一种编码红肉桃myb10转录因子的dna序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种编码红肉桃MYB10转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，该DNA序列与质粒所构建的重组表达载体、经上述重组表达载体转化的宿主细胞。本发明通过RACE-PCR技术克隆红肉桃花青苷生物合成的转录因子PpMYB10基因，为桃优异基因资源的保存提供保证，为利用基因工程手段培育富含花青苷的新型水果品种提供基石。本发明对培育红色水果新品种具有重要意义，也为建立以花青素基因作为报告基因的植物转基因可视化跟踪表达系统奠定技术基础和基因资源。
【专利说明】一种编码红肉桃MYB10转录因子的DNA序列及应用 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说是一种编码红肉桃MYBlO转录因子的 DNA序列及应用。 【【背景技术】】
[0002] 桃（Prunus persica(L. )Batsch)起源于中国，已有4000多年的栽培历史（汪祖华 和庄恩及，2001)。我国桃资源丰富，桃果肉颜色可分为白色、黄色和红色及其各种过渡色。 目前国内外栽培桃几乎都是白肉和黄肉类型。而红肉桃因为口味较酸等一直未受重视。红 肉桃是一类数量稀少的桃种质资源，具有重要的生产价值和育种价值。红肉桃中花青素和 多酚含量明显高于白肉和黄肉桃品种，其抗氧化能力远远高于后两种桃。目前，具有生物活 性物质的红色水果已成为当前功能性水果开发研宄的热点之一，颇具市场魅力。因此，积极 研宄红肉桃着色机理对保护我国基因资源、推动桃品质改良具有重要意义。
[0003] 红肉桃果实的红色来自于花青苷。花青苷的颜色主要由花青素结构决定。花青 素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，它是由一系列附着于细胞膜和内质网膜上 的酶催化合成，然后运输并积累在维管植物液泡中。在自然界中最常见的花青苷为矢车菊 素-3-葡萄糖苷。
[0004] 许多研宄表明，花青苷在疾病预防和抑制肿瘤发育方面有显著疗效。近年来，为了 满足消费者对桃的果品类型需求多样化和营养科学的要求，果树育种者致力于培育综合品 质优良的红肉品种，发挥果实的营养保健作用。
[0005] 随着分子生物学、基因工程技术的不断发展，进一步阐明花青素合成的调控网络， 对于研宄花青素的生物学功能，利用基因工程技术改变花青素含量具有重要意义。
[0006] MYB是一类广泛存在的保守的转录因子，是植物转录因子中最大的家族之一，广泛 参与各种生命活动。包括三个不完全的重复，根据重复序列的数目，分为R1MYB、R2R3MYB和 R1R2R3MYB三类。在拟南芥中已发现130多种MYB类转录因子，根据其功能分为24个亚类， 其中第10亚类主要参与花青素的代谢调节。MYBlO基因组序列较为保守，通常含两个内含 子，第二个内含子的长度在不同物种中差异较大。如苹果第二内含子为2995bp，拟南芥则为 89bp。拟南芥存在TT2、PAP1/PAP2等多种MYBlO基因，它们均特异调控花色素合成途径的 结构基因的时空表达模式和表达强度。
[0007] 目前对红肉桃的呈色机理及其遗传特性的研宄很少，红肉桃果实花青苷生物合成 相关基因在红肉桃中也尚未克隆。因此，深入系统研宄果实着色机理对园艺产品品质改良 具有普遍意义，这对提高我国水果市场竞争力和提高果实综合品质具有特殊意义。 【
【发明内容】
】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种编码红肉桃MYB转录因子的 DNA序列。
[0009] 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，或与核苷酸序列如SEQ ID NO. 12互补的核 苷酸序列。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供含有所述红肉桃MYBlO转录因子基因的重组表达 载体。
[0011] 本发明的第三个目的在于提供质粒，所述质粒为PBI121。
[0012] 本发明的第四个目的在于提供含有所述红肉桃MYBlO转录因子基因的宿主细胞。
[0013] 本发明的第五个目的在于提供一种编码红肉桃MYBlO转录因子的DNA序列的应 用。
[0014] 为实现上述第二及第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种重组表达载体， 所述的载体是由如上所述的DNA序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体，所述的质粒是 pBI121。所述的载体是通过下列步骤构建的：a)把如上所述的DNA序列连入载体pMD 19-T， 得到载体pMD 19-T-PpMYB10;b)以重组载体pMD 19-T-PpMYB10 为模板，以 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 17所示的DNA序列为引物扩增得到含有BamH I和Sac I酶切位点的ΡρΜΥΒΙΟ 基因片段，用BamH I和Sac I双酶切后与BamH I和Sac I双酶切pBI121回收的大片段连 接，获得载体 PB 1121 -PpMYB 10。
[0015] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种基因工程化的宿主细胞， 所述的宿主细胞是用如上任一所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。 所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。所 述的宿主细胞是农杆菌细胞。
