一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法及其产物和产物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法及其产物和产物的应用提供一种蜜柚柚皮烟草保润剂制备方法，以蜜柚果皮为材料，采用高速剪切乳化结合复合酶二次破壁方法提取柚皮多糖，有机溶剂变温渗透沉淀制备不同溶剂分级的柚皮多糖，并采用凝胶色谱研究了分级多糖分子量分布差异。不同分级的多糖分子量测定表明：不同溶剂分级的多糖分子量有显著差异，其中a粗多糖的峰①的重均分子量为24100Da，b粗多糖的峰①的重均分子量为11700Da，c粗多糖的峰①的重均分子量为2130Da。表明乙醇浓度越低，沉淀多糖的分子量越大。柚皮多糖的最优保润浓度为1.5g/100Ml,当选择不同溶剂时，柚皮多糖的保润效果有所差别，其中水溶的柚皮多糖的保润性明显高于醇溶的柚皮多糖，总体来说均高于目前使用的保润剂，如丙二醇。
【专利说明】一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法及其产物和产物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及多糖提取领域，更具体地，涉及一种蜜柚柚皮多糖的提取分级方法及其产物应用。
【背景技术】
[0002]柚子属于芸香科柑橘，是大众化的水果之一，广东梅县柚子是广东省“三高”农业战略龙头产品，目前梅州金柚的栽培已近百年历史，全市总面积40万亩，产量30万吨以上，全省金柚产量高达40万吨，是全国最大的金柚商品生产基地。1995年被国家首批百家中国特产之乡组委会命名为“金柚之乡”。目前全市总面积30万亩，产量30万吨以上，是全国最大的金柚商品生产基地。1995年被国家首批百家中国特产之乡组委会命名为“金柚之乡”。农民种植水果增产不增收，大大挫伤了农民的积极性。李时珍的《本草纲目》中指出:“柚，功能消食，解酒毒，去肠胃中恶气，长发滋燥，疗妊妇不思食口淡”。柚皮占整个柚子的43%~48%，含有多种对人体健康有益的非营养性生理活性成分，如黄酮类化合物、活性多糖、类柠檬苦素、香精油、天然色素、膳食纤维等，这些成分高于柚果实。目前多糖提取方法主要有水浸提法、酸碱提取法、微波提取法等，传统高温提取法工艺周期较长，而且能耗大、效率低；酸碱提取易破坏环多糖的立体结构和活性；微波法省时但效率不高；超声波法虽然效率较高，但噪音较大，仪器价格昂贵。
[0003]目前食品行业生产中使用的保润剂主要是多元醇类化合物，如丙二醇、甘油、木糖醇和山梨醇等。这些保润剂均靠其吸湿性而对载体产生保润作用，其保润效果并不理想。多糖分子中存在大量羟基 和羧基等基团，可与水分子形成氢键，并相互交联形成网状结构，起到很好的保水作用。其次多糖具有良好的成膜性能，可在食品表面形成一层均匀的薄膜，减少食品表面的水分蒸发而完成保润作用。柚皮具有抑菌、抗氧化且具有止咳、化痰、理气、抗炎、止痒等功效。
[0004]高剪切分散乳化(Highshear dispersing emulsifier, HSDE)技术是一种新型纳米、微米和均质化技术。物料在多层转子和定子之间的间隙内高速运动，可形成高切线和高频机械效应，形成较强动能，使物料产生挤压、摩擦、剪切等多种受力，最终使物料充分混合、搅拌、细化达到理想要求。近年来，该技术已成为天然产物有效成分提取中一种重要方法。HSDE结合复合酶二次破壁技术应用于柚皮多糖的提取未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供一种适合柚皮提取分级的方法。
[0006]首先提供一种蜜柚柚皮多糖的分级提取方法，包括以下几步，
51.取柚皮，根据柚皮重量，加入纤维素酶0.5-5.0%和果胶酶1.0-3.5%，在45-60°C下,加入水,所述的水和柚皮的重量比为10-35:1，高剪切分散乳化机10000r/min下处理2-20min，酶解1-2.5小时，得酶解液，
52.取SI所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为45~55%，温度25°C_4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一为a粗多糖，
S3.取步骤S2所得的上清液一逐步加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为65~75%，250C -4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二为b粗多糖，
S4.取步骤S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为85、5%，250C_4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三为c粗多糖。
