专利名称：一种精子活力评价及筛选的方法及其专用微流控芯片装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微流控芯片装置及其使用方法，特别是关于一种能够利用不同流速流体对精子活力进行评价及筛选的微流控芯片装置及其使用方法。
背景技术：
精子的活力检测是临床上男性不育的诊断中不可或缺的检测手段之一。世界卫生组织出版的《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》中指出了临床精子检测的常用指标，包括精子的密度检测、形态检查以及活力检查。其中，精子的活力分级指标为a级，快速前向运动(即37°C时速度彡25ym/s) ；b级，慢速或呆滞的前向运动(即37°C 时速度5-25μπιΛ) ；c级，非前向运动(即37°C时速度0-5μπιΛ) ；d级，不动。现有的检测方法，主要是通过显微镜拍摄视频并结合计算机辅助精子分析(CASA)软件，对于精子的运动参数进行评价。然而，现有的显微镜观察方法，只能对于精子进行评价，却不能筛选得到特定速度区段的精子用于后续的体外受精(IVF)或者研究的用途。微流控芯片在精子的评价及筛选的研究中具有很大潜力。在微流控芯片上可以灵活设计各种微管道和微结构，很容易模仿体内的生理状况对精子进行操纵和定位，使受精过程具有很好的可控性；另外，由于微流控芯片具有集成性优势，可以将精子的多指标检测集成在一枚芯片上完成。1993年，美国宾夕法尼亚大学Kricka等人最早利用微流控芯片评价精子活力 (Kricka et al. Clin Chem. 1993，39 1944-7)。美国密歇根大学于 2004 年申请了一项微流控芯片的专利，用于筛选活性较强的精子(WO 2004/108011A1)。该专利利用微流体中的层流效应形成流体界面，活力强的精子游动性强，因此可以穿过该流体界面从另一个出口流出从而达到分离活力强的精子的目的，但是这种方法并不能筛选特定速度的精子，而且芯片具有两个入口和两个出口并且需要形成稳定的流体界面，结构和操作都比较复杂。国立台湾大学于2004年申请了一项微流控芯片的专利用于评价及筛选活性较强的精子(US 2011/0061472A1)，该专利利用流体先对精子施加阻力，活力高的精子到达收缩区域时再被流体运输到出口池。然而，该专利中收缩区域的液体流动方向与精子游动方向相同，并没有实现不同流速流体评价、筛选、捕获不同活力精子的功能，另外，该专利的收缩区域过于狭窄，一次仅允许一个精子通过，使得精子评价与筛选的通量大大降低。1998年德国洪堡大学G. Fuhr等人在Human R印roduction杂志上报到了一款微电极芯片，利用负向介电电泳对于单个精子进行了捕获，通过施加的电场力不同可以捕获不同活性的精子。2010年美国夏威夷大学A. Ohta等人在Lab on a Chip杂志上报到了一款集成有光学系统的微电极芯片通过光镊对精子施加作用力，从而将死活精子加以区分。然而，此类利用电场力或光场力对于精子进行筛选与操控的方法都有可能对所操控精子的健康造成伤害，影响筛选后的精子的质量，从而导致后续体外受精或者研究工作的失败。近些年来，越来越多的研究者发现世界卫生组织给出的临床常规的精子密度、形态以及活力的评价指标并不足以反应男性的生殖能力(Mona Bungum et al. Asian Journalof Andrology 2011,13 :69-75)。最新研究表明，精子DNA的完整性、顶体反应的能力、化学趋向性(Xie et al.Clin Chem. 2010,56 =1270-8)等等指标，也严重影响着精子的受精能力。也就是说，运动速度最快的精子并一定不是受精能力最强的精子，因此对于不同速度的精子进行分级评价，以及对于不同速度区段的精子分别捕获及筛选就有尤为重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种集成式微流控芯片，以解决上述现有技术难以同时评价并筛选出特定速度精子的技术问题。