专利名称：一种海洋真菌梅花状青霉及其提取物和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herqUei)FS83，以及从该菌株的液体培养菌丝体中制备的发酵提取物，和该提取物在制备抗细菌、真菌药物和抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤又称为癌症，是一种危害人类生命和生活质量的主要疾病之一。据世界卫生组织统计，世界上每年有1000万人患上癌症，约有600万人死于癌症，占全球死亡人数的12%。而且由于吸烟人数增多，体育运动减少，饮食中缺少果蔬等不良习惯可能会导致患癌症的人数增多。我国卫生部在第21届世界抗癌大会上指出，中国每年癌症发病人数为 260万，而死亡人数达180万，已成为中国城市和农村居民的第一位死亡原因，寻找有效的抗癌药物是世界上新药开发的重点领域。随着环境污染的加剧，新的感染性疾病发生和耐药菌株的大量出现，正日益严重地威胁着人类健康，人们不得不寻求新的抗菌药物以应对不断产生的耐药菌株，因此，寻找新的抗菌药物也是世界上新药开发的重点领域。由于陆栖微生物活性物质的大量开发和应用，寻找新种属或特殊性状的微生物及其代谢产生的新型抗菌、抗肿瘤药物越来越难，于是，人们将目光纷纷投向海洋。海洋真菌是海洋微生物的重要组成部分，这类真菌不但种类多，分布广，而且生存在低温、高压、高盐、高寒、寡营养等独特的环境中，必然会产生一些与陆地真菌不同的代谢系统和防御物质，包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒等活性物质，研究人员从中发现了一些具有生物活性的新天然产物，包括一些具有新颖骨架的化合物。因此，海洋真菌在发掘药物先导化合物方面有很大的潜力，从海洋真菌中寻找新的抗菌、抗肿瘤药物已成为当今世界新药的研发热点。
发明内容
本发明的第一目是提供一种海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83, 该菌株于2011年11月M日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011415。本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83是从南海 (106° 30.四5' E,10° 0.941' N) 1675m深处的海泥中分离、纯化得到。其分离纯化方法为将海泥样品用含30%粗海盐的无菌水稀释到10%，27°C振荡20min，取0. ImL均勻涂布在改良PDA固体培养基中J6 恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。 所述改良PDA固体培养基是在每升PDA培养基中加入KH2P043g、MgS040. 75g、维生素B1IOmg, 粗海盐30g、琼脂20g。通过形态学研究，并根据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，该菌株鉴定为梅花状青霉(Penicillium herquei)，命名为梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83，于2011 年 11 月M日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为 CCTCCNO :M 2011415。其形态特征如下在改良PDA固体培养基上菌落黄绿色，背面黄褐色至暗绿色，绒状或絮状，具不明显辐射状沟纹；分生孢子梗发生于基质和气生菌丝，壁粗糙，具疣状突起， 黄绿色；帚状枝双轮生，梗基每轮5-9个，7. 5 12X2. 5 4. 0 μ m。分生孢子球形，光滑， 淡绿色，2. 5 4. 5 X 2. 0 3. 5 μ m。根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区， 其ITS区的碱基序列如下SEQ ID NO. 1所示，提交GeneBank，其GenBank基因登录号为 JQ034358，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度最高的两条序列均为梅花状青霉 (Penicillium herquei)，相似度达99. 1 %，因此也确定该菌株为梅花状青霉(Penicillium herquei)。本发明的第二个目的是提供一种具有抗菌、抗肿瘤作用的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物，其特征在于，以海洋真菌梅花状青霉 (Penicillium herquei)FS83作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体用石油醚或丙酮或无水乙醇或95%乙醇水溶液冷浸，优选是用无水乙醇冷浸， 冷浸液经浓缩后即得海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物。所述的液体发酵，优选是将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83 菌接种到改良PDA液体培养基中，120r/min，^TC培养7d，获得海洋真菌梅花状青霉 (Penicillium herquei)FS83发酵培养物，所述改良PDA液体培养基是在每升PDA培养基中加入KH2PO4 3g、MgS040. 75g、维生素BllOmg、粗海盐30g ；所述的冷浸时间优选为对 观小时。本发明通过实验发现，本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83发酵提取物在500 μ g/片滤纸浓度下，对金黄色葡萄球菌(Maphyloccocus aureus)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌圈直径分别为 12mm、11mm、2. 6mm。选择 25mg/mL,12. 5mg/mL,6. 25mg/mL,3. 125mg/mL,1. 5625mg/ mL，0. 7812mg/mL,0. 3906mg/mL 7个浓度下进行最低抑菌浓度(MIC值)试验，确定该发酵提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的 MIC 值分别为 1. 56mg/mL、1. 56mg/mL、12. 5mg/mL。 由此可见，本发明海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物具有抗细菌活性，可用来制备抗细菌药物。因此本发明的第三个目的是提供海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83发酵提取物在制备抗细菌药物中的应用。