一种树鼩精子活力评价的荧光染色法
【专利摘要】一种树鼩精子活力评价的荧光染色法，通过以下步骤实现：（1）TALP-HEPES洗精液的配制，（2）精液采集，（3）精液洗涤，（4）染色，（5）显微镜检测；本发明利用Hoechst 333422和PI对死活精子反应的不同及其可被同一波长激光激发出荧光的特点，对树鼩精子进行荧光染色，不用切换光源就可准确地检测精子活力；而且由于这二种染料在激光激发后分别发红色和蓝色荧光，故在检测活力的同时还可引入发绿色荧光的染料进行精子顶体完整性的检测，借助荧光显微镜或流式细胞仪对树鼩精子活力及顶体完整性做出准确检测。
【专利说明】一种树齣精子活力评价的荧光染色法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物生殖生物学【技术领域】，具体是一种树駒精子活力评价的荧光染色法。
【背景技术】
[0002]树駒隶属于攀駒目，是外形类似于松鼠的一类小型哺乳动物，尽管人类对树駒的研究已有200年的历史，但直到20世纪80年代树駒作为模型动物在生物学方面的研究才引起较多的关注，树駒在生理解剖、神经发育、心理应激等方面与灵长类，甚至人类高度相似，而且它们还具有体型小、生殖周期短、繁殖快、饲养成本低等特点，被广泛应用于生物学及医学研究的诸多领域。现在，越来越多的有识之士认为树駒是最有望于替代珍贵的灵长类动物之新型实验动物，开展树駒生殖生物学的研究有助于这类动物的人工繁殖，但是到目前为止，有关树駒生殖生物学的数据极少，至今未发现有与本发明相同或相似的报道。
【发明内容】
[0003]本发明旨在建立一种评价树駒精子活力的荧光染色方法，为树駒精子生物学的研究和树駒繁殖奠定基础。本发明为树駒精子活力评价之荧光染色法的首创。
[0004]本发明所采取的技术方案如下:
一种树駒精子活力评价的荧光染色法，可通过以下步骤实现:一种树駒精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，通过以下步骤实现:
(1)TALP-HEPES洗精液的配制
按每10mL溶液中含氯化钠742 mg、氯化钾23.6 mg、二水氯化|丐29.4 mg、六水氯化镁10.2 mg、葡萄糖90.1 mg、磷酸二氢钠4.8 mg、碳酸氢钠16.8 mg、丙酮酸钠1.1 mg、酹红Img、HEPES 钠 130.2 mg、HEPES 酸 119.2 mg、乳酸钠 60% 水溶液 185 μ L、庆大霉素 5 mg、牛血清白蛋白300 mg的配比，用Mill1-Q超纯水混合均匀，用NaOH或HCl调节pH至7.4，制成TALP-HEPES洗精液；
(2)精液采集
通过外科手术从树駒睾丸中分离出附睾尾和输精管，用TALP-HEPES洗精液冲洗附睾并去除血液和脂肪组织，随后将附睾尾置于含I mL 37 V TALP-HEPES洗精液的小离心管中，用精细手术剪剪碎附睾尾，继续于37 °C孵育10 min让精子游出；
(3)精液洗涤
用精细镊子夹出附睾组织，小心将精子吸至另一 4mL离心管中，加入2mL预热至37V TALP-HEPES洗精液于250g，离心5 min，洗2次，弃上清，沉淀用预热至37 VTALP-HEPES洗精液重悬；
(4)染色
取ImL洗涤后的精液，分别加入2 μ L Η342和8 μ L PI，37°C温浴15min ；
(5)显微镜检测取8μ I染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
[0005]所述步骤中Η342 代表 Hoechst 33342。
[0006]所述步骤中Η342和PI为浓度lmg/mL的贮存液，事先用Mill1-Q超纯水配制、分装并保存于-20°C冰箱。
[0007]本发明的优点是:利用Hoechst 333422和PI对死活精子反应的不同及其可被同一波长激光激发出荧光的特点，对树駒精子进行荧光染色，不用切换光源就可准确地检测精子活力；而且由于这二种染料在激光激发后分别发红色和蓝色荧光，故在检测活力的同时还可引入发绿色荧光的染料进行精子顶体完整性的检测，借助荧光显微镜或流式细胞仪对树駒精子活力及顶体完整性做出准确检测。