本发明提供的集成式微流控芯片包括至少一根微流体管道所述微流体管道包括流体入口池、样品入口池以及设置在所述流体入口池和样品入口池之间的用于分级的至少 2个流道大小各异的管道区段；所述样品为可自发游动的细胞；所述管道区段内的流道大小从流体入口池至所述样品入口池是依次增大的，流道最大的所述管道区段与所述样品入口池直接连通。在一些实施例中，集成式微流控芯片可以有2根以上的呈辐射状的微流体管道， 这些微流体管道有共同的流体入口池。在一种情况下，流道最小的上述管道区段与所述流体入口池可以直接连通。在另一种情况下，流道最小的上述管道区段与所述流体入口池可以通过一缓冲管道段甲相连通；所述缓冲管道段甲内的流道优选大于所述流道最小的所述管道区段内的流道。上述的至少2个流道大小各异的管道区段中，相邻的管道区段之间可以直接相连通，也可以通过缓冲管道段乙相连通；所述缓冲管道段乙内的流道大小恒定或渐变式变化；所述缓冲管道段乙内各处流道优选大于所述相邻的管道区段中的较小的流道。通常，上述流道大小各异的管道区段可以是指所述微流体管道的横截面面积各异的管道区段。上述微流体管道的横截面为矩形或圆形。所述微流控管道通过内部流道截面面积的变化形成速度不同的稳定流场。管道截面为矩形时，可以通过管道宽度或者深度之一的变化或者两者共同的变化形成变化的截面；管道截面为圆形时，可以通过管道直径的变化形成变化的截面；管道截面为其他形状时，可以通过改变截面的相应尺寸实现变化的截面。有时候，上述流道大小各异的管道区段也可以是指在所述微流体管道内的目的区段处添加尺寸、数量和/或排布方式各异的阻塞物形成的流道大小各异的管道区段。上述阻塞物可以是上皮细胞，所述上皮细胞优选是人或动物的输卵管上皮细胞。为了更加逼真地模拟生理状况，上述微流体管道的管道壁上设置有上皮细胞，所述上皮细胞优选是人或动物的输卵管上皮细胞。上述流道大小各异的管道区段个数可以根据实际需要设置，如3个以上，优选为3 个。3个管道区段内的流道大小的比例可以参照世界卫生组织出版的《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》中的精子活力分级指标设置，流道的横截面面积优选配比为0.24 1 1.74。
为了更好地使精子向流体入口池游动，上述流体入口池内设有对所述可自发游动的细胞起吸引作用的趋化性物质，所述趋化性物质优选为孕酮、生长因子或葡萄糖。对于精子最明确的物质是孕酮，对于其它细胞或细菌有生长因子、葡萄糖等。
上述微流体管道下层布置至少2个微电极，这样可以形成一个电场力，促使精子向流体入口池游动。上述可自发游动的细胞可以为精子。上述微流体管道的横截面可以为矩形或圆形。所述微流控管道的制作材料可采用聚二甲基硅氧烷、塑料或玻璃等。本发明的另一目的是提供一种利用上述的集成式微流控芯片，将精子按照速度分级的方法。所述的分级的方法包括如下步骤a)加样往所述流体入口池中注入精子的培养液；往所述样品入口池中加入精子；b)速度分级所述精子逆所述培养液流动方向游动，速度各异的精子停留在相应的管道区段中实现速度分级。本发明的又一目的在于提供一种评价精子活力的方法。该评价精子活力的方法，包括如下步骤在上述步骤b)速度分级之后，对所述精子进行拍照或摄像，从而评价精子活力。本发明的再一目的是提供一种将特定速度的精子输送到所述集成式微流控芯片上的目标区域的方法。该方法包括如下步骤在上述步骤b)速度分级之后，使所述速度各异的精子在不同时间到达所述集成式微流控芯片上的目标区域。具体地讲，精子在不同时间到达所述集成式微流控芯片上的目标区域，可以通过停止往所述流体入口池中注入培养液，利用精子自身游动至所述目标区域实现的。或者，精子在不同时间到达所述集成式微流控芯片上的目标区域，可以通过外力作用驱动所述精子至所述目标区域实现的；所述外力优选是电场力、光场力或流体力。在利用外力驱动时，不必须停止往所述流体入口池中注入培养液。上述的集成式微流控芯片或者上述的方法在回收特定速度的精子中的应用也属于本发明的保护范围，此时，上述目标区域是流体入口池。上述的集成式微流控芯片或者上述的方法在进行体外受精研究中的应用也属于本发明的保护范围，此时，上述目标区域是集成式微流控芯片中的体外受精区域。