一种用于检测番茄斑萎病毒的nasba方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法，所用于检测TSWV的NASBA引物，其引物序列分别为SEQ ID NO:1～2。发明根据TSWV的N基因高度保守区的设计了两个特异性内引物，该保守基因序列为具有TSWV的不同株系所共有，以保证从株系的水平上检测不同来源的TSWV的可靠性。本发明适用于对TSWV进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监控、进出口贸易中该病毒的确证。
【专利说明】-种用于检测番茄斑萎病毒的NASBA方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原检测【技术领域】，具体涉及一种用于检测番茄斑萎病毒的 NASBA方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，番爺斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV)以其广泛的寄主范围 和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。在20世纪60?80 年代，该病毒曾在欧美及非洲的烟草和番茄上大流行，每年的发病率为20 %?50 %，造成 高达数10亿美元的损失。在美国夏威夷、巴西、意大利和南非，TSWV在20世纪80?90年 代的流行曾导致番茄、莴苣等作物近乎绝产。近年来，番茄斑萎病毒属病毒特别是TSWV，已 成为全世界引起多种经济作物和观赏植物极大经济损失的重要因子。
[0003] 我国目前种植的辣椒、洋葱、生菜等蔬菜种子很多来自于世界各地，尤其是番茄种 子基本依赖进口，进口国别包括美国、日本、荷兰、泰国等国，这些进口国目前都有番茄斑萎 病毒的发生与报道，我国口岸曾于2012年在进境的种子中截获TSWV病毒。而传统的TSWV 检测及确证方法一般通过生物寄主、形态学试验判定植株是否具有植物病毒，这些方法费 时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要。
[0004] 目前针对该病毒的检疫鉴定主要局限在电镜技术、血清学技术以及RT-PCR等传 统检测技术，如ELISA方法，分子杂交，荧光定量PCR方法，普通PCR方法等等，但在这些方 法中，血清学、杂交技术检测灵敏度低，操作步骤繁琐，周期长；电镜、荧光PCR技术依赖大 型仪器，因此很多实验室在仪器配置和检测能力上无法达到要求。另外，由于番茄斑萎病毒 为单链RNA病毒，易于降解，以上方法操作的复杂性与灵敏度限制了对该病的检测与预报。 应用PCR技术检测虽然灵敏，但目前的检测实践表明经常出现检测假阳性或假阴性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测TSWV的NASBA方法，即利用具有高灵敏性和特 异性的引物引导，在含有T7RNA聚合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及反应缓冲液所 组成的反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增，对 样品中的番茄斑萎病毒进行准确的检测。
[0006] 本发明首先提供一种用于检测TSWV的NASBA引物，其引物序列分别为SEQ ID N0:1 ?2。
[0007] NA-P1:5 ' -aattctaatacgactcactatagggagTGTCAGTGGCTCCAATCCTG-3 '
[0008] NA-P2:5 ' -aattctaatacgactcactatagggagGCTTTGTTGACACAAGGCAAAG-3 '。
[0009] 本发明还提供一种检测TSWV的试剂盒，包含有如下的组分
[0010] I) NASBA扩增反应液A :
[0011] 每 25μ L 包括 10XAMV buffer 2· 5μ 1，6· 25mmol/L NTPs 3μ L，lOmmol/L dNTPs I. 5 μ L，10 μ mol/L 弓丨物 ΝΑ-PI、NA-P2 各 0· 5 μ L，双蒸水 9ml ;
[0012] 其中 10XAMV buffer 为含 40mmol/L ΡΗ8· 5 的 Tris-HCL，70mmol/L KCL，12mmol/ L MgCL2,5mmol/L DTT 的缓冲液；
[0013] 2) NASBA扩增反应液B:
[0014] 所述的NASBA扩增反应液B包含有：0· 5U RNaseH，32U T7RNA聚合酶，6. 4U AMV反 转录酶,2 μ L DMS0,0· 1 μ Llmol/L 二硫苏糖醇，0· 25 μ L lOmg/mL BSA，20U RNA 酶抑制剂，
[0015] 上述的试剂盒用于检测TSWV，包含有如下的步骤：
[0016] 1)样品RNA的提取
[0017] A、取0. Ig样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入 1mT, Trizol Reagent，颠倒混勻，2°C?8°C，12000g，离心 IOmin ;
[0018] B、取上清，15°C?30°C，放置5min;加入0. 2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振 荡），约 15s，15--3(TC，放置 2min ?3min ;2°C?8°C，12000g，离心 15min ;
[0019] C、吸取600μ?的上层水相，加500μ?异丙醇混合上清液，15°C?30°C，放置 IOmin ;2°C?8°C，12000g，离心 IOmin ;
[0020] D、去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗涤；2°C?8°C，7500g，离心5min ;
[0021] E、去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μ L?50 μ L无 RNase的水中，即为 待检模板RNA ;