所述的抗细菌药物优选为抗枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球 |if (Staphyloccocus aureus) S^^MIf lif (Pseudomonas aeruginosa)本发明的第四个目的是提供一种抗细菌药物，其特征在于，该抗细菌药物包含海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成分。本发明通过实验发现，本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83发酵提取物在50mg/mL浓度下，对绿色木霉(Trichoderma roseum)的抑制率为90 100%、对黑曲霉(Aspergillus niger)的抑制率为70 80 %、对黄曲霉(Aspergillus flavus)的抑制率为 70 80 %。选择 25mg/mL, 12. 5mg/mL, 6. 25mg/mL, 3. 125mg/mL,1. 5625mg/mL,0. 7812mg/mL,0. 3906mg/mL 7个浓度下进行最低抗菌浓度(MIC值)试验，确定该发酵提取物对绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉 (Aspergillus flavus)的 MIC 值分别为 0. 78mg/mL、1. 56mg/mL、1. 56mg/mL。结果表明本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对真菌具有抗真菌活性，可用来制备抗真菌药物。本发明的第五个目的是提供海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物在制备抗真菌药物中的应用。所述的抗真菌药物优选为抗绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉 (Aspergillus niger)或黄曲霉(Aspergillus flavus)药物。本发明的第六个目的是提供一种抗真菌药物，其特征在于，该抗真菌药物包含海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成分。本发明通过抗肿瘤活性评价发现，海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83发酵提取物在ΙΟΟμ g/mL浓度下，对人肺癌细胞NCI-H460的抑制率为70 80%、对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制率为60 70%、人神经胶质瘤细胞SF-268的抑制率为50 60 % ο 选择 200 μ g/mL, 100 μ g/mL, 80 μ g/mL, 60 μ g/mL, 40 μ g/mL, 20 μ g/mL 浓度下进行试验，确定该发酵提取物对人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞 SF-268 的 IC50 值分别为 55. 86 μ g/mL,62. 50 μ g/mL,63. 48 μ g/mL。结果表明本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicililum herquei)FS83发酵提取物具有抗肿瘤活性，可应用于制备抗肿瘤药物。因此，本发明的第七个目的是提供海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83发酵提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物优选为抗肺癌、乳腺癌或神经瘤药物。本发明的第八个目的是提供一种抗肿瘤药物，其特征在于，该抗肿瘤药物包含海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成份。本发明的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物具有广谱抗细菌、真菌活性和抗肿瘤活性，表明该发酵提取物具有很好的应用开发前景，因此本发明为研究与开发新的抗菌、抗肿瘤药物提供了候选药物，为开发利用海洋真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。本发明的梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011415。
具体实施例方式以下通过具体实施例来对本发明进一步说明，但并非限制本发明。实施例1 海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83的分离和鉴定海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83是从南海(106° 30.四5' E, 10° 0.941' N) 1675m深处的海泥中分离、纯化得到。其分离纯化方法为将海泥样品用含30%粗海盐的无菌水稀释到10%，27°C振荡 20min，取0. ImL均勻涂布在改良PDA固体培养基中J6 恒温箱培养，待菌落长出后，挑取菌落划线纯化得到。所述改良PDA固体培养基是在每升PDA培养基中加入KH2P043g、 MgSO4O. 75g、维生素 B1IOmg,粗海盐 30g，琼脂 20g。通过形态学研究，并根据《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)，该菌株鉴定为梅花状青霉(Penicillium herquei)，命名为梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83，于2011 年 11 月M日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为 CCTCCNO :M 2011415。其形态特征如下在改良PDA培养基上菌落黄绿色，背面黄褐色至暗绿色，绒状或絮状，具不明显辐射状沟纹；分生孢子梗发生于基质和气生菌丝，壁粗糙，具疣状突起，黄绿色；帚状枝双轮生，梗基每轮M-9个，7. 5 12 X 2. 5 4. 0 μ m。分生孢子球形，光滑，淡绿色，2. 5 4. 5X2. 0 3· 5μπι。根据常规方法提取该菌株的DNA，并利用真菌的ITS区的通用引物扩增其ITS区， 其ITS区的碱基序列如下SEQ IDN0. 1所示，提交GeneBank，其GenBank基因登录号为 JQ034358，通过在GenBank中进行blast检索，与其相似度最高的两条序列均为梅花状青霉 (Penicillium herquei)，相似度达99. 