本发明在微流控管道中设计不同截面的管道，形成不同流速的流体，精子的运动方向与流体方向相反，当流体的流速与精子的前向运动速度相等时，精子就被捕获在相应的位置。本发明的微流控芯片装置的具体使用方法，可以包括以下步骤1)在微流控管道中形成稳定的不同流速的流场在流体入口注入培养液，因为管道截面面积的变化形成的流场流速不同；幻精子筛选过程在精子入口池加入精子，精子逆流体方向游动，当其前向运动速度与流体速度相等时，即被捕获在该处。经过一段时间，不同速度的精子会被捕获在流体管道的不同区段。幻结果记录过程通过明场显微镜或者荧光染色的方法对捕获在不同位置的精子进行拍照或者摄像，可以通过人眼或者计算机软件对精子进行计数；也可以关闭流场，使精子在静止流场中游动，通过拍照或者摄像的方法分析其运动参数。4)精子回收或运输过程对于按照速度分级捕获的精子，可以关闭分选流场，利用精子的自由游动， 或者施加电场力、光场力、流体力等方式把精子运输到出口池并加以回收，进行后续的体外受精或者研究；或者用上述方式将精子分别运输到芯片上的特定区域，在芯片上集成地完成体外受精或者其他研究。在上述步骤4)中，当精子的速度分级结束后，可以利用精子的自由游动或者电场力、光场力、流体等方式把精子运输到出口池取出，进行后续的体外受精或者研究。在上述步骤4)中，当精子的速度分级结束后，可以利用精子的自由游动或者电场力、光场力、流体等方式把精子运输到芯片上的特定区域，进行后续的体外受精或者研究。在上述步骤1)或4)中，在出口池可以放有对精子产生吸引作用的趋化性物质，促使精子向出口池游动。上述微流控芯片装置及其使用方法的用途广泛，包括但不限于人精子的检测用于男性不育的诊断；人精子的筛选用于辅助生殖领域；动物精子的检测和筛选用于育种； 人或动物的精子检测和筛选，均可以用于科学机理的研究；用于除精子外其它可自发游动的细胞，用作其活动力的筛选或科学机理的研究。本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点1、本发明的微流控芯片通过变截面管道形成不同流速的流场，结构简单、制造工艺简便、操作方便。2、本发明的微流控芯片以变截面管道形成不同流速的流场模拟生理环境，相比现有的光学、电学等手段对于精子造成的伤害小，有助于后续的辅助生殖技术的成功，也有助于科学研究中真实反映精子的状态。3、本发明的微流控芯片对于精子活力筛选的定量性更强，可以直观地统计处不同速度区段精子占总数的比例，有利于男性不育的诊断；也可以按照要求回收特定速度区段的精子，从而满足辅助生殖领域和生殖生物学研究中的需求。4、本发明在微流控芯片上实现了精子的活力筛选，便于将其它精子评价指标集成在一张芯片上完成，实现精子的多指标集成评价与筛选。综上所述，本发明的微流控芯片成本低廉，集成性高，操作方便，可广泛用于人或者动物的精子评价及筛选，甚至用于其它能够自发运动的细胞或生物的活动力筛选，在辅助生殖领域和受精机制研究中具有广阔的应用前景。
图1是本发明微流控芯片的一实施例示意图。图2是本发明微流控芯片的一个实施例的三维示意图。图3是本发明一实施例的流场仿真图，其中该仿真图是实体图，颜色的深浅代表该点的流体速度。图4是本发明一实施例的流场仿真曲线与实际测量结果。图5是本发明一实施例的精子活力分级结果。图6是本发明微流控芯片的另一个实施例示意图。图7是本发明另一个实施例的流场仿真图，其中，该仿真图一定是实体图，颜色的深浅代表该点的流体速度。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。本发明中的流道是指微流体管道内流体的通道。本发明中的流道大小是指流体通道的横截面面积的大小。实施例1、微流控芯片如图1所示，本发明的微流控芯片包括一根横截面为矩形的微流体管道，该管道的两端设置有流体入口池1和精子入口池2，在流体入口池1和精子入口池2中间由管道A 段，B段，C段及D段组成，宽度分别为1，0. M，1及1. 74mm,深度均为25 μ m。B, C，D三段的管道宽度不断增大，而其宽度的比例是参照世界卫生组织发布的精子速度分级评价标准设置的。