[0022] 2)进行 TSWV 的 NASBA 扩增
[0023] Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检
[0024] Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
[0025] Β、在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5min ;
[0026] C.在反应管中迅速加入4 μ L反应液B ;
[0027] D.于 41°C 温育 2h;
[0028] E.将金属浴调到4 C中止反应，3min后取出；
[0029] 3)电泳检测
[0030] 取3g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓 度为0. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移 至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。如果扩增片段为235bp，说明待检病毒是 TSWV，如果没有出现235bp扩增片段，则说明待检病毒不是TSWV。
[0031] 本发明根据TSWV的N基因高度保守区的设计了两个特异性内引物，该保守基因序 列为具有TSWV的不同株系所共有，以保证从株系的水平上检测不同来源的TSWV的可靠性。 本发明适用于对TSWV进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监控、进出口 贸易中该病毒的确证。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
[0033] 第一，便捷性。该发明在进行恒温扩增时，不需要昂贵的核酸扩增反应装置，整个 过程始终在42°C进行，无需热循环仪，仅1个普通的恒温水浴锅就可完成。
[0034] 第二，精确度高。该发明酶循环反应的循环数少，不需高温变性步骤，相对于 RT-PCR错配率较低，更适于检测和定量特异RNA。
[0035] 第三，灵敏度高。该发明比起PCR技术，能用较少的循环便扩增出大量的目的基 因，保证了检测的高敏感性。
[0036] 第四，缩短周期。由于反转录过程被直接合并到扩增反应中，PCR大约需要20轮 循环才能扩增IO 6倍，而NASBA只需循环4?5轮即可达到IO6倍。
[0037] 第五，降低了对植物RNA模板的质量要求。由于细胞壁中富含大量的多糖、酚类物 质，植物病毒RNA的提取存在着稳定性差、重复性低、效率低等问题，加之在提取过程中RNA 本身的自降解现象，病毒RNA的含量往往较低，对检测方法的灵敏度和稳定性提出了较高 要求。由于该发明针对的模板是RNA，反应的产物也是RNA，反应的结果不受环境中DNA的 影响。即使存在外来的双链DNA污染，但由于其不具备T7启动子序列，不可能被扩增，其 次，该反应只在42°C恒温条件下进行，不需高温变性步骤，所以NASBA反应流程不会受到外 来双链DNA的污染，因此对于模板纯度和质量要求较低。
【专利附图】
【附图说明】：
[0038] 图1为本发明对病株样品中NASBA扩增图谱：其中M:ssRNA Ladder marker ;1 : TSWV感病材料；2 :健康番茄。
[0039] 图2特异性结果图：其中M:ssRNA Ladder marker ;1 :番爺斑萎病毒；2 :阴性对 照；3 :烟草环斑病毒；4 :番茄黑环病毒；5 :黄瓜花叶病毒；6 :番茄花叶病毒；7 :番茄黄化 曲叶病毒。
[0040] 图 3NASBA 灵敏度检测图谱：其中 M: ssRNA Ladder marker ; 1 ?6 :1. 56X 1CT1、 1. 56Χ1(Γ2、1· 56Χ1(Γ3、1· 56Χ1(Γ4、1· 56Χ1(Γ5、1· 56Xl(T6ng/y LTSWV 感病材料总 RNA。
[0041] 图 4PCR 灵敏度图谱：其中 M:DNA D2000marker ;1 ?6 :1. 56父10'1· 56ΧΚΓ2、 1. 56 X 10' 1. 56 X 1(Γ4、1. 56 X 1(Γ5、1. 56 X l(T6ng/ μ LTSWV 感病材料总 RNA。
[0042] 图5 :实际样品检测：其中Μ: ssRNA Ladder marker ; 1?9 :实际样品。
【具体实施方式】
[0043] NASBA (Nuleic and sequence based amplipicain, NASBA)即"核酸序列依赖性扩 增"检测技术是一种经典的恒温扩增技术，适用于单链核糖核酸RNA -步扩增及检测，已广 泛应用于人类及动植物病原的检测与诊断。NASBA是由一对引物引导的，在含有T7RNA聚 合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各种反应缓冲液所组成的标准反应体 系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增。
[0044] 本发明首先依据TSWV核衣壳蛋白（nucterotein，N)设计特异性引物；再提取待测 样品的核糖核酸（RNA)，然后分别以N基因的特异性引物进行NASBA扩增；用琼脂糖凝胶电 泳对扩增产物进行检测，最后根据NASBA扩增结果来判定样品中是否含有TSWV。
[0045] 本发明实施例所使用的材料信息如下：
[0046] 1、病毒
[0047] 番茄斑萎病毒采自云南楚雄开放种植的田间植株果实，烟草环斑病毒（Tobacco ring spot virus, TRSV)分离自进口日本甜叶菊、番爺黑环病毒（Tomato black ring virus, TBRV)分离于意大利黄瓜种子的黄瓜花叶病毒（Cuccumber mosaic virus, CMV)与 番爺花叶病毒（Tomato mosaic virus, ToMV)分离于智利西瓜种子的番爺黄化曲叶病毒 (Tomato yellow curl virus, ToYCLV)分离于青岛番爺种植区。