1 %，因此也确定该菌株为梅花状青霉(Penicillium herquei)。实施例2 海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的制备将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83菌接种到改良PDA液体培养基中，120r/min，26°C培养7d，获得海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83的液体培养物。将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83的液体培养物过滤，使菌丝体和发酵液分离，菌丝体用石油醚或丙酮或无水乙醇或95%乙醇水溶液冷浸，本实施例用无水乙醇冷浸48h，冷浸液再经减压浓缩得即得到绿色膏状的提取物，即为海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83 发酵提取物。所述的改良PDA培养基通过以下方法获得用500mL蒸馏水煮200g马铃薯20min， 过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH2P043g、MgS040. 75g、维生素BJOmg、粗海盐30g，用水补足至 1L，灭菌制得。实施例3 海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的抗细菌活性一、采用滤纸片法测定海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和绿脓 Iflif (Pseudomonas aeruginosa)的舌t生。将实施例2得到的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83发酵提取物用DMSO溶解，并稀释至50mg/mL浓度。将液体发酵获得的上述待测细菌菌液用生理盐水分别稀释至106CFU/mL的浓度， 吸取浓度为106CFU/mL的细菌菌液200 μ L均勻涂布于含有LB培养基平板中，贴上直径为 4mm的滤纸片，分别在滤纸片上滴加浓度为50mg/mL的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物稀释液10 μ L，以DMSO代替该发酵提取物稀释液作空白对照，以 20 μ g/mL浓度的硫酸卡那霉素代替该发酵提取物稀释液作阳性对照，每个处理做3皿重复。37°C恒温箱中培养M 48h，然后测量抑菌圈直径，以抑菌圈直径大小来评价抗菌活性。实验结果如表1所示表1 海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物的抗细菌作用
权利要求
1.一种海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83，其保藏编号为CCTCC NO: M2011415。
2.一种海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83发酵提取物，其特征在于， 以海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83作为发酵菌株，液体发酵获得发酵培养物，分离菌丝体和发酵液，取菌丝体用石油醚或丙酮或无水乙醇或95%乙醇水溶液冷浸， 冷浸液经浓缩后即得海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物。
3.根据权利要求2所述的海洋真菌梅花状青霉(Penicilliumherquei)FS83发酵提取物，其特征在于，所述的液体发酵是将海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei) FS83菌接种到改良PDA液体培养基中，120r/minJ6°C培养7d，获得海洋真菌梅花状青霉 (Penicillium herquei) FS83发酵培养物，所述改良PDA液体培养基是在每升PDA培养基中加入Iffl2P043g、MgSO4O. 75g、维生素B1IOmg,粗海盐30g ；所述的冷浸时间为M 观小时。
4.权利要求2所述的海洋真菌梅花状青霉(Penicilliumherquei)FS83发酵提取物在制备抗细菌药物中的应用。
5.一种抗细菌药物，其特征在于，该抗细菌药物包含权利要求2所述的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成分。
6.权利要求2所述的海洋真菌梅花状青霉(Penicilliumherquei) FS83发酵提取物在制备抗真菌药物中的应用。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗真菌药物为抗绿色木霉 (Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)或黄曲霉(Aspergillus flavus)药物。
8.一种抗真菌药物，其特征在于，该抗真菌药物包含权利要求2所述的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成分。
9.权利要求2所述的海洋真菌梅花状青霉(Penicilliumherquei)FS83发酵提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，该抗肿瘤药物包含权利要求2所述的海洋真菌梅花状青霉(Penicillium herquei)FS83发酵提取物作为活性成份。
全文摘要
本发明公开了一种海洋真菌梅花状青霉及其提取物和应用。海洋真菌梅花状青霉(P enicillium herquei)FS83于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NOM 2011415。其发酵提取物对金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)具有抑制效果，而且对绿色木霉(Trichoderma roseum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)也具有抑制作用；同时，该发酵提取物对人肺癌细胞NCI-H460、人乳腺癌细胞MCF-7、人神经胶质瘤细胞SF-268具有抑制活性。因此，本发明的实现，为研究与开发新的抗菌、抗真菌、抗肿瘤药物提供了候选药物，为开发利用海洋真菌来源的天然活性物质提供了科学依据。
文档编号A61P35/00GK102391956SQ20111041091
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者李浩华, 王磊, 章卫民, 陈玉婵 申请人:广东省微生物研究所