一种灭蚊真菌贵阳腐霉长期保存的方法
【专利摘要】本发明公开了一种灭蚊真菌贵阳腐霉长期保存的方法，在水琼脂培养基或葵花籽提取物培养基上保存的菌丝，培养温度范围为3℃～5℃，在-25℃和-75℃条件下菌丝体不能存活；氧分压为33.3％，本发明总结了对该真菌保存影响较大的因素，为其商业开发和工厂化生产提供了有价值的资料。
【专利说明】 一种灭蚊真菌贵阳腐霉长期保存的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种灭蚊真菌贵阳腐霉长期保存的方法，属于药物制备【技术领域】。
【背景技术】
[0002]蚊虫是重要的医学昆虫之一，是多种病原体的传播媒介，严重危害人畜健康，目前防治蚊虫主要使用化学杀虫剂，大面积无节制使用化学杀虫剂将严重污染环境，破坏生态环境、危害人类的健康生存，生物防治是利用害虫的各种天敌(寄生生物、捕食者、病原微生物等)将害虫控制在可容忍的水平，其特点是环境污染小、害虫产生抗药性的可能性小、对病虫害特异性强、对非目标生物相对安全、生产和市场费用低等，因此生物防治方法逐步被人们所认识和重视，真菌的有效保质期对其开发应用至关重要，有名的灭蚊真菌大链壶菌在美国注册上市后，就是因为不能长期有效保存，达不到一定的货架寿命，商业开发没有成功。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种灭蚊真菌贵阳腐霉长期保存的方法，该方法在贵州气候下能长时间保持，以克服现有技术的不足。
[0004]本发明的技术方案
一种灭蚊真菌贵阳腐霉长期保存的方法，在水琼脂培养基或葵花籽提取物培养基上保存的菌丝，培养温度范围为3°C?5°C，在一 2 5 °C和一 7 5 1:条件下菌丝体不能存活；氧分压为3 3.3 %。
[0005]由于采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明总结了对该真菌保存影响较大的因素，为其商业开发和工厂化生产提供了有价值的资料。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]附图1为保存在不同培养基和不同时间的贵阳腐霉的生长速度统计图；
附图2为保存在不同培养基和不同时间的贵阳腐霉对致倦库蚊的感染率统计图；
附图3为保存在不同温度和不同时间的贵阳腐霉的生长速度统计图；
附图4为保存在不同温度和不同时间的贵阳腐霉对致倦库蚊的感染率统计图；
附图5为保存在不同氧分压和不同时间贵阳腐霉的生长速度统计图；
附图6为保存在不同氧分压和不同时间贵阳腐霉对致倦库蚊的感染率统计图。
【具体实施方式】
[0007]下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[0008]本发明的实施例:
I材料与方法
1.1 材料 1.1.1菌种
贵阳腐霉于I 9 9 4年在贵阳医学院土壤中分离，经纯化后接种于葵花籽抽提物(SFE) [ 5 ]培养基和K P Y G 2培养基中，每5?7 d转种I次，每3个月复壮并保种一次，(2 5 土 I ) °C恒温培养。
[0009]1.1.2 蚊虫
本实验使用的蚊虫为生物灭蚊实验室驯化后传代饲养的致倦库蚊(C u I e X q u inquefasc1-atus)晚2龄或早3龄幼虫。饲养温度(2 5 ± I ) °C，相对湿度6 O %?7 O %，光照周期为I 4 h:1 O h (光照:黑暗)。
[0010]1.2 方法
