对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法

对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法
【专利摘要】本发明公开一种对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，利用哺乳动物活精子探针Hoechst 333422和死精子探针PI可被同一紫外光激发出荧光的特点，对猪、牛、羊、犬4种重要家养哺乳动物精子进行荧光染色，准确地进行精子活力评价。与传统的PI/ SYBR-14染色法相比，PI/ Hoechst 33342染色法用Hoechst 33342 取代了昂贵的SYBR-14探针，使检测成本大大降低。本发明成功用于猪、牛、羊、犬等重要家养哺乳动物精子活力的评价，可广泛应用于各种家养哺乳动物的精子活力评价。
【专利说明】对家养晡乳动物精子活力评价的荧光染色法
[0001]

【技术领域】
[0002]本发明属于动物繁殖【技术领域】，尤其涉及对几种重要家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法。
[0003]

【背景技术】
[0004]精子活力(也称精子质膜完整性)评价是精子质量检测中一个必不可少的指标，其检测方法主要有普通染色法、荧光染色法和低渗肿胀实验等，低渗肿胀实验虽然操作简单、价格低廉，但因检测指标单一、无法经流式细胞仪分析等原因现在已很少使用。
[0005]普通染色法常用的染料有曙红(eosin)、曙红-苯胺黑(eosin-nigrosin)、吉姆萨、台盼兰(typan blue)、俾斯麦棕(Bismarck brown Y)、孟加拉玫瑰(Rose Bengal)等。所用的染色方法有仅用一种染料的单染色法，也有同时使用二种或二种以上染料的双染或三染色法。如斯麦棕和孟加拉玫瑰结合使用的双染色法可用于人精子的检测；吉姆萨和台盼兰结合用于牛、猪、兔精子的染色；曙红-苯胺黑染色法用于人精子的检测以及俾斯麦棕、孟加拉玫瑰和台盼兰结合的三染色法用于人、小鼠、马、羊、猪等动物精子的检测中。上述染色法借助普通光学显微镜即可对精子质膜做出检测，但这些方法使用起来比较繁琐，死精子比例会被估计过高，而且不同实验室的检测结果差异较大，因此，非荧光染色法的可信度远不如突光染色法。
[0006]检测精子质膜完整性常用的荧光探针有碘化丙锭(propidium 1dide, PI)、Hoechst 33258、溴化乙淀(EB)、溴乙非唳二聚体(ethidium homodimer, EH)> Yo-Pro-l>SYBR-14、竣基突光素双醋酸盐(carboxyfluorescein diacetate, CFDA)、竣基二甲基突光素双醋酸盐(carboxy dimethyl fluoresccein diacetate, CMFDA)、Carboxy-SNARF-1>SYTO-17等。其中，P1、Hoechst 33258、EB、EH、和Yo-Pro-1是死精子的特异荧光探针，它们只能进入质膜破损的精子与DNA结合，因此只有质膜破损的精子才能被染色。SYBR-14、CFDA、CMFDA、Carboxy-SNARF-l和SYT0-17是活精子的特异荧光探针，它们能够进入细胞膜完整的精子。Carboxy-SNARF-1是一种胞内pH指示剂，在活精子内发橙红色荧光，SYT0-17标记活精子的细胞核，发红色荧光。CFDA和CMFDA是各种非特异性酯酶的底物，它们本身是一类非荧光物质，能够进入细胞并容易被细胞内的非特异性酯酶水解，形成强荧光产物，发绿色荧光，但不能逸出细胞外，因此具有完整细胞膜的精子发绿色荧光。用CFDA和CMFDA评价精子质膜完整性时要严格限定时间，因为细胞内荧光随着时间推移而不断增强。而SYBR-14则很稳定，它能在短时间内与核酸达到平衡。因此，与基于酯酶水解的染色法相比，SYBR-14染色法具有染色不受时间影响及不存在背景染色的优点。
[0007]目前，哺乳动物精子荧光染色法有仅用一种染料的单染色法，也有同时使用二种染料(如PI/SYBR-14，ΡΙ/CFDA联用)的双重荧光染色法，一般认为，在精子活力检测的所有方法中，死精子的特异荧光探针PI与活精子的特异荧光探针SYBR-14的联合应用效果最好，可以很方便地同时检测精子的死活，清楚地将死精子与活精子区分开来。PI/ SYBR-14染色法适合于各种动物精子质膜的检测，经典的报道有将其用于牛、猪、羊、兔子、小鼠、人等物种的精子检测中，在荧光显微镜下，质膜完整的精子呈绿色，质膜破损的精子呈红色，处于由活到死过渡状态的精子则同时发两种荧光。但由于SYBR-14发绿色荧光，若要在检测精子活性时同时检测其顶体完整性就无法兼顾，因为检测顶体的荧光探针大多也发绿色荧光，与同样发绿色荧光的SYBR-14光谱重叠。此外，SYBR-14探针价格昂贵，限制了这一方法的广泛使用。
[0008]Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，也是一种膜通透性活体染料，但是，与其他活体染料不同的是Hoechst 33342能标记活精子和死精子，发蓝色荧光，在此基础上，之前我们研发出PI/ Hoechst 33342精子质膜双重荧光染色法，所不同的是活精子发蓝色荧光，死精子发红色荧光，将其用于猕猴、食蟹猴、大鼠、小鼠等常用实验动物的精子质膜检测中，所得结果与PI/ SYBR-14染色法的结果一致，但由于用Hoechst 33342取代了 SYBR-14，使实验成本大大降低，而且，在检测质膜完整性的同时还可引入顶体探针对精子的顶体完整性做出评价。