【具体实施方式】
[0008]以下通过实施例对本发明做进一步描述。
[0009]实施例:
按每10mL溶液中含氯化钠742 mg、氯化钾23.6 mg、二水氯化|丐29.4 mg、六水氯化镁10.2 mg、葡萄糖90.1 mg、磷酸二氢钠4.8 mg、碳酸氢钠16.8 mg、丙酮酸钠1.1 mg、酹红Img、HEPES 钠 130.2 mg、HEPES 酸 119.2 mg、乳酸钠 60% 水溶液 185 μ L、庆大霉素 5 mg、牛血清白蛋白300 mg的配比，用Mill1-Q超纯水混合均匀，用NaOH或HCl调节pH至7.4，制成TALP-HEPES洗精液，并于37 1:水浴保存；通过外科手术从树駒睾丸中分离出附睾尾和输精管，用TALP-HEPES冲洗附睾并去除血液和脂肪组织，随后将附睾尾置于含I mL 370C TALP-HEPES的小离心管中，用精细手术剪剪碎附睾尾，继续于37 °C孵育10 min让精子游出；用精细镊子夹出附睾组织，小心将精子吸至另一 4mL离心管中，加入2mL预热至37 1:的TALP-HEPES于250g，离心5 min，洗2次，弃上清，沉淀再用预热至37 °〇的TALP-HEPES重悬；取ImL稀释后的精液，分别加入2 μ L Η342和8 μ L PI，37°C温浴15min ；取8 μ I精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数至少200个精子(本次实际计数了 223个精子)，结果为活精子152个，死精子71个，故树駒精子活力为68%。
[0010]上述实例仅仅是为清楚的说明本发明所作的举例，对于所述领域的普通技术人员来说，由此引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【权利要求】
1.一种树駒精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)TALP-HEPES洗精液的配制 按每10mL溶液中含氯化钠742 mg、氯化钾23.6 mg、二水氯化|丐29.4 mg、六水氯化镁10.2 mg、葡萄糖90.1 mg、磷酸二氢钠4.8 mg、碳酸氢钠16.8 mg、丙酮酸钠1.1 mg、酹红Img、HEPES 钠 130.2 mg、HEPES 酸 119.2 mg、乳酸钠 60% 水溶液 185 μ L、庆大霉素 5 mg 和牛血清白蛋白300 mg的配比，用Mill1-Q超纯水混合均勻，用NaOH或HCl调节pH至7.4，制成TALP-HEPES洗精液； (2)精液采集 通过外科手术从树駒睾丸中分离出附睾尾和输精管，用TALP-HEPES洗精液冲洗附睾并去除血液和脂肪组织，随后将附睾尾置于含ImL 37 V TALP-HEPES洗精液的小离心管中，用精细手术剪剪碎附睾尾，继续于37 °C孵育10 min让精子游出； (3)精液洗涤 用精细镊子夹出附睾组织，小心将精子吸至另一 4mL离心管中，加入2mL 37 VTALP-HEPES洗精液于250g，离心5 min，洗2次，弃上清，沉淀用37 V TALP-HEPES洗精液重悬； (4)染色 取ImL洗涤后的精液，分别加入2 μ L Η342和8 μ L PI，37°C温浴15min ； (5)显微镜检测 取8μ I染色后的精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。
2.根据权利要求1所述的一种树駒精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，所述步骤(4)中 Η342 代表 Hoechst 33342。
3.根据权利要求1所述的一种树駒精子活力评价的荧光染色法，其特征在于，所述步骤(4)中Η342和PI为浓度lmg/mL的贮存液，事先用Mill1-Q超纯水配制、分装并保存于-20°C冰箱。
【文档编号】C12Q1/06GK104498584SQ201410847414
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】李亚辉, 杨明华 申请人:云南农业大学