一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，属于有机合成及应用【技术领域】；具体是以无水N，N-二甲基甲酰胺DMF、甲苯或丙酮为溶剂，以微波辐射三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚所得活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶为修饰对象，制备龙舌兰麻超氧化物歧化酶修饰物；该活化修饰剂制备方法，借助微波辐射加热，大大缩短活化时间，提高活化效率；该龙舌兰麻超氧化物歧化酶经上述活化修饰剂的修饰，所得修饰物热稳定性、酸碱稳定性，且抗蛋白酶解能力均比天然龙舌兰麻超氧化物歧化酶高，免疫原性下降或消除。
【专利说明】—种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法具体是以无水N，N-二甲基甲酰胺DMF、甲苯或丙酮为溶剂，以微波辐射三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚所得活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶为修饰对象，制备龙舌兰麻超氧化物歧化酶修饰物，属于有机合成及应用【技术领域】。
【背景技术】
[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase SOD)是广泛存在于生命体中的一种专一清除超氧阴离子自由基的金属蛋白酶。
[0003]生物体在正常生命活动过程中伴随着氧代谢会产生活性氧。生物体具有十分完善的活性氧清除体系，包括各种抗氧化酶类和抗氧化物，故正常生理条件下机体的活性氧处于动态平衡状态。但在病理状态下或逆境条件下，机体内活性氧代谢有可能失衡，导致活性氧积累而引发氧化损伤，加速衰老或导致疾病。超氧化物歧化酶(SOD)是生物抗氧化酶类的重要成员，它能够清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，是生物体有效清除活性氧的重要酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线。自1969年McCord和Fridovich从牛红血细胞中发现SOD以来，SOD的研究就成为了生物学的前沿课题之一。人们通过对SOD的广泛深入的研究，极大地丰富和推动了自由基生物学的飞速发展。目前，对SOD的研究已从抗氧化及抗衰老机制拓展到化妆品、食品和医药等方面的应用研究，并已开始应用于研究新一代生物传感器。
[0004]龙舌兰麻是龙舌兰科所属单子叶植物的统称，俗称剑麻。该科有21属，约670种，大多原产于中美洲墨西哥一带。龙舌兰麻具有快速生长，抗逆性强，用途广泛等优点，从而在世界许多国家得到大力发展，如墨西哥、巴西、坦桑尼亚、肯尼亚和中国等20个国家均有种植。我国引种龙舌兰麻已有一百多年历史，先后引进的龙舌兰麻品种有数十个，总种植面积和总产纤维分别占世界的第五位和第三位，龙舌兰麻在纤维产业化方面得到了大量的开发利用。另外，其汁液中所含的蛋白质、皂素类物质和糖类等的研究报道近几十年来也已有一些报道。但关于龙舌兰麻中超氧化物歧化酶的研究却鲜见报道。
[0005]中国专利，专利号:103289969A ;公开一种从植物茎叶中提取超氧化物歧化酶的方法，公开了一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下具体步骤:按料液比(W/V)为1:1?1:2，加入磷酸缓冲液并打成浆液；将得到的浆液进行压榨，收集汁液；用100目?300目的滤布粗过滤；过滤后的汁液先经过截留分子量为40000?60000的超滤膜，再经过截留分子量为6000?20000的超滤膜，得到超氧化物歧化酶粗提液，进一步纯化并喷雾干燥后得所述超氧化物歧化酶。虽然本方法无毒无害，安全性高，但是天然龙舌兰麻超氧化物歧化酶热稳定性、酸碱稳定性，以及抗蛋白酶解能力均比较低，提高其热稳定性及酸碱稳定性有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，该工艺借助微波辐射加热，大大缩短活化时间，提高活化效率。该龙舌兰麻超氧化物歧化酶经上述活化修饰剂的修饰，所得修饰物热稳定性、酸碱稳定性，以及抗蛋白酶解能力均比天然龙舌兰麻超氧化物歧化酶高，免疫原性下降或消除。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，以微波辅助三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚(mPEG)为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶(SOD)为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD (mPEG-SOD)修饰物。