[0009]


【发明内容】

[0010]本发明的目的是针对上述现有技术方法中存在的不足，提供对几种重要家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，可广泛应用于各种家养哺乳动物的精子活力评价。经试验，本发明可成功用于猪、牛、羊、犬等重要家养哺乳动物精子活力的评价，而且，用PI/Hoechst 33342双重染色法对猪、牛、羊、犬等动物精子活力进行评价的工作未见报道。
[0011]本发明所采取的技术方案如下:
对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，步骤如下:
(1)猪精子稀释液BTS配制
称取3.69g葡萄糖、0.119g氯化钠、0.0403g氯化钾、0.126g碳酸氢钠、0.125gEDTA和0.005g卡那霉素，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.2，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成猪精子稀释液BTS ；
(2)猪精液处理
取一定体积的新鲜精液，用猪精子稀释液BTS稀释，使精子浓度达10X106个/mL，取l~2mL在离心管中进行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ；
(4)显微镜检测
取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
[0012]对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，步骤如下:
(I)牛精子稀释液配制
牛精子和羊精子稀释液ifepes-0.1% BSA配制称取 0.76g 氯化钠、0.03g 氯化钾、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化钙、0.0lg氯化镁和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.4，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成牛精子稀释液ifepes-0.1% BSA ；
(2)牛精液处理
取一定体积的新鲜精液，用牛精子稀释液H印es-0.1% BSA按质量比1:8进行稀释，血球计数板计数后再用H印es-0.1% BSA调整精子浓度，使精子浓度达30 X 106个/mL，取1- 2mL在离心管中进行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ；
(4)显微镜检测
取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
[0013]对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，步骤如下:
(1)羊精子稀释液配制
称取 0.76g 氯化钠、0.03g 氯化钾、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化钙、0.0lg氯化镁和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.4，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成羊精子稀释液H印es-0.1% BSA ；
(2)羊精液处理
取一定体积的新鲜精液，用羊精子稀释液H印es-0.1% BSA按质量比1:3进行稀释，血球计数板计数后再用H印es-0.1% BSA调整精子浓度，使精子浓度达30 X 16个/mL，取1~2mL在离心管中进行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ；
(4)显微镜检测
取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
[0014]对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，步骤如下:
(1)犬精子稀释液配制
称取2.4 g Tris, 1.4 g朽1檬酸，0.8 g葡萄糖，0.06 g青霉素G钠盐以及0.1 g硫酸链霉素，溶入Mill1-Q超纯水中，混合均匀后加水定容至10mL,调节pH至6.8，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成犬精子稀释液TCG ；
(2)精液处理
取一定体积的新鲜精液，用犬精子稀释液TCG按质量比1:1进行稀释，血球计数板计数后再用稀释液调整精子浓度，使达30 X 16个/mL，取l~2mL在离心管中进行染色；
(3)精子染色
在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ；