[0007]优选方案为，所述的纤维素酶用量为1.5%,果胶酶用量为1.5%,所述的酶解时间为120min，水和柚皮的重量比为1:25，酶解的温度为50°C。
[0008]所述的蜜柚优选梅州金柚。
[0009]更进一步的提供一种蜜柚柚皮a粗多糖，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的a粗多糖的峰①的重均分子量为24100Da,数均分子量为21300Da,峰位分子量为28540 Da,分子量分布宽度为1.13。
[0010]所述的a粗多糖的峰②的重均分子量为2180Da，数均分子量为2060Da，峰位分子量为2650 Da,分子量分布宽度为1.06。
[0011]更进一步的提供一种蜜柚柚皮b粗多糖，经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的b粗多糖的峰①的重均分子量为11700Da,数均分子量为11200Da,峰位分子量为13540Da,分子量分布宽度为1.04。
[0012]所述的b粗多糖的峰②的重均分子量为1920Da，数均分子量为2030Da，峰位分子量为2390 Da，分子量分布宽度为1.05。
[0013]更进一步的提供一种蜜柚柚皮c粗多糖,其特征在于,经Waters凝胶渗透色谱分析得，所述的c粗多糖的峰①的重均分子量为2130Da,数均分子量为1890Da,峰位分子量为2540Da，分子量分布宽度为1.12。
[0014]上述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在保润方面的应用。
[0015]上述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在烟草保润方面的应用。具体的应用方法为，将a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖的水溶液喷加于烟草表面。
[0016]本发明的优点如下:
本发明利用岭南特色水果柚子皮止咳、化痰、理气、抗炎等功能特性，着重研究柚皮多糖的提取工艺和不同溶剂分级多糖的分子量差异，以期探索出一种高效的柚子多糖提取工艺，诠释不同分子量多糖功效机理，为食品添加剂开发和药品原料开发奠定理论基础，此研究也是大力发展水果加工，保持农村经济的持续健康发展、促进农民收入增加的主要措施之一 O
[0017]乙醇通过降低多糖水溶液的介电常数，增加溶质分子的静电作用力，多糖发生聚合析出，另外乙醇减少多糖与水的作用，使多糖脱水而相互聚集沉淀。由表2可知，一定浓度的乙醇对应沉淀一定量的多糖，采用高速剪切乳化结合复合酶二次破壁方法提取，不同浓度有机溶剂变温渗透沉淀制备多糖，不同级份多糖含量有差异，柚皮多糖提取率为10.398/10(^，其3粗多糖中的多糖为5.6 g/100g柚粉，b粗多糖中的多糖为1.9 g/100g柚粉，c粗多糖中的多糖为1.8 g/100g柚粉。然而现有技术采用水提醇沉淀法提取了柚皮多糖，纯化后其平均收率为6.92%;采用石油醚回流脱脂，热水提取沙田柚柚皮多糖的方法，测得柚皮水溶性多糖含量是7.28%。
[0018]本发明的提供的a、b和c粗多糖在烟草保润上有很好的功用，保润的效果好。【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为液料比对酶法提取柚皮多糖得率的影响。
[0020]图2为酶用量对酶法提取柚皮多糖得率的影响。
[0021]图3为酶解时间对复合酶提取柚皮多糖得率的影响。
[0022]图4为酶解温度对复合酶提取柚皮多糖得率的影响。
[0023]图5为a粗多糖分子量色谱图。
[0024]图6为b粗多糖分子量色谱图。
[0025]图7为c粗多糖分子量色谱图。
[0026]图8为不同分级的柚皮多糖在醇溶条件下自身水分散失率变化。
[0027]图9为不同分级的柚皮多糖在水溶条件下自身水分散失率变化。
[0028]图10为不同浓度的柚皮多糖对载体烟叶保润性的影响。
[0029]图11为不同溶剂对柚皮a粗多糖保润性的影响。
[0030]图12为不同溶剂对柚皮b粗多糖保润性的影响。
[0031]图13为不同溶剂对柚皮c粗多糖保润性的影响。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0033]实施例1
51.取柚皮，根据柚皮重量，加入纤维素酶1.5%和果胶酶1.5%，在50°C下，加入水，所述的水和柚皮的重量比为25:1，高剪切分散乳化机10000r/min下处理lOmin，酶解1.5小时，得酶解液，取一部分酶解液，浸提，得到多糖含量为9.49%
52.取SI所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为45~55%，温度25°C_4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一为a粗多糖的得率为13.12%，a粗多糖中多糖的纯度为42.2%，纯化后a多糖得率为5.6%，