[0008]1.该mPEG修饰剂由以下质量份组成:
50份质量mPEG、10份质量4A分子筛、10?20份质量无水碳酸钠和0.5?6份质量三聚氰酰氯，250?400mL有机溶剂；
优选地，所述mPEG修饰剂的组份中有机溶剂可选择无水甲苯、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
[0009]2.该mPEG修饰剂由以下步骤制备:
将各种组成转入带回流装置的微波炉中，选择功率10?90%，反应3?40分钟。反应完毕趁热抽滤，将上清液倾入500mL无水乙醚或石油醚中，于冰浴中冷却析出，抽滤，得活化mPEG粗产品沉淀。利用重结晶纯化粗产品，重复多次，抽干，直至258nm紫外吸收光谱检测无吸收，所得沉淀经真空干燥，得活化mPEG修饰剂白色固态粉末。
[0010]优选地，步骤重结晶纯化粗产品为在冰浴中，将粗产品溶解在有机溶剂如DMF、甲苯、丙酮中，抽滤，去残渣，在所得滤液中加入无水乙醚或石油醚，搅拌，沉淀，抽滤，弃滤液，得沉淀。
[0011 ] 3.龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备:
将龙舌兰麻SOD冻干粉和活化mPEG修饰剂，按1:10?1:80摩尔比溶解于400份体积0.lmol/LpH9.0碳酸盐缓冲溶液，室温振荡反应0.5?2.5小时，然后在反应液中加入100份体积冷lmol/L甘氨酸终止反应,所得混合溶液用3?50mmol/L pH7?8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析、浓缩，立即上预先平衡好的S^hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得mPEG-SOD冻干粉。
[0012]本发明相对于现有技术的有益效果是:
与其他工艺相比，本发明工艺借助微波辐射加热，大大缩短活化时间，提高活化效率。该龙舌兰麻超氧化物歧化酶经上述活化修饰剂的修饰，所得修饰物热稳定性、酸碱稳定性，以及抗蛋白酶解能力均比天然龙舌兰麻超氧化物歧化酶高，免疫原性下降或消除。该修饰龙舌兰麻超氧化物歧化酶来源于天然植物龙舌兰麻，无病毒、无交叉感染，可用于药品、食品、保健品和化妆品等。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本发明活化mPEG修饰剂的紫外吸收光谱；可见，活化mPEG的最大紫外吸收峰在268nm左右，即所对应的最大紫外吸收波长向长波方向移动，发生红移，说明三聚氰酰氯与mPEG键合了，三聚氰酰氯的氯被mPEG的烷氧基所取代，生成了活化mPEG ；
图2、3是本发明mPEG和活化mPEG的红外吸收光谱；活化mPG的红外吸收光谱(图3)比mPEG的红外吸收光谱(图2)多出1630CHT1左右吸收峰，为-C=N-伸缩振动吸收峰，这说明mPEG与具有均三嗪结构的三聚氰酰氯键合而生成了活化mPEG修饰剂；
图4是本发明温度对mPEG-SOD的影响，其中a为天然SOD，b为修饰SOD ；
图5是本发明pH对mPEG-SOD的影响，其中a为天然SOD，b为修饰S0D。
【具体实施方式】
[0014]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围，本发明【具体实施方式】是通过制备和应用两方面进行实施的。
[0015]实施例1
一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，以微波辅助三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚(mPEG)为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶(SOD)为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD (mPEG-SOD)修饰物。
[0016]1.该mPEG修饰剂由以下质量份组成:
50份质量mPEG、10份质量4A分子筛、20份质量无水碳酸钠和2.5份质量三聚氰酰氯，300mL丙酮。
[0017]2.该mPEG修饰剂由以下步骤制备:
将各种组份转入带回流装置的微波炉中，选择功率40%，反应35分钟。反应完毕趁热抽滤，将上清液倾入500mL无水乙醚或石油醚中，于冰浴中冷却析出，抽滤，得活化mPEG粗产品沉淀。利用重结晶纯化粗产品，重复多次，抽干，直至258nm紫外吸收光谱检测无吸收，所得沉淀经真空干燥，得活化mPEG修饰剂白色固态粉末。
