一种修饰龙舌兰麻sod冻干粉的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种修饰龙舌兰麻SOD冻干粉的制备方法，属于有机合成及应用【技术领域】，其以微波辅助琥珀酸酐（SA）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化单甲氧基聚乙二醇（mPEG）为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶（SOD）为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD修饰物。该活化修饰剂制备方法，利用微波辅助加热，大大缩短活化时间，提高活化效率；该龙舌兰麻SOD利用上述活化修饰剂进行修饰，制备修饰SOD修饰物；所得修饰物耐热、耐酸碱，以及抗蛋白酶解能力均比天然龙舌兰麻超氧化物歧化酶高，免疫原性下降或消除。
【专利说明】一种修饰龙舌兰麻SOD冻干粉的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物SOD冻干粉的制备方法，具体涉及一种修饰龙舌兰麻SOD冻干粉的制备方法，属于有机合成及应用【技术领域】。
【背景技术】
[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶，与铜(Cu)、锌(Zn)、铁(Fe)、猛(Mn)等微量元素(tace elements)代谢有密切关系。SOD是生物体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，受到国内外学者和研究者的广泛关注，研究领域已涉及到化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科。因此，深入研究SOD及其与机体内铜、锌、铁、锰等元素代谢的关系，不仅有着重要的理论意义，而且具有重要的实用价值。
[0003]目前所用SOD产品多为从人血或动物血液中提取，但随着国际上疯牛病、口啼疫等传染性疾病的蔓延，动物血液中提取的SOD的使用给人们带来了不少的危险因素。因此，从植物、菌类中提取S0D，食用安全性高、资源丰富、价廉，具有广阔的开发前景。
[0004]为了提高超氧化物歧化酶的稳定性，应对超氧化物歧化酶分子进行必要的修饰改造。目前对SOD分子进行分子修饰改造的途径包括对SOD氨基酸残基进行化学修饰、用水溶性大分子对SOD氨基酸进行共价修饰、对SOD进行酶切修饰。修饰酶不仅完全保留了天然酶的活性，较天然酶稳定，而且在耐热、耐酸、耐碱和抗胃蛋白酶水解能力等方面明显优于天然酶。CN201010137185.2公开了一种SOD修饰生产工艺，以动物血SOD酶作为修饰对象，采用高纯度月桂酰氯做修饰剂；CN201410062990.1公开了一种月桂酸修饰超氧化歧化酶的方法，其将牛血Cu/Zn — SOD溶于弱碱性缓冲液中，再加入活化后的月桂酸进行修饰。虽然其两个专利用小分子对SOD分子进行修饰，人体的吸收利用率提高，但是产品的稳定性不够高，一定程度上限制了其应用，且存在制备成本较高的问题。赵华的《聚乙二醇修饰超氧化物歧化酶的初步研究》(现代生物医学进展，2008，8 (02):277-279)中分子量为6000Da的活化聚乙二醇(PEG)为修饰剂，对玉米超氧化物歧化酶(SOD)进行共价修饰，PEG — 6000利用氰脲酰氯进行活化，但是该种方法利用在其他植物SOD物中，未必能达到理想效果。
[0005]目前，我国热带亚热带地区正大量种植龙舌兰麻，但对其开发利用，主要在于提取纤维以制作缆绳、地毪、麻布等,而龙舌兰麻中宝贵的SOD等生物活性物质则与废液一起弃去，如能从龙舌兰麻中提取高附加值的酶，将大大提高龙舌兰麻的利用率，并降低SOD制备成本。本发明以微波辅助琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺活化单甲氧基聚乙二醇所得单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶为修饰对象，制备龙舌兰麻超氧化物歧化酶修饰物，开发一种经济有效的稳定性高、应用范围广的植物 S0D。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种修饰龙舌兰麻SOD冻干粉的制备方法，以微波辅助琥珀酸酐(SA)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)为活化修饰剂，以龙舌兰麻超氧化物歧化酶(SOD)为修饰对象，制备修饰龙舌兰麻SOD修饰物。该活化修饰剂制备方法，利用微波辅助加热，大大缩短活化时间，提高活化效率。该龙舌兰麻SOD利用上述活化修饰剂进行修饰，制备修饰SOD修饰物。
[0007]—种单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯的微波辅助合成及用途，包括以下步骤:
A.微波辅助活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修饰剂:
将10(Γ120份质量mPEG，3?6份质量SA, 80^120份质量DMF混合均匀；将混合物置于微波炉回流装置中，选择功率1(Γ90%，微波辐射3飞O分钟，停止辐射；待混合物冷却到室温，搅拌下加入无水乙醚或石油醚，使沉淀完全；抽滤，弃滤液留沉淀；搅拌下向所得沉淀中加入有机溶剂，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；重复上述操作3飞次，得到中间产物I，即单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S);所述上述操作是指搅拌下向所得沉淀中加入有机溶剂，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；
在4(T45°C下热浴，在中间产物I中加入3?5份质量NHS、8(Tl20份质量DMF和5?8份质量二环己基碳二亚胺(DCC)，混合均匀，取出，置于室温下过夜；反应混合物再次置于4(T45°C下热浴，直至混合物中的沉淀不再溶解为止；取出，趁热抽滤，弃滤渣留滤液；向所得滤液滴加无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤；所得沉淀用有机溶剂溶解后，加入无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤；重复上述操作3飞次；最后将所得沉淀真空干燥，为最终产物II，即:活化修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修饰龙舌兰麻SOD
将龙舌兰麻SOD粉和mPEG-SS，按1:10?1:80摩尔比溶解于350?550份0.lmol/LpH9.2硼酸盐缓冲溶液，室温振荡反应I?3小时，然后在反应液中加入10(Γ150份体积冷ΡΗ7.0的lmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)终止反应，所得混合溶液用3?50mmol/L pH7?8的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S^hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰龙舌兰麻SOD冻干粉。
[0008]步骤A所述的有机溶剂为DMF、二氯甲烷、三氯甲烷或四氯化碳；所述的冷磷酸盐缓冲溶液的温度为O飞。C。
[0009]步骤B所述的龙舌兰麻SOD粉为龙舌兰麻SOD冻干粉。
[0010]本发明相对于现有技术的有益效果是:
(I)本发明提供的活化修饰剂制备方法利用微波辅助加热，大大缩短活化时间，提高活化效率；(2)龙舌兰麻SOD利用上述活化修饰剂进行修饰，所得修饰物耐热、耐酸碱稳定性，以及抗蛋白酶解能力均比天然龙舌兰麻超氧化物歧化酶高，免疫原性下降或消除；(3)本发明提供的修饰龙舌兰麻超氧化物歧化酶来源于天然植物超氧化物歧化酶经修饰后所得，无病毒、无交叉感染，可用于药品、食品、保健品和化妆品等。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明的技术路线图；
图2是本发明mPEG-SS与NHS的紫外吸收光谱，最终产物II (mPEG-SS)与NHS的紫外吸收峰均在260nm左右，说明NHS与修饰剂原料mPEG键合了 ；
图3、4、5是本发明修饰剂原料(mPEG)、活化修饰剂中间产物I (mPEG_S)和最终产物II (mPEG-SS)的红外吸收光谱，mPEG-S的红外吸收光谱(图4)比mPEG的红外吸收光谱(图3)多出1735 CnT1处吸收峰，为酯羰基的吸收峰，说明第一步反应进行并生成中间产物I，mPEG-SS的红外吸收光谱(图5)比mPEG的红外吸收光谱(图3)多出1775cm^\l736 cnT1、1636 cnT1吸收峰，其中1775cm_\l736 cnT1是两种酯羰基的吸收，1636 cnT1是N-C=O的伸缩振动峰，说明第二步反应进行并生成最终产物II ；
图6、7是本发明温度对修饰SOD的影响，其中a为天然SOD，b为修饰SOD ；
图8是本发明pH对修饰SOD的影响，其中a为天然SOD，b为修饰S0D。
【具体实施方式】
[0012]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0013]实施例1
A.微波辅助活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修饰剂:
将100份质量mPEG，3份质量SA, 80份质量DMF混合均匀；将混合物置于微波炉回流装置中，选择功率10%，微波辐射3分钟，停止辐射；待混合物冷却到室温，搅拌下加入无水乙醚或石油醚，使沉淀完全；抽滤，弃滤液留沉淀；搅拌下向所得沉淀中加入DMF，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；重复上述操作3次，得到中间产物I，即单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在40°C下热浴，在中间产物I中加入3份质量NHS、80份质量DMF和5份质量二环己基碳二亚胺(DCC)，混合均匀，取出，置于室温下过夜；反应混合物再次置于40°C下热浴，直至混合物中的沉淀不再溶解为止；取出，趁热抽滤，弃滤渣留滤液；向所得滤液滴加无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；所得沉淀用DMF溶解后，加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；重复上述操作3次；最后将所得沉淀真空干燥，为最终产物II，即:活化修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修饰龙舌兰麻SOD