53.取步骤S2所得的上清液一加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为65~75%，温度250C -4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二为b粗多糖的得率为4.38%，b粗多糖中多糖的纯度为42.8%，纯化后b多糖得率为1.9%，
54.取步骤S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为85~95%，温度250C -4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三为c粗多糖的得率为3.20%, c粗多糖中多糖的纯度为56.2%，纯化后c多糖得率为1.8%。
[0034]实施例2料液比、酶量、酶解时间和酶解温度对提取的影响。
[0035]一、材料
蜜柚采自梅州柚子园，选择同品种、大小、果色均匀、成熟度基本一致，无机械损伤、无病虫侵染等蜜柚作为试验材料。将果皮切成薄片后在恒温干燥箱进行烘干，粉碎机将其磨成粉末备用。试剂为分析纯葡萄糖，无水乙醇，丙二醇，5%苯酚，浓硫酸，去离子水，氯仿，正丁醇，活性炭等均购于广州一马生物科技有限公司。果胶酶:天津酶制剂厂；纤维素酶:上海伯奥生物科技有限公司。
[0036]二、仪器DU-730型紫外可见分光光度计(日本岛津分析仪器厂)；恒温水浴锅(广东环凯微生物科技有限公司);电热恒温培养箱(上海索谱仪器有限公司);旋转蒸发器RE-52AA (上海亚荣生化仪器厂)；凝胶渗透色谱(美国Waters公司)；
二、实验方法
(O复合酶提取制备柚皮多糖条件优化 ①液料比对多糖得率的影响
准确称量30g柚粉，纤维素酶和果胶酶的酶均在添加量1%、温度45°C、pH6.5，液料比分别按10:1、15: 1,25: 1,30: 1,35:1处理，高剪切分散乳化机10000r/min下处理IOmin混匀,恒温酶解,反应结束后，将其置于100°C水浴中IOmin使酶灭活,冷却至室温,离心，在上清液中加入无水乙醇至最终浓度为80%，4°C静置过夜，置于4000r/min离心机中离心20min,收集沉淀。测定沉淀物多糖含量及计算得率。
[0037]②酶解时间对多糖得率的影响
准确称量30g柚粉，纤维素酶和果胶酶的酶均在添加量1%、温度45°C、pH6.5，酶解时间分别按 30、60、90、120、150、180m i η 处理，同上。
[0038]③酶解温度对多糖得率的影响
纤维素酶和果胶酶的酶均在添加量1%，液料比、酶解时间和PH按照确定的最佳值，酶解温度分别按40、45、50、55、60、65°C处理，同上。
[0039]④酶添加量对多糖得率的影响
酶解时间、液料比、酶解温度和PH按照确定的最佳值，酶添加量分别按0.5%、1%、
1.5%、2%、2.5% 和 3% 处理，同上。
[0040]⑤复合酶法正交试验
根据单因素试验结果，用正交试验对影响提取的因素:酶解时间、复合酶添加量、液料比及酶解温度进行条件优化。
[0041](2)柚皮多糖的提取分级制备
有机溶剂沉淀分级法---------------参照史军花等方法
按照优化工艺条件提取多糖，在200mL的柚皮提取浓缩液中，加入无水乙醇400mL和去离子水200mL，配制成乙醇浓度为50%的混合液。将混合液于温度25°C _4°C变温醇析。将醇析后的混合液，在4000 r/min离心机下，进行沉淀分离，用烧杯分别收集沉淀物和柚皮澄清液，沉淀物即50%的乙醇沉淀的柚皮粗多糖，编号为a粗多糖。如上述方法，分别采用70%,90%的乙醇继续醇沉柚皮澄清液，分别得到b粗多糖、c粗多糖。将a粗多糖、b粗多糖、c粗多糖冷冻干燥备用。
[0042]3.多糖含糖量的测定采用苯酚-硫酸法[8]
多糖得率(%)=[多糖质量(g) /原料质量(g) ] X 100%
4.多糖分子量测定采用Waters凝胶渗透色谱(。
[0043](3)结果与分析
1、液料比对酶法提取柚皮多糖得率的影响
不同的液料比会影响到提取溶剂对活性物质的溶解情况。复合酶提取料液比对多糖得率的影响如图1所示。由图1可知，多糖得率随液料比的增加而逐渐升高，20:1时达到最大，之后继续增大液料比，多糖得率平缓到30:1，随后下降。有这样的趋势可能是因为液料比过低，活性物质不能充分溶解，影响到提取率。随着液料比的过多增加，稀释了体系使酶浓度降低，酶与底物的结合不充分，多糖得率下降。考虑到成本，选择15: 1-25:1为柚皮多糖提取的最适液料比。
[0044]2、复合酶量对酶法提取柚皮多糖得率的影响
每种酶在反应体系中的加入量对多糖的得率有很大影响，酶用量对多糖得率的影响见图2。由图2可见，随着酶用量的增加，酶与底物接触机会增加，多糖得率随之升高。当酶量大于1.5%时，多糖得率下降，原因可能是酶的种类不同，活性中心结构不同，空间结构不同，由于当酶浓度升高到一定程度，酶分子过于饱和，一部分没有机会与底物结合，酶解速度降低，因此，酶用量范围果胶酶和纤维素酶为f 2%较理想。