1.2.1培养基
KP YG 2培养基、S F E培养基、水琼脂培养基、大豆培养基、综合马铃薯培养基及KPYF培养基6种培养基均在高压蒸汽消毒锅中1.2 I k P a条件下，高压灭菌2 Om i η ,灭菌后,分别倒入培养皿(直径9 O mm、厚2 mm)。
[0011]1.2.2 贮藏温度
取长满贵阳腐霉菌丝体的上述6种培养基琼脂块IcmX I cm置灭菌西林瓶(8mL)中，每瓶一块，加灭菌双蒸水2 mL，封口胶密封，置于自然温、(2 5 土 I) °C、4°C、一2 5°C、一7 5 1:五种温度条件下保存，每组2 5个西林瓶，一2 5°C、一7 5°C两组加I O %甘油保护剂2 m L代替蒸馏水。
[0012]1.2.3 氧分压
取S F E培养基菌丝体观察，每瓶I块，加水2 m L，盖塞，用I次性无菌注射器分别抽取不同体积的空气，密封，存室温(2 5± I) °C保藏，观察西林瓶中氧分压分别为I O O 6 6.7 3 3.3 O时(每组2 5个西林瓶，共I O O个)对菌丝体的影响。
[0013]1.2.4 菌丝体制备
无菌条件下切取I cmX I c mKP YG 2带有贵阳腐霉琼脂块，接种于S F E固体培养皿(直径9 O mm), ( 2 5 土 I ) °C培养，长满后用于接种测试培养基。
[0014]1.2.5 忙藏时间
上述各组菌丝体于保存1、2、3、4、5个月后，分别取5个西林瓶，接种S F E培养基中，(2 5 土 I ) °C培养，测量接种后7 2 h的生长直径，计算其平均生长速度。
[0015]1.2.6 蚊虫感染率观察
用打孔器取出复苏后的菌丝体琼脂块做生物测定，每杯3块，设立空白对照组，置(2 5土 I) °C室温。蚊虫死亡后，取出镜检，记录感染数，计算平均感染率。
[0016]1.3 统计学方法
计算经不同处理和保存不同时间的贵阳腐霉的生长速度和灭蚊毒力。实验数据用S PS S I 5.0电脑统计软件分析处理，菌落直径用单因素方差分析，先做方差齐性分析，方差齐性分析用L S D法，方差不齐分析用T a m b a n e法；对保存后菌丝体的蚊虫感染率用非参数检验进行两两比较S NK法。
[0017]2 结果
2.1培养基的影响
在6种培养基上保存后，贵阳腐霉的生长速度和灭蚊毒力见附图1，水琼脂培养基储存的菌丝体生长最快，大豆培养基的最慢；从菌丝体长势旺盛程度观察，水琼脂培养基储存的长势致密而健壮，大豆培养基上的长势最稀疏，附图2的结果显示S F E培养基上储存的贵阳腐霉灭蚊毒力最高，保存在大豆培养基的菌丝体感染率最低，在实验中观察到，各培养基上保存的贵阳腐霉生长能力和对蚊虫的感染力经过5个月的储存后基本上没有变化。
[0018]2.2 温度的影响
实验证明在4 °C保存的菌丝体平均生长速度最快(附图3)，而且对致倦库蚊幼虫的感染率最高(附图4 )，因此4 °C是保存贵阳腐霉菌丝体的最佳温度，低温(一 2 5 °C和一7 5 °C)保存的菌丝体接种后没有成活。
[0019]2.3 氧分压的影响
观察发现，5个月后，保存在3 3.3 %氧分压条件下贵阳腐霉菌丝体生长最快，其他氧分压下保存的贵阳腐霉菌丝体生长能力无明显差别(附图5 )，对蚊虫的感染力各组之间没有区别(附图6)。
[0020]3 讨论