将龙舌兰麻SOD粉和mPEG-SS，按1:10摩尔比溶解于350份0.lmol/L pH9.2硼酸盐缓冲溶液，室温振荡反应I小时，然后在反应液中加入100份体积冷pH7.0的lmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)终止反应，所得混合溶液用3mmol/L pH7的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S^hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰龙舌兰麻SOD冻干粉。
[0014]实施例2
A.微波辅助活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修饰剂:
将120份质量mPEG，6份质量SA, 120份质量DMF混合均匀；将混合物置于微波炉回流装置中，选择功率90%，微波辐射60分钟，停止辐射；待混合物冷却到室温，搅拌下加入无水乙醚或石油醚，使沉淀完全；抽滤，弃滤液留沉淀；搅拌下向所得沉淀中加入二氯甲烷，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入石油醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；重复上述操作5次，得到中间产物I，即单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S);
在45°C下热浴，在中间产物I中加入5份质量NHS、120份质量DMF和8份质量二环己基碳二亚胺(DCC)，混合均匀，取出，置于室温下过夜；反应混合物再次置于45°C下热浴，直至混合物中的沉淀不再溶解为止；取出，趁热抽滤，弃滤渣留滤液；向所得滤液滴加石油醚使其沉淀完全，抽滤；所得沉淀用二氯甲烷溶解后，加入石油醚使其沉淀完全，抽滤；重复上述操作5次；最后将所得沉淀真空干燥，为最终产物II，即:活化修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修饰龙舌兰麻SOD
将龙舌兰麻SOD粉和mPEG-SS，按1:80摩尔比溶解于550份0.lmol/L pH9.2硼酸盐缓冲溶液，室温振荡反应3小时，然后在反应液中加入150份体积冷pH7.0的lmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)终止反应，所得混合溶液用50mmol/L pH8的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S^hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰龙舌兰麻SOD冻干粉。
[0015]实施例3
A.微波辅助活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修饰剂:
将110份质量mPEG，5份质量SA, 90份质量DMF混合均匀；将混合物置于微波炉回流装置中，选择功率70%，微波辐射50分钟，停止辐射；待混合物冷却到室温，搅拌下加入石油醚，使沉淀完全；抽滤，弃滤液留沉淀；搅拌下向所得沉淀中加入三氯甲烷，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；重复上述操作4次，得到中间产物I，即单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在42°C下热浴，在中间产物I中加入4份质量NHSUOO份质量DMF和6份质量二环己基碳二亚胺(DCC)，混合均匀，取出，置于室温下过夜；反应混合物再次置于42°C下热浴，直至混合物中的沉淀不再溶解为止；取出，趁热抽滤，弃滤渣留滤液；向所得滤液滴加无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；所得沉淀用三氯甲烷溶解后，加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；重复上述操作4次；最后将所得沉淀真空干燥，为最终产物II，即:活化修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修饰龙舌兰麻SOD
将龙舌兰麻SOD粉和mPEG-SS，按1:70摩尔比溶解于450份0.lmol/L pH9.2硼酸盐缓冲溶液，室温振荡反应2小时，然后在反应液中加入145份体积冷pH7.0的lmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)终止反应，所得混合溶液用40mmol/L pH7.8的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S^hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰龙舌兰麻SOD冻干粉。