[0048] 2、试剂
[0049] 反转录聚合酶AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7RNA聚合酶、dNTP、ssRNA marker、 rNTP均购于NEW ENGLAND BIOLAB公司；PCR扩增试剂、DNA marker及等均购于北京天根公 司。
[0050] 下面结合实施例对本发明进行详细的说明
[0051] 实施例1 :引物的设计
[0052] 根据NCBI核酸序列数据库中TSWV的N基因全长序列（KC294570. 1 (昆明分离 物）、HM581936. 1 (南京分离物）、JF730744. 1 (韩国分离物）、HM180089 (台湾分离物）、 HQ406984. 1 (美国分离物）、KC494503. 1 (新西兰分离物）、KM379142. 1 ( 土耳其分离物）、 KF146703. 1(委内瑞拉分离物）），在保证扩增的兼并性和通用性的前提下通过比较分析 TSWV N基因的高度保守区，设计5'端带有T7启动子序列NASBA反应引物（NA-P1\NA-P2、 NA-P3\NA-P4)，设计完成后将引物在数据库的Primer-Blast模块下进行比对验证。其中 NA_P3\NA_P4 的序列分别为：NA_P3:5' -aattctaatacgactcactatagggagTCCTAAGGCTTCCCT GGTGT-3，和 NA_P4:5， -aatt-ctaatacgactcactatagggagGCTTGTCGAGGAAACTGGGA-3'。
[0053] 在对阳性番茄和阴性番茄检测中，以NA-P1\NA_P2为扩增引物对时，TSWV阳性样 品的扩增产物在RNA marker对应235bp左右的位置出现了预期特异的单一条带，而阴性对 照无条带。而以NA-P3\NA-P4扩增引物对时，阳性样品出现了包括预期条带在内的双带，阴 性对照也出现了一条扩增条带，其大小与阳性样品的非预期条带相近。后经测序证实，该条 带的产物为番茄线粒体RNA序列，长为312bp。虽然该产物比NA-P1\NAP2大一些，但极易对 检测结果造成混淆，也容易导致扩增效率的下降。因此，选择引物对NA-P1\NAP2作为本发 明的NASBA检测引物。
[0054] 实施例2 :TSWV的检测
[0055] 1、病毒RNA的提取
[0056] 取0. Ig样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入I. 5mL离心管中，加入ImL Trizol Reagent,颠倒混勻，2 °C ?8 °C，12000g，离心 lOmin。取上清，15 °C ?30 °C，放置 5min ;加入0. 2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），约15s。15°C?30°C，放置2min? 3min ;2°C?8°C，12000g，离心15min。小心吸取约为600μ L的上层水相，勿扰动中间相和 下层相。加50(^1^异丙醇混合上清液，151：?301：，放置101^11。21：?81：，1200(^，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗涤；2°C?8°C，7500g，离心5min。去除 上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μ L?50 μ L无 RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0057] 2、NASBA 扩增体系
[0058] Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
[0059] Β、在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5min，；
[0060] C.在反应管中迅速加入4 μ L反应液B ;
[0061] D.于 41°C 温育 2h;
[0062] E.将金属浴调到4°C中止反应，3min后取出；
[0063] 3、电泳检测
[0064] 取3g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓 度为0. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移 至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。预期产物大小为235bp。见图1。
[0065] 本发明采用NASBA检测TSWV完成以下实验：
[0066] (1)特异性实验
[0067] 1、提取番茄斑萎病毒、烟草环斑病毒、番茄黑环病毒、黄瓜花叶病毒与番茄花叶病 毒、番茄黄化曲叶病毒的RNA，使用NASBA方法进行检测。
[0068] 2、病毒RNA的提取
[0069] 取0. Ig样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入I. 5mL离心管中，加入ImL Trizol Reagent,颠倒混勻，2 °C ?8 °C，12000g，离心 lOmin。取上清，15 °C ?30 °C，放置 5min ;加入0. 2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），约15s。15°C?30°C，放置2min? 3min ;2°C?8°C，12000g，离心15min。小心吸取约为600μ L的上层水相，勿扰动中间相和 下层相。加50(^1^异丙醇混合上清液，151：?301：，放置101^11。21：?81：，1200(^，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗涤；2°C?8°C，7500g，离心5min。去除 上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μ L?50 μ L无 RNase的水中，即为待检模板RNA。 [0070] 3、扩增反应
