种子培养液和对照组种子培养液分别接种至发酵培养基中，30°C培养至发酵物的0D_为O. 8时，转为20°C培养40h，收集容器内的所有物质，将容器内的所有物质记作发酵物。二、提取取5ml实验一得到的发酵物，离心，收集菌体，菌体中加入无水乙醇5mL，用漩涡混合器将其混匀，然后在200W超声波清洗器中振荡0. 5h，将振荡液9000 X g离心5min，收集上清液，即为紫色杆菌素的粗提液。结果，实验组(重组菌Methylobacterium extorquens AMl-pCM110vio)得到的上清液中含有蓝紫色物质，对照组(重组菌Methylobacterium extorquensAMl-pCMl 10)得到的上清液中不含有蓝紫色物质。分别将两组的上清液减压蒸馏至干燥，得到固形物质。三、高效液相色谱分离纯化和结构确认I.紫色杆菌素的分离纯化将实验二中实验组和对照组的固形物质分别溶于甲醇中，进行高效液相色谱分析。Agilent 1100型液相色谱仪；色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 液相色谱柱(150mmX 4mm, 5 μ m),孔径5um ;柱温30 °C ；自动进样器进样，进样量200ul ;流动相的组成为流动相为甲醇和水的混合溶液，甲醇和水的体积比为7 3;流速为 I. Oml/min ；检测器为Sro-IOA (V)紫外检测器，检测波长570nm ；在如上色谱条件下，紫色杆菌素标准品的保留时间为3. Omin ;脱氧紫色杆菌素标准品的保留时间为4. 9min，收集保留时间为3. Omin的洗脱峰。2.液相色谱-质谱联用由液相色谱分离出来的色素成分，通过液质联用再分离纯化，(质谱仪为=LCQDecaXP(美国热电公司)；质谱条件为离子源ESU源；壳气35arb ;辅助气0arb ;喷雾电压3，5kV ;毛细管温度300°C ;流速lmL/min ;分流比9 I ;质谱速度0. lmL/min。二次质谱碎裂能量(1)35% (2)38% )，结果如图2 (A脱氧紫色杆菌素ESI-MS图谱，B紫色杆菌素ESI-MS图谱)。表明色素的主要成分的为分子量分别为344. 2和327. 2。3、核磁共振由高效液相色谱分离出的保留时间为3min的主要成分按照下述文献(T.Hoshino, T. Kondo, T. Uchiyama, N. Ogasawara, Biosynthesis of violacein anove!rearrangement in tryptophan metabolism with a I,2-shift of the indole,Agric. Biol. Chem. 51 1987)965-968.)中描述的方法进行核磁共振分析，用JNMECA-600 (JE0L公司)核磁共振波谱仪，磁场强度为14. 096T/H共振频率为600. 17MHz，溶剂为DMS0，在室温下进行数据采集。90度脉冲宽度为11. 3us，采样点数为16384，扫描次数为16次，氘代试剂为d-DMS0，得到了如图3所示的核磁谱图结果。谱图3比较清晰的给出了色素主要成分各位置的H(式(II))的化学位移，通过与文献中紫色杆菌素的化学位移值比对(表2)，得到相应的结构信息。表2、甲基扭曲杆菌产色素主成分核磁氢谱化学位移值与文献数据的比对
权利要求
1.一种重组甲基扭曲杆菌，是将紫色杆菌素生物合成相关基因簇导入宿主甲基扭曲杆菌中得到的。
2.根据权利要求I所述的重组甲基扭曲杆菌，其特征在于所述紫色杆菌素生物合成相关基因簇是通过载体PCMl 10导入的。
3.根据权利要求I或2所述的重组甲基扭曲杆菌，其特征在于所述宿主甲基扭曲杆菌为甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens),具体为甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)AMl ATCC 14718。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组甲基扭曲杆菌，其特征在于所述紫色杆菌素生物合成相关基因簇为核苷酸序列如序列表中序列I所示的DNA分子。