[0018]步骤重结晶纯化粗产品为在冰浴中，将粗产品溶解在甲苯中，抽滤，去残渣，在所得滤液中加入无水乙醚，搅拌，沉淀，抽滤，弃滤液，得沉淀。
[0019]3.龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备:
应用活化mPEG修饰“东一号”麻SOD。将“东一号”麻SOD冻干粉和活化mPEG，按1:1O摩尔比溶解于400份体积0.lmol/LpH9.0碳酸盐缓冲溶液，室温振荡反应1.5小时，然后在反应液中加入100份体积lmol/L冷甘氨酸缓冲溶液终止反应，将所得混合溶液用35mmol/L pH7的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S印hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰“东一号”麻SOD冻干粉。
[0020]实施例2
一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，以微波辅助三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚(mPEG)为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶(SOD)为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD (mPEG-SOD)修饰物。
[0021]1.该mPEG修饰剂由以下质量份组成:
50份质量mPEG、10份质量4A分子筛、15份质量无水碳酸钠和3.5份质量三聚氰酰氯，300mL N，N-二甲基甲酰胺。
[0022]2.该mPEG修饰剂由以下步骤制备:
将各种组份转入带回流装置的微波炉中，选择功率70%，反应25分钟。反应完毕趁热抽滤，将上清液倾入500mL石油醚中，于冰浴中冷却析出，抽滤，得活化mPEG粗产品沉淀。利用重结晶纯化粗产品，重复多次，抽干，直至258nm紫外吸收光谱检测无吸收，所得沉淀经真空干燥，得活化mPEG修饰剂白色固态粉末。
[0023]步骤重结晶纯化粗产品为在冰浴中，将粗产品溶解在丙酮中，抽滤，去残渣，在所得滤液中加入无水乙醚，搅拌，沉淀，抽滤，弃滤液，得沉淀。
[0024]3.龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备:
将龙舌兰麻SOD冻干粉和活化mPEG修饰剂，按1:30摩尔比溶解于400份体积0.1mol/LpH9.0碳酸盐缓冲溶液，室温振荡反应1.5小时，然后在反应液中加入100份体积冷Imol/L甘氨酸终止反应，所得混合溶液用25mmol/L pH8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析、浓缩，立即上预先平衡好的Sephadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得mPEG-SOD冻干粉。
[0025]实施例3
一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，以微波辅助三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚(mPEG)为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶(SOD)为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD (mPEG-SOD)修饰物。
[0026]1.该mPEG修饰剂由以下质量份组成:
50份质量mPEG、10份质量4A分子筛、15份质量无水碳酸钠和I份质量三聚氰酰氯，300mL无水甲苯。
[0027]2.该mPEG修饰剂由以下步骤制备:
将各种组份转入带回流装置的微波炉中，选择功率40%，反应25分钟。反应完毕趁热抽滤，将上清液倾入500mL无水乙醚中，于冰浴中冷却析出，抽滤，得活化mPEG粗产品沉淀。利用重结晶纯化粗产品，重复多次，抽干，直至258nm紫外吸收光谱检测无吸收，所得沉淀经真空干燥，得活化mPEG修饰剂白色固态粉末。
[0028]步骤重结晶纯化粗产品为在冰浴中，将粗产品溶解在DMF中，抽滤，去残渣，在所得滤液中加入无水乙醚，搅拌，沉淀，抽滤，弃滤液，得沉淀。
[0029]3.龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备:
应用活化mPEG修饰“东一号”麻SOD。将“东一号”麻SOD冻干粉和活化mPEG，按1:70摩尔比溶解于400份体积0.lmol/LpH9.0碳酸盐缓冲溶液，室温振荡反应1.5小时，然后在反应液中加入100份体积lmol/L冷甘氨酸缓冲溶液终止反应，将所得混合溶液用35mmol/L pH7的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S印hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰“东一号”麻SOD冻干粉。
[0030]实施例4
一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，以微波辅助三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚(mPEG)为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶(SOD)为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD (mPEG-SOD)修饰物。
[0031]1.该mPEG修饰剂由以下质量份组成:
50份质量mPEG、10份质量4A分子筛、10份质量无水碳酸钠和5.5份质量三聚氰酰氯，400mL丙酮。
[0032]2.该mPEG修饰剂由以下步骤制备:
将各种组份转入带回流装置的微波炉中，选择功率50%，反应25分钟。反应完毕趁热抽滤，将上清液倾入500mL无水乙醚或石油醚中，于冰浴中冷却析出，抽滤，得活化mPEG粗产品沉淀。利用重结晶纯化粗产品，重复多次，抽干，直至258nm紫外吸收光谱检测无吸收，所得沉淀经真空干燥，得活化mPEG修饰剂白色固态粉末。
[0033]步骤重结晶纯化粗产品为在冰浴中，将粗产品溶解在DMF中，抽滤，去残渣，在所得滤液中加入无水乙醚，搅拌，沉淀，抽滤，弃滤液，得沉淀。
[0034]3.龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备:
应用活化mPEG修饰金边龙舌兰S0D。将金边龙舌兰SOD冻干粉和活化mPEG修饰剂，按1:40摩尔比溶解于400份体积0.lmol/LpH9.0碳酸盐缓冲溶液，室温振荡反应1.5小时，然后在反应液中加入100份体积lmol/L冷甘氨酸缓冲溶液终止反应，将所得混合溶液用30mmol/L pH8PBS缓冲溶液透析、浓缩,立即上预先平衡好的Sephadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰金边龙舌兰SOD冻干粉。
[0035]实施例5
一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，以微波辅助三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚(mPEG)为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶(SOD)为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD (mPEG-SOD)修饰物。
[0036]1.该mPEG修饰剂由以下质量份组成:
50份质量mPEG、10份质量4A分子筛、10份质量无水碳酸钠和3.5份质量三聚氰酰氯，350mLDMF。
[0037]2.该mPEG修饰剂由以下步骤制备:
将各种组份转入带回流装置的微波炉中，选择功率90%，反应35分钟。反应完毕趁热抽滤，将上清液倾入500mL石油醚中，于冰浴中冷却析出，抽滤，得活化mPEG粗产品沉淀。利用重结晶纯化粗产品，重复多次，抽干，直至258nm紫外吸收光谱检测无吸收，所得沉淀经真空干燥，得活化mPEG修饰剂白色固态粉末。
[0038]步骤重结晶纯化粗产品为在冰浴中，将粗产品溶解在丙酮中，抽滤，去残渣，在所得滤液中加入无水乙醚，搅拌，沉淀，抽滤，弃滤液，得沉淀。
[0039]3.龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备:
应用活化mPEG修饰金边龙舌兰S0D。将金边龙舌兰SOD冻干粉和活化mPEG修饰剂，按1:70摩尔比溶解于400份体积0.lmol/LpH9.0碳酸盐缓冲溶液，室温振荡反应1.5小时，然后在反应液中加入100份体积lmol/L冷甘氨酸缓冲溶液终止反应，将所得混合溶液用20mmol/L pH7PBS缓冲溶液透析、浓缩,立即上预先平衡好的Sephadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰金边龙舌兰SOD冻干粉。