[0071] Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
[0072] Β、在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5min，；
[0073] C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B ;
[0074] D.于 41? 温育 2h;
[0075] E.将金属浴调到4°C中止反应，3min后取出；
[0076] 4、NASBA产物电泳检测
[0077] 取3g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓 度为0. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移 至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。电泳结果显示，使用NASBA方法进行检测 番爺斑萎病毒、烟草环斑病毒、番爺黑环病毒、黄瓜花叶病毒与番爺花叶病毒、番爺黄化曲 叶病毒的RNA，只有番茄斑萎病毒得到预期235bp的扩增产物（见图2)。
[0078] (2)敏感性比对实验
[0079] 1、用DEPC水将TSWV病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀释，依次为I. 56X 10' 1.56\10'1.56\10'1.56\10'1.56\10'1.56父10-6叩/^1^，各取2 4 1^为模板分别进 行NASBA及RT-PCR扩增反应。NASBA引物选用NA-Pl和NA-P2,PCR引物序列（5' -3'）分 别为：Pl :TGTCAGTGGCTCCAATCCTG 和 P2 :GCTTTGTTGACACAAGGCAAAG
[0080] 2、病毒RNA的提取
[0081] 取0. Ig样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入I. 5mL离心管中，加入ImL Trizol Reagent,颠倒混勻，2 °C ?8 °C，12000g，离心 lOmin。取上清，15 °C ?30 °C，放置 5min ;加入0. 2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），约15s。15°C?30°C，放置2min? 3min ;2°C?8°C，12000g，离心15min。小心吸取约为600μ L的上层水相，勿扰动中间相和 下层相。加50(^1^异丙醇混合上清液，151：?301：，放置101^11。21：?81：，1200(^，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗涤；2°C?8°C，7500g，离心5min。去除 上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μ L?50 μ L无 RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0082] 3、NASBA 扩增反应
[0083] A、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
[0084] Β、在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5min，；
[0085] C.在反应管中迅速加入4 μ L反应液B ;
[0086] D.于 41°C 温育 2h;
[0087] E.将金属浴调到4°C中止反应，3min后取出；
[0088] 4、RT-PCR 扩增反应
[0089] RT-PCR扩增体系参照TIANGEN公司的Quant -步法RT-PCR试剂盒说明配置，反应 条件为 50°C反转录 30min;94°C预变性 2min;94°C 30s，53°C 30s，72°C 30s，循环反应 35 次；65°C延伸 lOmin。
[0090] 5、NASBA产物电泳检测
[0091] 取3g琼脂糖，于IOOmL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓 度为0. 5 μ g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 μ L?6 μ L PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移 至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。NASBA产物鉴定：电泳结果显示，本发明 的引物检测番茄斑萎病毒能够得到1〇_ 4稀释倍数的模板（见图3)，可达到fg级水平，使用 RT-PCR方法能够得到KT3稀释倍数（图4)，只有pg级水平。
[0092] 实施例3 :实际样品检测及对比实验
[0093] 将从云南、山东、四川等地田间采集的具有典型TSWV症状的病样及实验室留样， 分别采用NASBA、RT-PCR进行检测，比较两种方法的效果，以进一步评估NASBA方法的可靠 性。
[0094] 1、实际样品NASBA检测
[0095] 1)病毒RNA的提取
[0096] 取0. Ig样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入I. 5mL离心管中，加入ImL Trizol Reagent,颠倒混勻，2 °C ?8 °C，12000g，离心 lOmin。取上清，15 °C ?30 °C，放置 5min ;加入0. 2mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），约15s。15°C?30°C，放置2min? 3min ;2°C?8°C，12000g，离心15min。小心吸取约为600μ L的上层水相，勿扰动中间相和 下层相。加50(^1^异丙醇混合上清液，151：?301：，放置101^11。21：?81：，1200(^，离心 lOmin。去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗涤；2°C?8°C，7500g，离心5min。去除 上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μ L?50 μ L无 RNase的水中，即为待检模板RNA。