(4)显微镜检测
取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
[0015]优选的是，以上所述的精子染色步骤中，蓝色荧光染料H0eChst33342和碘化丙啶PI均为浓度lmg/mL的贮存液，事先用Mill1-Q超纯水配制和分装并保存于_20°C冰箱。
[0016]所述EDTA是乙二胺四乙酸二钠的英文缩写。
[0017]所述Tris是三羟甲基氨基甲烷的英文缩写。
[0018]所述PI是碘化丙啶的英文缩写。
[0019]本发明的优点是:利用哺乳动物活精子探针Hoechst 333422和死精子探针PI可被同一紫外光激发出荧光的特点，对猪、牛、羊、犬4种重要家养哺乳动物精子进行荧光染色，准确地进行精子活力评价。
[0020]由于这二种染料在被光激发后分别发蓝色和红色荧光，故在检测活力的同时还可引入发绿色荧光的染料进行精子顶体完整性的检测，借助荧光显微镜或流式细胞仪对4种重要家养哺乳动物精子活力及顶体完整性做出准确检测。
[0021]此外，与传统的PI/ SYBR-14染色法相比，PI/ Hoechst 33342染色法用Hoechst33342取代了昂贵的SYBR-14探针，使检测成本大大降低。

【具体实施方式】
[0022]以下通过实施例对本发明做进一步描述。
[0023]实施例1:
称取3.69g葡萄糖、0.119g氯化钠、0.0403g氯化钾、0.126g碳酸氢钠、0.125gEDTA以及0.005g卡那霉素，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,用氯化氢或氢氧化钠调节pH至7.2，孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成猪精子稀释液BTS并于37 1:水浴保存；取一定体积的新鲜精液，用BTS适当稀释，使精子浓度达10 X 16个/mL，取I mL至2mL离心管中，加入2yL Hoechst33342和8yL PI，37°C温浴15min ;取8 μ L精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数至少200个精子，本次实际计数了 202个精子，结果为活精子166个，死精子36个，故猪精子活力为82%。
[0024]实施例2:
称取 0.76g 氯化钠、0.03g 氯化钾、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化钙、0.0lg氯化镁、0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.4，孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成牛精子稀释液并于37 1:水浴保存；取一定体积的新鲜精液，用H印es-0.1% BSA进行1:8稀释，血球计数板计数后再用稀释液调整精子浓度，使达30X 16 个/mL，取 I mL 至 2mL 离心管中，加入 2μ L Hoechst33342 和 8 μ L PI，37°C 温浴15min ;取8111^精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数至少200个精子，实际计数了 212个精子，结果为活精子187个，死精子25个，故牛精子活力为88%。
[0025]实施例3:
称取 0.76g 氯化钠、0.03g 氯化钾、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化钙、0.0lg氯化镁、0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.4，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成羊精子稀释液并于37 1:水浴保存；取一定量的新鲜精液，用Hepes-0.1% BSA进行1:3稀释，血球计数板计数后再用稀释液调整精子浓度，使达30 X16 个/mL，取 I mL 至 2mL 离心管中，加入 2μ L Hoechst33342和8 μ L PI，37°C 温浴 15min ;取8 μ L精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数至少200个精子，实际计数了 205个精子，结果为活精子160个，死精子45个，故羊精子活力为78%。
[0026]实施例4:
称取2.4 g Tris, 1.4 g朽1檬酸，0.8 g葡萄糖，0.06 g青霉素G钠盐以及0.1 g硫酸链霉素加入Mill1-Q超纯水中，混合均匀后加水定容至10mL,调节pH至6.8，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成犬精子稀释液并于37 1:水浴保存；取一定体积的新鲜精液，用TCG稀释液进行1:1稀释，血球计数板计数后再用稀释液调整精子浓度，使达30 X 16个/mL，取 I mL 至 2mL 在离心管中，加入 2 μ L Hoechst33342 和 8 μ L PI，37°C温浴 15min ;取 8 μ L精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数至少200个精子，实际计数了211个精子，结果为活精子179个，死精子32个，故犬精子活力为85%。