由于在保存过程中真菌的生理功能有可能被损害，所以正确保存菌株对保持真菌的正常生物学特性很重要，特别是有商业或工业价值的菌株，保存不当会带来巨大损失，真菌种类的多样性异常丰富，但只有很少的种类有合适保存的工艺技术(R y a η, 2 O O O )[6 ]，且保存效果存在菌株水平上的差异性，菌丝对温度、培养基等因素很敏感，又极易被环境中的其它微生物所污染，预实验中观察到悬液培养的贵阳腐菌丝体保存7 d全部死亡，而接种在琼脂中的菌丝体可以完好保存，因此本实验中所有保存菌丝体均生长在琼脂块中，设计了多种可能影响贵阳腐霉菌丝体保存效果的因素进行观察，能使菌丝体保持生长活力的保存条件不一定对保持真菌灭蚊毒力最好，为使贵阳腐霉经过长期保存仍保持有效毒力，选择使贵阳腐霉保持较高毒力的培养基更有价值。所测6种培养基中，以S F E培养基保存菌丝体的毒力最强，可能是葵花籽中含有产生游动孢子所需要的一些营养物质、生长因素、矿物质等，尤其是其中的固醇类物质对于游动孢子的形成至关重要，因此，S FE培养的贵阳腐霉能产生数量较多、毒力较强的游动孢子，实验证明，贵阳腐霉是一种对环境营养条件要求不高的真菌，大链壶菌在水琼脂上根本不能生长，而贵阳腐霉不但在水琼脂上能生长，而且在水琼脂上的贵阳腐霉菌丝体保存时间最长，并保持较高的生长活力和灭蚊毒力，而综合马铃薯和大豆培养基中保存的菌丝体生长速度和灭蚊毒力比上述前4种培养基差，原因可能是后2种培养基的营养因素不均衡，没有达到适合菌丝体生长所要求的C: N比值、微量元素、油脂等，较高的温度下，真菌能迅速生长繁殖，导致环境中营养物质的耗尽和代谢废物的堆积，导致真菌迅速死亡。相反，在低温下，真菌的代谢处于极低状态，营养物质的消耗和代谢废物的堆积速度大大降低，使存活时间大大延长，但是不同真菌所耐受的低温限度是不一样的，大链壶菌在I 5 °C可以保存9 3 d，在I (TC只能存活I周(S U，I 9 8 6 )，本实验证明，贵阳腐霉对低温的耐受力大大强于大链壶菌，接种在水琼脂培养基上的贵阳腐霉在4 °C保存5个月后仍能保持较好的生长活力和灭蚊毒力。在超低温情况下，生物的细胞代谢基本停止，不消耗营养和氧气，也不产生代谢废物，更重要的是由于不繁殖，突变的机会大大减少，所以目前超低温是保存微生物菌种的最重要方法，但是因为超低温保藏涉及细胞内水分产生冰晶会对细胞产生致死的破坏，为避免和降低冰晶对细胞造成的伤害，需要对保护剂、降温速度和复苏速度进行摸索。本实验在一 2 5 °C和一7 5 1:的超低温保存中，菌丝体不能成活，很明显是温度下降过程中冰晶对细胞造成了伤害，保存真菌代谢时需要氧气的参与，氧气丰富，则代谢旺盛。实验室传统的保存菌种的方法之一就是用石蜡油封存长满菌丝的斜面培养基，其原理就是减少真菌细胞氧化，但是，究竟在环境中保留多少空气最适合真菌保存并减少对真菌活力的伤害需要通过实验来证明，本实验采用减少西林瓶中一定量空气的方法来观察，力求找到保存时所需的较好氧分压，菌丝体保藏在(2 5± I) °C，5个月后，真菌皆能存活，灭蚊毒力的变化相互之间差异不大，说明环境中的氧分压对保藏效果影响不大，综上所述，本研究总结了对该真菌保存影响较大的因素，为其商业开发和工厂化生产提供了有价值的资料。
【权利要求】
1.一种灭蚊真菌贵阳腐霉长期保存的方法，其特征在于:在水琼脂培养基或葵花籽提取物培养基上保存的菌丝，培养温度范围为3°c?5°C，在一 2 5 °C和一 7 5 °C条件下菌丝体不能存活；氧分压为3 3.3 %。
【文档编号】C12R1/645GK104450520SQ201410740598
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】敖云霞 申请人:敖云霞