由于本发明中微流体管道横截面为矩形，横截面的面积是宽度与深度之积，因此管道的截面积随着宽度而增大，根据流体不可压缩原理，流体的速度随之减小。本实施例的微流体管道中的B，C，D三段是流道依次增大的管道区段，B, C，D三段管道中，相邻的管道之间(如B和C之间、C和D之间)可以直接相连通，也可以通过过渡管道相连通，过渡管道的横截面可以是恒定不变也可以是渐变式变化，只要该横截面面积大于相邻的管道中的较小的管道横截面面积即可，如B和C之间的过渡管道的横截面面积大于管道B横截面面积，C和D之间的过渡管道的横截面面积大于管道C横截面面积。本实施例采用的是相邻的管道之间直接相连通。流道最大的D段直接与精子入口池2相连通， 流道最小的B段通过A段与流体入口池1相连通。本发明的微流体管道中的A段作为缓冲管道段主要用于稳定流体速度，A段内的流道一般大于B段即可，在其他实施例中，只要B、 C、D三段中的流体速度足够稳定，也可省略A段。本实施例的微流控管道的管道壁，由人或动物的输卵管上皮细胞覆盖，从而更加逼真地模拟生理状况。如图2所示，本实施例的微流控芯片由上下两层组成上层采用聚二甲基硅氧烷材料，利用软光刻工艺成形微流体管道；下层是玻璃载玻片，两层通过氧等离子体键合的工艺键合在一起。如图3所示，利用软件对该微流控管道进行仿真，采用Navier-Stokes对三维稳态不可压牛顿流体进行仿真。结果与设计一致，流体速度随着管道宽度的增加而减小。进一步通过混有微珠( 3μπι直径，与精子头部直径相似)的培养液在微流控管道中对于各段的流体速度进行验证。分别采用注射泵两种不同进样的流速0. 1 μ L/min及0. 01 μ L/ min进行验证，前者适合小鼠精子运动速度分级，而后者适合人精子速度分级。结果如图4 所示，其中的曲线分别是管道中心线上流体速度的仿真结果，；而图中的方形点与叉子代表的是实验中利用微珠得到的管道中各个区段真实流速的平均值。以人精速度分级进样所用的0. 01 μ L/min为例，在A，B，C及D段实现的流速分别是5. 61 士0. 89，20. 29士4. 06， 10. 84士 1. 42，3. 00士0. 56 μ m/s,与世界卫生组织发布的现有精子活力评价指标基本一致。 实验结果显示，在此实施例所述的微流控芯片中能够形成预期的不同速度分布的流场，适合完成对于人精子与小鼠精子的速度分级评价与捕获。实施例2、评价精子活力一、精子速度分级
本发明如图1所示的微流控芯片实施例的使用方法包括以下步骤首先，使用注射泵以一定的流速在1正压持续通入培养液(或操作液)，在A，B，C及D段实现稳定而速度不同的稳定流场。流场经过10分钟之后达到稳定，在精子入口池2加入3μ L人精液样本(或者3yL小鼠精子溶液)。精子逆流体方向而上，当到达与其前向运动速度相等的位置时，即合成速度为零，从而被捕获而不能继续运动。因此，在B，C，D三段管道处所捕获的精子活力依次下降，而活力较差的精子以及精液中可能混合的自身无法运动的精原细胞、 上皮细胞、白细胞等被留在入口池2。二、评价各个管段中精子的活力当B，C，D各段的精子捕获结束之后，关闭注射泵停止正压的流体，使精子在静止液体中自由游动。此时，采用倒置显微镜观察并分别录像3个区段的精子运动情况，每个区段随机选取3个视野，每个视野以15帧/秒录像10秒钟。并用ImageJ 1. 42q软件的计算机辅助精子分析(CASA)插件分析精子的各种运动参数。结果表明各个区段的精子直线运动速度存在显著性差异，B, C，D段精子的平均直线运动速度分别为40. 5士3.0，27. 2士0.6 及 18. 7士0. 6ym/s。实施例3、回收或研究特定速度的精子当需要将不同速度的精子取出时，停止往所述流体入口池中注入培养液，管道内的流体静止。精子因自身的游动继续前进，到达1池。因为不同活力的精子已经被捕获在 B，C，D三段管道处，而速度最快的精子恰距离流体入口池1最近，因此不同活力的精子会在不同时间到达流体入口池1，便于回收筛选后的精子。当然，也可采用如下两种方式回收不同速度的精子。