复合植物提取物及其在粮食储藏防霉中的应用的制作方法

本发明涉及食品安全领域，具体地说，涉及一种复合植物提取物及其在粮食储藏防霉中的应用。

背景技术：

植物精油(essentialoils)，也称为挥发性植物精油(volatileoils)，是由植物体内提取的一类分子量较小的次生代谢物，具有高挥发性、脂溶性和低水溶性、安全、无毒等特点，有特殊的香味且香味成分穿透力较强，常温下呈油状液体。植物精油作为抗真菌剂广泛应用在医药和食品行业，并取得了较为理想的抑菌效果(bassoléetal.,2012)。植物精油所含的化学成分复杂多样，往往一种植物精油含有上百种化合物，主要包括萜类化合物、芳香族类化合物、脂肪族类化合物和含氮、含硫化合物。

玉米是我国三大主粮之一，据国家统计局发布的数据显示，2015～2016年度我国玉米产量为22463.16万吨，播种面积38119.31千公顷，其总产量和种植面积仅次于美国，位居世界第二。玉米广泛应用于饲料工业、食品工业，在国民经济和农民生产中起着举足轻重的作用(muchapondwa，2009；刘笑然，2001)。玉米较其他粮油作物耐储性差，究其原因主要是由玉米的储藏特点决定的。玉米胚部组织庞大、疏松、多褶皱、多营养，胚部体积约占总体积的1/3左右，除含丰富的蛋白质、脂肪、淀粉外，还含有微量的ve及胡萝卜素，而且不光滑，亲水性强，极易吸湿，呼吸旺盛，一般害虫、霉菌等对玉米的危害多从胚部开始；再加上气候类型的变化、长途运输等过程极易受到霉菌及毒素的污染，黄曲霉、镰刀菌等霉菌生长不仅造成粮食减产，导致品质劣变，更为严重的是产生具有强毒性和致癌性的黄曲霉毒素(aft)、玉米赤霉烯酮(zea)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don毒素)、伏马菌素(fum)等真菌毒素，严重危害人畜健康、威胁食品安全。曹冬梅(2010)发现吉林、辽宁两省玉米样品don毒素均超过国家限量标准(1000μg/kg)，含量均值分别为1138.11μg/kg和1697.76μg/kg。王燕(2016)等采集了山东省玉米主产县2013-2014年收获和储藏的玉米样品共520批次，发现伏马菌素污染最为严重，超标率达33.46％，并且单一样品受多种毒素混合污染的情况非常严重。确保玉米的安全储藏，最大限度的减少玉米的损失，一直是玉米科技工作者面临的重点任务，因此，预防与控制玉米真菌毒素污染是保障我国粮食安全、食品安全以及维护国家经济利益的重大需求。

玉米储藏中常采用防霉措施由最初的臭氧防霉、磷化铝熏蒸防霉，到近年来的有机酸防霉等。但是，这些化学药品防霉存在以下负面效应，一是有化学毒性残留，二是对环境造成二次污染，三是使粮食中真菌产生抗性，因此有必要寻求更加安全可靠的新型绿色防霉剂。作为一种玉米储藏中的天然防霉剂，植物精油具有来源天然、无毒、抑菌特性强和环境友好等优点，逐渐成为研究热点，并在抑制霉菌生长及产毒方面有着理想的效果，可考虑选用复合植物精油进行玉米防霉方面的研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种复合植物提取物。

本发明的另一目的是提供所述复合植物提取物在粮食(特别是玉米)储藏中预防霉菌及真菌毒素污染方面的应用。

本发明基于以下构思：本发明人前期比较了山苍子油、丁香酚、肉桂醛、柠檬醛、桉叶油、茴香油、樟脑油和薄荷油等50多种植物精油对黄曲霉、镰刀菌、赭曲霉等生长和产毒的抑制效果，发现肉桂醛和丁香酚可有效抑制黄曲霉的生长及产毒，肉桂醛的抑制作用显著高于丁香酚，在玉米碴含水量为13％时100μl/l肉桂醛对afb1的抑制率高达98.9％；柠檬醛和丁香酚均能有效抑制禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌的生长及产毒，在玉米碴含水量为21％时，150μl/l柠檬醛和200μl/l丁香酚对don毒素的抑制率分别达98.3％和95.6％；薄荷油(主要成分为薄荷醇)可显著抑制黄曲霉、禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌的生长及产毒。玉米中常见霉菌为黄曲霉、禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌等，因此本发明选用肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油(33％l-薄荷醇，溶剂为无水乙醇)，复配成复合植物精油防霉剂，通过为期一年的玉米防霉实验，验证该防霉剂对霉菌生长和真菌毒素产生的抑制作用，以及对玉米品质的影响，以期为玉米防霉、保质、安全储藏提供高效、优质的产品。

为了实现本发明目的，本发明提供一种新型的复合植物提取物，有效成分为肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷醇。

前述的复合植物提取物，肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油的体积比为2-5:2-5:1-3:1-3。

优选地，肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油的体积比为3:3:2:2。

本发明所述复合植物提取物的ph值为6.5～7.0。

本发明中，采用食品安全级的碱性物质进行调节ph值，具体可为三乙醇胺或小苏打。对ph值的调节是由于植物提取物中的肉桂醛、柠檬醛，分子上的醛基有部分氢以h⁺解离，使复合植物提取物呈弱酸性，因此需用食品级的碱性物质调节ph至6.5-7.0，防止复合植物提取物酸碱基团对粮油原料及产品外表的侵蚀。