[0016] 为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：一种转基因烟草愈伤组织和 植株呈现紫红色的方法，所述的方法包括以下步骤：(a)构建如上所述的重组表达载体； (b)利用步骤（a)所述的重组表达载体转化感受态农杆菌细胞，获得工程菌；(c)利用步骤 (b)获得的工程菌转化烟草植株。所述的烟草植株是"Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN"烟草植株。
[0017] 本发明通过遗传转化，将红肉桃MYB10转录因子基因 PpMYB 10转入烟草中，通过调 控代谢途径，在烟草中合成花青苷。本发明的基因对培育红色水果新品种具有重要意义，也 为建立以花青素基因作为报告基因的植物转基因可视化跟踪表达系统奠定技术基础和基 因资源。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0018] 图1红肉桃MYBlO转录因子基因 ΡρΜΥΒΙΟ的PCR扩增电泳图（Ml :Marker ;M2 : IOObp DNA Ladder ;A:PpMYB10 片段扩增产物；B :5' RACE Inner PCR 扩增产物；C : 5' RACE Outer PCR 扩增产物；D :3' RACE Outer PCR 扩增产物；E :3' RACE Inner PCR 扩增产物；F :PpMYB10全长扩增产物）；
[0019] 图2表达载体pBim-PpMYBlO构建示意图；
[0020] 图3表达载体PBim-PpMYBlO的T-DNA结构图；
[0021] 图4转基因烟草的ΡρΜΥΒΙΟ基因的PCR检测电泳图（M3 :2-Log DNA Ladder(0. 1-10. Okb) ;1 :阳性对照；2 :空白对照；3 :未转化植株；Rl?R13 :转化植株）；
[0022] 图5红肉桃MYB10转录因子基因 ΡρΜΥΒΙΟ在烟草愈伤组织和植株中的表达结 果（Α :转化ρΒΙ121的烟草愈伤组织；B :转化pBim-PpMYBlO的烟草愈伤组织；C :转化 PBI121的烟草植株；D :转化pBI121-PpMYB10的烟草植株）。 【【具体实施方式】】
[0023] 以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0024] 实施材料：
[0025] 培养基：（I)LB培养基：配方为酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，pH 7. 2,固 体培养基加入琼脂15g/100L。（2) YEB培养基，配方为牛肉浸膏5g/L，酵母膏lg/L，蛋白胨 5g/L，蔗糖5g/L，MgSO4 · 7H20 4g/L，pH 7. 4,固体培养基加入琼脂15g/L。（3)MS培养基配 置见表1，培养基Hp H2、成配方如表2所不。
[0026] 表I MS培养基母液的配置
[0027]
【权利要求】
1. 一种编码红肉桃MYB10转录因子的DNA序列，其特征在于：DNA序列包括： (a) SEQ ID NO. 12所述的核苷酸序列，或 (b) 与（a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2. 含有权利要求1所述基因的重组表达载体，所述重组表达载体由所述DNA序列与质 粒或病毒所构建的重组表达载体。
3. 根据权利要求2所述基因的重组表达载体，其特征在于：所述的质粒是pBI 121。
4. 根据权利要求2所述基因的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是通过 下列步骤构建的： (1) 将所述DNA序列连入载体pMD 19-T，得到载体pMD19 T-PpMYB10; (2) 以 pMD19 T-PpMYB10 为模板，以 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 17 所示的 DNA 序列 为引物扩增得到含有BamH I和Sac I酶切位点的PpMYBlO基因片段，用BamH I和Sac I 双酶切后回收再与BamH I、Sac I双酶切pBI121回收的大片段连接，获得重组表达载体 pBI121-PpMYB10。
5. 含有权利要求1所述基因的宿主细胞，所述的宿主细胞是用权利要求2-4任一所述 的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
6. 根据权利要求5所述基因的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为细菌细胞、真菌 细胞、植物细胞、动物细胞中的任意一种或者其宿主细胞的后代。
7. 根据权利要求5所述基因的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为农杆菌细胞。
8. 根据权利要求1所述的一种编码红肉桃MYB10转录因子的DNA序列的应用，其特征 在于：通过转基因技术，获得含有编码红肉桃MYB10转录因子的DNA的烟草转化植株，包括 以下步骤： (a) 构建如权利要求4所述的重组表达载体； (b) 利用步骤（a)所述的重组表达载体转化感受态农杆菌，获得工程菌； (c) 利用步骤（b)获得的工程菌转化烟草植株。
9. 根据权利要求8所述的一种编码红肉桃MYB10转录因子的DNA序列的应用，其特征 在于，所述的烟草植株是"Nicotiana tabacum L.cv.Samsun NN"烟草植株。
10. 根据权利要求8或9所述的一种编码红肉桃MYB10转录因子的DNA序列的应用，其 特征是在于：所述DNA序列在烟草中表达，能有效地调控烟草花青素代谢途径，获得紫红色 愈伤组织和紫红色烟草植株。
【文档编号】C12N1/15GK104498506SQ201410798349
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】樊连梅, 刘更森, 原永兵 申请人:青岛农业大学