1、在1池施加负压，使用流体将已经被捕获在B，C，D三段管道的不同活力的精子运输到出口池，不同活力的精子距离流体入口池的距离不同，因此会在不同时间到达出口池1，便于回收筛选后的精子；2、在管道下层布置一系列微电极，再利用细胞介电电泳得作用将已经被捕获在B，C，D三段管道的不同活力的精子，分批地运输到出口池，便于回收筛选后的精子。如果在筛选得到特定速度的精子后不进行回收，而直接进行相关研究如体外受精，可以不将精子运送到流体入口池1，直接将精子运用同样的输送方式运至微流控芯片的目标区域。实施例4、另一种微流控芯片如图6所示是本发明微流控芯片的另一个实施例。管道的截面为矩形，不同区段的不同速度同样通过改变截面获得，所不同的是采用管道中央的一系列宽度变化的隔离墩实现截面的变化。为了在管道中实现不同的流道大小，可以调整隔离墩的数量，或调整每个隔离墩的宽度。隔离墩可以是任意形状，优选的方式是在流体流动方向上隔离墩的两端均是锐角，这样精子游动不会被隔离墩阻挡，本实施例隔离墩采用的是六边形。图7是本实施例微流控芯片的流场仿真图。如图6所示，入口池3为流体的进样池，入口池4为精子的进样池；池3至池4之间的微流体管道依次分为A'、B'、C'和D'四段，其中，B'、C'和D'各段内部的隔离墩的宽度逐渐减少，数量也逐渐减小(D'段内隔离墩数为0)，因此流道截面积逐级增大，流体速度逐渐减小。A'段作为缓冲管道段主要用于稳定流体速度，A'段内的流道一般大于 B'段即可，本实施例中A'段与D'段内均无隔离墩，故流道横截面积是一样的。
本发明仅以上述实施例进行说明，各部件的结构、设置位置、及其连接都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。
权利要求
1.一种集成式微流控芯片，其特征在于，包括至少一根微流体管道所述微流体管道包括流体入口池、样品入口池以及设置在所述流体入口池和样品入口池之间的用于分级的至少2个流道大小各异的管道区段；所述样品为可自发游动的细胞；所述管道区段内的流道大小从流体入口池至所述样品入口池是依次增大的，流道最大的所述管道区段与所述样品入口池直接连通。
2.如权利要求1所述的集成式微流控芯片，其特征在于流道最小的所述管道区段与所述流体入口池直接连通。
3.如权利要求1所述的集成式微流控芯片，其特征在于流道最小的所述管道区段与所述流体入口池通过一缓冲管道段甲相连通；所述缓冲管道段甲内的流道优选大于所述流道最小的所述管道区段内的流道。
4.如权利要求1-3中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述至少2个流道大小各异的管道区段中，相邻的管道区段之间通过如下1)或2、方式相连通1)相邻的管道区段之间直接相连通；2)相邻的管道区段之间通过缓冲管道段乙相连通；所述缓冲管道段乙内的流道大小恒定或渐变式变化；所述缓冲管道段乙内各处流道优选大于所述相邻的管道区段中的较小的流道。
5.如权利要求1-4中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述流道大小各异的管道区段是指所述微流体管道的横截面面积各异的管道区段。
6.如权利要求1-4中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述流道大小各异的管道区段是指在所述微流体管道内的目的区段处添加尺寸、数量和/或排布方式各异的阻塞物形成的流道大小各异的管道区段。
7.如权利要求6所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述阻塞物是上皮细胞，所述上皮细胞优选是人或动物的输卵管上皮细胞。
8.如权利要求1-7中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述微流体管道的管道壁上设置有上皮细胞，所述上皮细胞优选是人或动物的输卵管上皮细胞。
9.如权利要求1-8中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述流道大小各异的管道区段个数为3个以上，优选为3个。