【权利要求】
1.对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，步骤如下: (1)猪精子稀释液BTS配制 称取3.69g葡萄糖、0.119g氯化钠、0.0403g氯化钾、0.126g碳酸氢钠、0.125gEDTA和0.005g卡那霉素，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.2，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成猪精子稀释液BTS ； (2)猪精液处理 取一定体积的新鲜精液，用猪精子稀释液BTS稀释，使精子浓度达10X106个/mL，取l~2mL在离心管中进行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ； (4)显微镜检测 取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
2.对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，步骤如下: (1)牛精子稀释液配制 牛精子和羊精子稀释液ifepes-0.1% BSA配制 称取 0.76g 氯化钠、0.03g 氯化钾、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化钙、0.0lg氯化镁和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.4，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成牛精子稀释液ifepes-0.1% BSA ； (2)牛精液处理 取一定体积的新鲜精液，用牛精子稀释液H印es-0.1% BSA按质量比1:8进行稀释，血球计数板计数后再用H印es-0.1% BSA调整精子浓度，使精子浓度达30 X 106个/mL，取1- 2mL在离心管中进行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ； (4)显微镜检测 取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
3.对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，步骤如下: (1)羊精子稀释液配制 称取 0.76g 氯化钠、0.03g 氯化钾、0.252g 果糖、0.238g HEPES、0.015g 氯化钙、0.0lg氯化镁和0.1g牛血清白蛋白，溶于Mill1-Q超纯水中并定容至10mL,调节pH至7.4，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成羊精子稀释液H印es-0.1% BSA ； (2)羊精液处理 取一定体积的新鲜精液，用羊精子稀释液H印es-0.1% BSA按质量比1:3进行稀释，血球计数板计数后再用H印es-0.1% BSA调整精子浓度，使精子浓度达30 X 16个/mL，取1~2mL在离心管中进行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ； (4)显微镜检测 取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
4.对家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，步骤如下: (1)犬精子稀释液配制 称取2.4 g Tris, 1.4 g朽1檬酸，0.8 g葡萄糖，0.06 g青霉素G钠盐以及0.1 g硫酸链霉素，溶入Mill1-Q超纯水中，混合均匀后加水定容至10mL,调节pH至6.8，用孔径0.22 μ m滤膜过滤，制成犬精子稀释液TCG ； (2)精液处理 取一定体积的新鲜精液，用犬精子稀释液TCG按质量比1:1进行稀释，血球计数板计数后再用稀释液调整精子浓度，使达30 X 16个/mL，取l~2mL在离心管中进行染色； (3)精子染色 在上述1~2 mL稀释后的精液中，加入2 μ L蓝色荧光染料Hoechst33342和8 μ L碘化丙啶 PI，37°C温浴 15min ； (4)显微镜检测 取8 μ L染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
5.根据权利要求1至4任一项所述的家养哺乳动物精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，所述精子染色步骤中，蓝色荧光染料H0echst33342和碘化丙啶PI均为浓度lmg/mL的贮存液，事先用Mill1-Q超纯水配制和分装并保存于_20°C冰箱。
【文档编号】C12Q1/06GK104498583SQ201410847407
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】杨明华, 李亚辉 申请人:云南农业大学