[0097] 2)扩增反应
[0098] Α、在装有14 μ L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 μ L待检模板RNA，
[0099] Β、在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5min，；
[0100] C.在反应管中迅速加入4μ L反应液B ;
[0101] D.于 41。〇温育211;
[0102] Ε.将金属浴调到4 C中止反应，3min后取出；
[0103] 3) NASBA 产物鉴定
[0104] 紫外检测仪下观察电泳结果并记录，电泳结果显示，在9份样品中3份样品为阳 性，其他样品为阴性（见图5)。
[0105] 2、PCR 扩增
[0106] 1)方法：普通RT-PCR反应条件为50°C反转录30min ;94°C预变性2min ;94°C 30s， 53°C 30s，72°C 30s，循环反应 35 次；65°C延伸 lOmin。
[0107] 2)琼脂糖凝胶电泳结果：在9份样品中，3份为阳性，其余为6份。
[0108] 结论：利用上述NASBA和PCR方法同时检测实际样品，两种方法的符合率100%， 但NASBA对设备要求更低，便捷性更高。
【权利要求】
1. 一种检测番茄斑萎病毒的NASBA扩增引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引 物、下游引物的序列分别为SEQ ID NO: 1?2。
2. 权利要求1所述的引物对在检测植物样品中番茄斑萎病毒的应用。
3. -种检测番茄斑萎病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分： 1. NASBA扩增反应液A : 每 25iiL 包括 10XAMV buffer 2.5iil，6.25mmol/L NTPs 3iiL，10mmol/L dNTPs 1. 5 ii L，10 ii mol/L 引物 NA-P1、NA-P2 各 0? 5 ii L，双蒸水 9ml ;其中引物 NA-P1、NA-P2 为权 利要求1所述的上游引物、下游引物； 其中 10XAMV buffer 为含 40mmol/L PH8. 5 的 Tris-HCL，70mmol/L KCL，12mmol/L MgCL2,5mmol/L DIT 的缓冲液； 2. NASBA扩增反应液B: 所述的NASBA扩增反应液B包含有：0. 5U RNaseH，32U I7RNA聚合酶，6. 4U AMV反转录 酶，2 ii L DMS0,0? 1 ii Llmol/L 二硫苏糖醇，0? 25 ii L 10mg/mL BSA，20U RNA 酶抑制剂。
4. 权利要求3所述的试剂盒在检测植物样品中番茄斑萎病毒的应用。
5. -种使用权利要求3所述的试剂盒检测植物样品中番茄斑萎病毒的方法，其特征在 于，所述的方法包括如下的步骤： 1) 样品RNA的提取 A、 取0. lg样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入lmL Trizol Reagent，颠倒混勻，2°C?8°C，12000g，离心 lOmin， B、 取上清，15°C?30°C，放置5min ;加入0. 2mL氯仿，用手剧烈震荡，约15s，15°C? 3(TC，放置 2min ?3min ;2°C?8°C，12000g，离心 15min， C、 小心吸取约为600 y L的上层水相，勿扰动中间相和下层相，加500 y L异丙醇混合上 清液，15°C?30°C，放置 10min，2°C?8°C，12000g，离心 10min ; D、 去除上清液，沉淀中加入lmL 75%乙醇，洗涤；2°C?8°C，7500g，离心5min ; E、 去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 ii L?50 ii L无RNase的水中，即为待检 模板RNA ; 2) 进行TSWV的NASBA扩增 A. 在装有14 y L环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3 y L待检模板RNA， B. 在DNA扩增仪或水浴锅上65°C温浴5min，立即转入41°C温浴5min，； C. 在反应管中迅速加入4 ii L反应液B ; D. 于41°C温育2h; E. 将金属浴调到4°C中止反应，3min后取出； 3) 电泳检测 取3g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为 0. 5 y g/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 y L?6 y L PCR 扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝 胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
【文档编号】C12R1/94GK104404173SQ201410798148
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月21日 优先权日:2014年12月21日
【发明者】吴兴海, 陈长法, 封立平, 王简, 尼秀媚, 王英超, 张云霞, 余冬冬 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心