[0045]3、酶解时间对酶法提取柚皮多糖得率的影响
浸提时间影响到溶剂与不同细胞位置活性物质的接触，并将其溶解提取出来。浸提时间越长，溶剂能够充分渗透到柚皮细胞组织的各个部位，与活性物质充分接触溶解，从而提高产率。由图3可知，当酶解时间为90min时，多糖的提取率最大，超过120min，多糖提取率反而下降。因此，选择60-120min为柚皮多糖提取的最适酶解时间。
[0046]4、酶解温度对酶法提取柚皮多糖得率的影响
酶解温度对复合酶提取柚皮多糖得率的影响如图4所示，由图4可知，随着温度的升高多糖提取率也升高，两种酶最适温度不同，果胶酶50°C~55°C、纤维素酶45°C时得率达至最大，因为随着温度升高，分子运动速度加快，渗透、扩散、溶解速度加快，同时，高温可以引起细胞膜结构的变化，弱化或破坏了细胞壁的完整性，使多糖易于从柚皮的外层细胞转移到溶剂中。继续升高温度，酶蛋白开始变性，酶活力减弱直至完全丧失，反应速度亦逐渐降低，多糖得率随之下降。综合考虑，选择45-50°C最适酶解温度。
[0047]5、正交试验优化复合酶提取柚皮多糖工艺
正交试验结果由表1可知，影响柚皮多糖得率的各因素主次次序为由表1可知:按极差的大小顺序是B>C>A>D，B为主要因素，C次之，A再次之，D是次要因素。由极差分析各因素的最佳试验组合为A2B3C3D2,实际组合为A1B2C2D2,浸提得率为9.49%。，通过验证，确定最佳组合为A2B3C3D2，即酶用量1.5%、酶解时间120 min、料液比1: 25、酶解温度50°C，浸提得率为10.39%。
[0048]表1正交试验结果
【权利要求】
1.一种蜜柚柚皮多糖的提取分级方法，其特征在于，包括以下几步， S1.取柚皮，根据柚皮重量，加入纤维素酶0.5-5.0%和果胶酶1.0-3.5%，在45-60°C下,加入水,所述的水和柚皮的重量比为10-35:1，高剪切分散乳化机10000r/min下处理2-20min，酶解1-2.5小时，得酶解液， S2.取SI所得的酶解液，加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为45~55%，温度25°C_4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物一和上清液一，所得的沉淀物一为a粗多糖， S3.取步骤S2所得的上清液一逐步加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为65~75%，250C -4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物二和上清液二，所得的沉淀物二为b粗多糖， S4.取步骤S2所得的上清液二加入乙醇使得溶液中乙醇的浓度为85、5%，250C_4°C变温醇析，离心，离心得沉淀物三和上清液三，所得的沉淀物三为c粗多糖。
2.根据权利要求1所述的提取分级方法，其特征在于，所述的纤维素酶用量为0.5-5.0%，果胶酶用量为1.0-3.5%，所述的酶解时间为1-2.5小时，水和柚皮的重量比为10~35:1，酶解的温度为45-60°C。
3.根据权利要求1所述的提取分级方法，其特征在于，所述的蜜柚为梅州金柚、沙田柚。
4.一种蜜柚柚皮a粗多糖,其特征在于,经Waters凝胶渗透色谱分析得,所述的a粗多糖的峰①的重均分子量为24100Da,数均分子量为21300Da,峰位分子量为28540 Da,分子量分布宽度为1.13。
5.根据权利要求4所述的蜜柚柚皮a粗多糖，其特征在于，所述的a粗多糖的峰②的重均分子量为2180Da,数均分子量为2060Da,峰位分子量为2650 Da,分子量分布宽度为1.06。
6.—种蜜柚柚皮b粗多糖,其特征在于,经Waters凝胶渗透色谱分析得,所述的b粗多糖的峰①的重均分子量为11700Da,数均分子量为11200Da,峰位分子量为13540Da,分子量分布宽度为1.04。
7.根据权利要求6所述的蜜柚柚皮b粗多糖，其特征在于，所述的b多糖的峰②的重均分子量为1920Da,数均分子量为2030Da,峰位分子量为2390 Da,分子量分布宽度为1.05。
8.—种蜜柚柚皮c粗多糖,其特征在于,经Waters凝胶渗透色谱分析得,所述的c多糖的峰①的重均分子量为2130Da,数均分子量为1890Da,峰位分子量为2540Da,分子量分布宽度为1.12。
9.一种根据权利要求1所述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在保润方面的应用。
10.一种根据权利要求1所述的制备方法获得的a粗多糖、b粗多糖或c粗多糖在烟草保润方面的应用。
【文档编号】A24B15/40GK103509132SQ201310449231
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】冯志斌, 陶红, 郭文, 卓浩廉 申请人:广东中烟工业有限责任公司