5.一种重组甲基扭曲杆菌，其保藏号为CGMCC No. 4704，其分类命名为甲基扭曲杆菌(Methylobacterium extorquens)。
6.一种制备紫色杆菌素的方法，包括如下步骤发酵培养权利要求1-5中任一所述重组甲基扭曲杆菌，得到紫色杆菌素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养中，所用的发酵培养基由Na2HPO4 12H20、(NH4)2SO4' K2HPO4 3H20、MgSO4 7H20、CaCl2 H2O, Na2MoO4' ZnSO4 7H20、H3BO3'MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、FeSO4 7H20、CuSO4 5H20、甲醇、色氨酸、四环素和水组成； Na2HPO4 12H20在发酵培养基中的浓度为3. 5-4. 5g/L，(NH4)2SO4在发酵培养基中的浓度为0. 5-1. Og/L, K2HPO4 3H20在发酵培养基中的浓度为I. 3-2. 5g/L，MgSO4 7H20在发酵培养基中的浓度为0. 2-1. 2g/L，CaCl2 *H20在发酵培养基中的浓度为l_5mg/L，Na2MoO4在发酵培养基中的浓度为30-50ug/L，ZnSO4 7H20在发酵培养基中的浓度为100_150ug/L，H3BO3在发酵培养基中的浓度为10-40 u g/L，MnSO4-H2O在发酵培养基中的浓度为60-120 u g/L，CoCl2 6H20在发酵培养基中的浓度为20-50ii g/L，FeSO4 7H20在发酵培养基中的浓度为0.6-1. 5mg/L, CuSO4 5H20在发酵培养基中的浓度为20_50ug/L，甲醇在发酵培养基中的浓度为0. 5% -2% (体积百分含量)，色氨酸在发酵培养基中的浓度为0. 2g/L-0. 7g/L，四环素在发酵培养基中的浓度为8 V- g/ml-12 V- g/mlo
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述发酵培养包括如下步骤将所述重组甲基扭曲杆菌接种于所述发酵培养基，先在30°C条件下培养至发酵体系的0D_值为0.6-1. 2，再将发酵体系在20°C发酵30-50h，具体为40h ;所述发酵体系为发酵容器内的所有物质；所述0D_值具体为0. 8。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述发酵培养后，包括如下提取的步骤将所述发酵体系离心，收集菌体；将所述菌体与有机溶剂混合，破碎菌体，离心，收集上清液，即为紫色杆菌素的提取液； 所述有机溶剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯。
10.根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述提取后，包括将所述紫色杆菌素的提取液进行高效液相色谱分离的步骤；所述高效液相色谱分离中，所用的色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C 18液相色谱柱，流动相为甲醇和水的混合溶液，混合溶液中甲醇和水的体积比为7 3，流动相的流速为l.Oml/min，收集保留时间为3. Omin的洗脱峰，即为紫色杆菌素。
全文摘要
本发明公开了一种制备紫色杆菌素的方法及其专用菌。该重组甲基扭曲杆菌，是将紫色杆菌素生物合成相关基因簇导入宿主甲基扭曲杆菌中得到的。本发明的制备紫色杆菌素的方法成本低廉，一方面发酵使用的培养基成分简单、成本低廉，另一方面本发明方法只需以甲醇作为碳源，就可以发酵得到紫色杆菌素，甲醇是能够通过石油或者生物可再生资源合成的，价格低廉，本发明方法实现了用廉价可再生资源工业化生产紫色杆菌素；本发明方法操作简单，产率高，可达0.15g/l发酵液。本发明的重组菌产紫色杆菌素的效果好。因此，本发明重组菌及紫色杆菌素的制备方法具有广阔的应用前景。
文档编号C12N1/21GK102703367SQ20111007510
公开日2012年10月3日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者张翀, 杨程, 蒋培霞, 邢新会 申请人:清华大学