[0016]实施例4
A.微波辅助活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修饰剂:
将120份质量mPEG，3份质量SA, 90份质量DMF混合均匀；将混合物置于微波炉回流装置中，选择功率60%，微波辐射40分钟，停止辐射；待混合物冷却到室温，搅拌下加入石油醚，使沉淀完全；抽滤，弃滤液留沉淀；搅拌下向所得沉淀中加入四氯化碳，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；重复上述操作4次，得到中间产物I，即单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在42°C下热浴，在中间产物I中加入4份质量NHSUOO份质量DMF和6份质量二环己基碳二亚胺(DCC)，混合均匀，取出，置于室温下过夜；反应混合物再次置于42°C下热浴，直至混合物中的沉淀不再溶解为止；取出，趁热抽滤，弃滤渣留滤液；向所得滤液滴加无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；所得沉淀用四氯化碳溶解后，加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；重复上述操作4次；最后将所得沉淀真空干燥，为最终产物II，即:活化修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修饰龙舌兰麻SOD
将龙舌兰麻SOD粉和mPEG-SS，按1:70摩尔比溶解于450份0.lmol/L pH9.2硼酸盐缓冲溶液，室温振荡反应2小时，然后在反应液中加入145份体积冷pH7.0的lmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)终止反应，所得混合溶液用40mmol/L pH7.8的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S^hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰龙舌兰麻SOD冻干粉。
[0017]实施例5
A.微波辅助活化单甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成活化修饰剂:
将115份质量mPEG，4.5份质量SA, 88份质量DMF混合均匀；将混合物置于微波炉回流装置中，选择功率65%，微波辐射50分钟，停止辐射；待混合物冷却到室温，搅拌下加入石油醚，使沉淀完全；抽滤，弃滤液留沉淀；搅拌下向所得沉淀中加入三氯甲烷，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；重复上述操作4次，得到中间产物I，即单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯(mPEG-S)；
在42°C下热浴，在中间产物I中加入4份质量NHSUOO份质量DMF和6份质量二环己基碳二亚胺(DCC)，混合均匀，取出，置于室温下过夜；反应混合物再次置于42°C下热浴，直至混合物中的沉淀不再溶解为止；取出，趁热抽滤，弃滤渣留滤液；向所得滤液滴加无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；所得沉淀用三氯甲烷溶解后，加入无水乙醚使其沉淀完全，抽滤；重复上述操作4次；最后将所得沉淀真空干燥，为最终产物II，即:活化修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)；
B.mPEG-SS修饰龙舌兰麻SOD
将龙舌兰麻SOD粉和mPEG-SS，按1:70摩尔比溶解于450份0.lmol/L pH9.2硼酸盐缓冲溶液，室温振荡反应2小时，然后在反应液中加入145份体积冷pH7.0的lmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS)终止反应，所得混合溶液用40mmol/L pH7.8的PBS缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的S^hadex葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280nm第一峰，冷冻干燥得修饰龙舌兰麻SOD冻干粉。
[0018]利用紫外吸收光谱、红外吸收光谱对实施例制备出龙舌兰麻SOD冻干粉进行鉴定，结果见图2?5。
[0019]对实施例制备出龙舌兰麻SOD冻干粉进行耐热能力、耐酸碱能力、抗蛋白酶解能力测定，结果如下:
(I)修饰SOD的耐热能力测定
天然SOD和修饰SOD分别在25?90°C水浴中保温2小时，分别取样测定其活力。在30?50°C，温度提高，修饰SOD和天然SOD的活力逐渐提高。当温度大于50°C，修饰SOD活力逐渐下降，而天然SOD的活力迅速下降。说明修饰SOD耐热性增强。实验结果如图6所