10.如权利要求9所述的集成式微流控芯片，其特征在于3个管道区段内的流道大小的比例参照世界卫生组织出版的《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》 中的精子活力分级指标设置，流道的横截面面积优选配比为0. M 1 1.74。
11.如权利要求1-10中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述流体入口池内设有对所述可自发游动的细胞起吸引作用的趋化性物质，所述趋化性物质优选为孕酮或葡萄糖。
12.如权利要求1-11中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述微流体管道下层布置至少2个微电极。
13.如权利要求1-12中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述可自发游动的细胞为精子。
14.如权利要求1-13中任一所述的集成式微流控芯片，其特征在于所述微流体管道的横截面为矩形或圆形。
15.一种利用权利要求1-14中任一所述的集成式微流控芯片，将可自发游动的细胞按照速度分级的方法，包括如下步骤1)加样往所述流体入口池中注入可自发游动的细胞的培养液；往所述样品入口池中加入可自发游动的细胞；2)速度分级所述可自发游动的细胞逆所述培养液流动方向游动，速度各异的可自发游动的细胞停留在相应的管道区段中实现速度分级。
16.一种评价可自发游动的细胞活力的方法，包括如下步骤在权利要求15的步骤2) 速度分级之后，对所述可自发游动的细胞进行拍照或摄像，从而评价可自发游动的细胞活力。
17.一种将特定速度的可自发游动的细胞输送到所述集成式微流控芯片上的目标区域的方法，包括如下步骤在权利要求15的步骤2、速度分级之后，使所述速度各异的可自发游动的细胞在不同时间到达所述集成式微流控芯片上的目标区域。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于可自发游动的细胞在不同时间到达所述集成式微流控芯片上的目标区域，是通过停止往所述流体入口池中注入培养液，利用可自发游动的细胞自身游动至所述目标区域实现的。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于可自发游动的细胞在不同时间到达所述集成式微流控芯片上的目标区域，是通过外力作用驱动所述可自发游动的细胞至所述目标区域实现的；所述外力优选是电场力、光场力或流体力。
20.权利要求1-14中任一所述的集成式微流控芯片或者权利要求17-19中任一所述的方法在回收特定速度的可自发游动的细胞中的应用，所述目标区域是所述流体入口池。
21.权利要求1-14中任一所述的集成式微流控芯片或权利要求17-19中任一所述的方法在进行体外受精研究中的应用。
22.如权利要求15-21所述的方法或应用，其特征在于所述可自发游动的细胞是精子。
全文摘要
本发明公开了一种精子活力评价及筛选的方法及其专用微流控芯片装置。该集成式微流控芯片包括至少一根微流体管道所述微流体管道包括流体入口池、样品入口池以及设置在所述流体入口池和样品入口池之间的用于分级的至少2个流道大小各异的管道区段；所述管道区段内的流道大小从流体入口池至所述样品入口池是依次增大的，流道最大的所述管道区段与所述样品入口池直接连通。样品(精子)的运动方向与流体方向相反，当精子的前向运动速度与流速相等时被捕获在管道中的相应位置。本发明的微流控芯片结构简单、操作方便、模拟生理环境、对于精子造成的伤害小，在男性不育诊断、辅助生殖领域和生殖生物学研究中具有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/04GK102242055SQ201110148748
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者丘天, 寒超, 程京, 谢兰, 马睿 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学