[0040]对以上得到的mPEG-SOD的特性进行分析，得到结果如下:
(l)mPEG-SOD的热稳定性
天然SOD和mPEG-SOD分别在70°C保温3.5小时，每隔一定时间取样，迅速恒温至25°C后，测定其活力。一般地，mPEG-SOD的活力均高于天然SOD活力。同时，随着时间的延长，二者活力均逐步降低。但天然SOD活力下降速度相对较快，mPEG-SOD活力变化相对较慢。保温时间超过2小时，天然SOD活力首先迅速下降。说明所得mPEG-SOD热稳定性增强。实验结果如图4所示。
[0041 ] (2) mPEG-SOD的酸碱稳定性
天然SOD和mPEG-SOD分别溶于pH4?11缓冲溶液中，混合均匀，25°C保温2小时，测定其活力。PH4?6，二者活力逐渐升高。pH大于6，二者活力逐渐下降。pH大于9，天然SOD活力迅速下降；而PH大于10，mPEG-SOD活力下降速度才加快。说明mPEG-SOD的酸碱稳定性比天然SOD强，而且mPEG-SOD的酸稳定性较碱稳定性强。实验结果如图5所示。
[0042] (3) mPEG-SOD抗蛋白酶解能力
在天然SOD和mPEG-SOD溶液中分别加入胃蛋白酶或胰蛋白酶，25°C保温2小时，测定其活力，天然SOD和mPEG-SOD的活力均有不同程度下降。但mPEG-SOD活力下降的速度要比天然SOD活力下降的速度慢，即SOD经过修饰后，有效地增强了抗胃蛋白酶或胰蛋白酶酶解能力。
【权利要求】
1.一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，其特征在于:以微波辅助三聚氰酰氯活化聚乙二醇单甲醚mPEG为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶SOD为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD，具体步骤如下: (1)mPEG修饰剂的制备: 量取50份质量mPEG、10份质量4A分子筛、10?20份质量无水碳酸钠和0.5?6份质量三聚氰酰氯，250?400mL有机溶剂，将量取的各种组份转入带回流装置的微波炉中进行微波辐射，反应完毕趁热抽滤，将上清液倾入500mL无水乙醚或石油醚中，于冰浴中冷却析出，抽滤，得活化mPEG粗产品沉淀；利用重结晶方法纯化粗产品，重复多次，抽干，直至258nm紫外吸收光谱检测无吸收，所得沉淀经真空干燥，得活化mPEG修饰剂白色固态粉末； (2)龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备:将龙舌兰麻SOD冻干粉和活化mPEG修饰剂，按1:10?1:80摩尔比溶解于400份碳酸盐缓冲溶液，室温振荡反应0.5?2.5小时，然后在反应液中加入100份冷甘氨酸终止反应，所得混合溶液用磷酸盐缓冲溶液PBS透析、浓缩，立即上预先平衡好的Sephadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得mPEG-SOD冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，其特征在于:所述的微波辐射的功率为1(Γ90%，辐射时间为3?40分钟。
3.根据权利要求1所述的一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤(I)所述有机溶剂为无水甲苯、丙酮或N，N-二甲基甲酰胺DMF。
4.根据权利要求1所述的一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤(I)所述的重结晶方法纯化粗产品具体方法为:在冰浴中，将粗产品溶解在有机溶剂DMF、甲苯或丙酮中，抽滤，去残渣，在所得滤液中加入无水乙醚或石油醚，搅拌，沉淀，抽滤，弃滤液，得沉淀。
5.据权利要求1所述的一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的碳酸盐缓冲溶液浓度为0.lmol/L, pH为9.0。
6.据权利要求1所述的一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的冷甘氨酸浓度为lmol/L。
7.据权利要求1所述的一种龙舌兰麻SOD修饰物mPEG-SOD冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述的透析用的磷酸盐缓冲溶液PBS的浓度为3?50mmol/L，pH为7?8。
【文档编号】C12N9/96GK104404020SQ201410615384
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】陈冰 申请人:岭南师范学院