/Jn ο
[0020]天然SOD和修饰SOD在70°C的水浴中保温3.5小时，每隔一定时间取样测定其活力。随着时间的延长，二者活力均逐步降低。保温时间2.5小时，天然SOD活力下降速度明显较修饰SOD快。说明所得修饰SOD耐热性提高。实验结果如图7所示。
[0021](2)修饰SOD的耐酸碱能力测定
天然SOD和修饰SOD分别溶于pH4?11缓冲溶液中，混合均匀，25°C保温2小时，测定其活力。PH4?6，二者活力逐渐升高。pH大于6，二者活力逐渐下降。pH大于9，天然SOD活力迅速下降；而PH大于10，修饰SOD活力下降速度才加快。说明修饰SOD的耐酸碱能力较天然SOD高，而且修饰SOD的耐酸能力高于耐碱能力。实验结果如图8所示。
[0022](3)修饰SOD抗蛋白酶解能力测定
在天然SOD和修饰SOD分别加入胃蛋白酶或胰蛋白酶，2小时后测定其活力，活力均有所下降。其中，加入胃蛋白酶或胰蛋白酶后测得天然SOD的残留活力均低于修饰SOD的残留活力。说明修饰SOD的抗蛋白酶解能力比天然SOD高。因此天然SOD经过修饰后，有效地提高了抗蛋白酶解能力。
【权利要求】
1.一种修饰龙舌兰麻300冻干粉的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 八.微波辅助活化单甲氧基聚乙二醇成郎合成活化修饰剂: 将100?120份质量成郎，3飞份质量“，80^120份质量0即混合均匀得混合物；将混合物置于微波炉回流装置中微波辐射，停止辐射待混合物冷却到室温，搅拌下加入无水乙醚或石油醚，使沉淀完全；抽滤，弃滤液留沉淀；搅拌下向所得沉淀中加入有机溶剂，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀；重复上述操作3飞次，得到中间产物1:单甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯III？郎-3；所述上述操作是指搅拌下向所得沉淀中加入有机溶剂，直到沉淀完全溶解，抽滤，弃沉淀留滤液；在所得滤液中再加入无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤，弃滤液留沉淀； 在40?451下热浴，在中间产物I中加入3飞份质量順3、80?120份质量0即和5?8份质量二环己基碳二亚胺(0(:0,混合均匀，取出，置于室温下过夜得到反应混合物；反应混合物再次置于4(^451下热浴，直至混合物中的沉淀不再溶解为止；取出，趁热抽滤，弃滤渣留滤液；向所得滤液滴加无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤；所得沉淀用有机溶剂溶解后，加入无水乙醚或石油醚使其沉淀完全，抽滤；重复操作3飞次；最后将所得沉淀真空干燥，为最终产物I1:活化修饰剂单甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯成郎-33 ； 8.成郎-“修饰龙舌兰麻300 将龙舌兰麻300粉和成郎-33，按1:10?1:80摩尔比溶解于350?550份硼酸盐缓冲溶液，室温振荡反应1?3小时，然后在反应液中加入100?150份体积的冷磷酸盐缓冲溶液？83，终止反应，所得混合溶液用？83缓冲溶液透析、浓缩，立即上预先平衡好的3印匕如乂葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离，收集280=0第一峰，冷冻干燥得修饰龙舌兰麻300冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种修饰龙舌兰麻300冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤八所述的有机溶剂为0班^、二氯甲烷、三氯甲烷或四氯化碳。
3.根据权利要求1所述的一种修饰龙舌兰麻300冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤八所述的微波辐射的辐射功率为10、0%。
4.根据权利要求1所述的一种修饰龙舌兰麻300冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤八所述的微波辐射的辐射时间为3?60分钟。
5.根据权利要求1所述的一种修饰龙舌兰麻300冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤8所述的硼酸盐缓冲溶液的浓度为0.111101/1，邱为9.2。
6.根据权利要求1所述的一种修饰龙舌兰麻300冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤8所述的冷磷酸盐缓冲溶液？83的浓度为111101/1，邱值为7.0，温度为0飞I。
7.根据权利要求1所述的一种修饰龙舌兰麻300冻干粉的制备方法，其特征在于:步骤8所述的透析用的？83缓冲溶液的浓度为3?50臟01凡，邱为7?8。
【文档编号】C12N9/02GK104357410SQ201410615294
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】陈冰 申请人:岭南师范学院