本发明的复合植物提取物可按如下方法制备：各成分按照用量由少到多的顺序依次加入，以便混合更均匀；如果其中两种原料的用量一样，则顺序无先后。

前述方法中还包括混合之后调节ph值的步骤。

本发明还提供一种防霉剂，其是由所述复合植物提取物与具有多孔构造、且具有吸附性能的载体组成。

所述载体包括但不限于硅藻土、高分子树脂、硅酸钙、rerxite、沸石、蛭石等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述防霉剂是由所述复合植物提取物与硅藻土按等质量比混合而成。

本发明进一步提供所述复合植物提取物或所述防霉剂在粮食储藏防霉中的应用。

本发明中，所述粮食包括但不限于玉米。粮食和食品的水分含量均可为0～15％。

具体地，采用在密闭系统中熏蒸的方式处理粮食。所述复合植物提取物占所述粮食的浓度可为100μl/l。

熏蒸条件：所述熏蒸处理的温度可为-10℃～37℃，具体可为28℃、-10℃～28℃、28℃～37℃或10～35℃。所述熏蒸处理的时间可为1～360d，具体可为120d、180d或270d。

前述的应用，所述防霉是指抑制霉菌的生长及产毒，所述霉菌包括但不限于黄曲霉、镰刀菌(包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌)、赭曲霉、青霉、灰绿曲霉等。所述毒素包括但不限于玉米赤霉烯酮(zea)、黄曲霉毒素(aft)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don毒素)、伏马菌素(fum)等真菌毒素。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(一)本发明复合植物提取物各组分肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油(含有33％l-薄荷醇)的原料资源在我国来源广，生产工艺比较简易、成本低，对人畜安全性好，对环境无污染，且具有花的清香，有效期长达一年以上。

(二)本发明的复合植物提取物为食品级生物制剂，不仅挥发性好，用量少，易排除，在限量范围内使用对人体无害。相反，磷化氢类化学抑菌剂，虽然挥发性良好但难以除尽，并且剧毒、易燃，严重威胁操作人员的人身安全和身体健康。

(三)本发明所用的熏蒸剂为复合植物提取物，与单种植物提取物相比，效果更为显著且不易产生抗药性。

(四)本发明的复合植物精油防霉剂具有阻控玉米品质劣变，保持其生理活性的作用。

附图说明

图1为本发明实施例6中储藏过程中玉米霉菌总数污染情况。

图2为本发明实施例8中储藏过程中玉米脂肪酸值变化情况。

图3为本发明实施例8中储藏过程中玉米发芽率变化情况。

图4为本发明实施例9中玉米储藏过程中复合精油和各精油单体对霉菌总数变化的影响。

图1-图4中，精油组对应于实施例1制备的复合植物精油防霉剂。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1复合植物提取物防霉剂的制备

1、植物提取物混合液的配制

按照体积比为3:3:2:2的比例取肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油(33％l-薄荷醇，溶剂为无水乙醇)；根据用量由少到多的比例依次混合4种植物精油，边加边搅拌，混合均匀制成复合植物精油防霉剂。

2、复合植物提取物的ph调节

用三乙醇胺调节步骤1的复合植物提取物混合液的ph至6.5-7.0，即得到复合植物提取物。

3、配制

将复合植物精油防霉剂用0.22μm的微孔过滤器过滤；取滤液与硅藻土(1:1，m/m)进行混合，拌匀后密闭放置20min使其充分吸附，制成复合植物精油防霉剂，备用。

实施例2复合植物提取物防霉剂的制备

本实施例提供的复合植物提取物防霉剂，肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油的体积比为2:2:1:1，其余制备方法同实施例1。

实施例3复合植物提取物防霉剂的制备

本实施例提供的复合植物提取物防霉剂，肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油的体积比为5:5:3:3，其余制备方法同实施例1。

实施例4复合植物提取物防霉剂的制备

本实施例提供的复合植物提取物防霉剂，肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油的体积比为2:5:1:3，其余制备方法同实施例1。

实施例5复合植物提取物防霉剂的制备

本实施例提供的复合植物提取物防霉剂，肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油的体积比为5:2:3:1，其余制备方法同实施例1。

实施例6复合植物提取物熏蒸抑制储藏期玉米(水分含量为12％)霉菌的生长

采用实施例1-5制备的复合植物提取物。

(一)防霉处理

1、对照组丙酸防霉剂制备

将液体丙酸与硅藻土按质量比1:1进行混合，取丙酸与食品级硅藻土(1:1，m/m)进行混合，拌匀后密闭放置20min使其充分吸附，制成固态丙酸防霉剂，备用。

2、试验设计

设置空白组、丙酸组、精油组3个处理，每个处理做3个平行，共9个仓，每仓分装玉米0.4t(800斤)。其中空白组不做任何处理；丙酸组，按照0.2％添加量取固态丙酸防霉剂1600g均匀撒入粮仓中；精油组，按照0.02％添加量取上述复合植物精油防霉剂160g均匀撒入粮仓中。本实验自2016年1月1日开始，完成防霉实验设计并入库后，在长达360d的储藏过程中分别在储藏的第0d、30d、60d、120d、180d、240d、300d、360d采集样品，用粮食扦样器(1500mm×ф18mm)分别于粮仓的上、中、下层取样2kg，混匀后装入自封袋中，冻存于-20℃冰箱，待检测。

(二)试验指标检测

1、玉米样品菌悬液的制备

玉米表面带菌量采用稀释平板菌落计数法计算玉米样品不同储藏期所污染真菌的菌落总数，按照gb4789.15—2010执行。在无菌生物安全柜中，精确称取玉米样品25.00g±0.01g置于3％naclo溶液中清洗30s，再用无菌水清洗三次。随后将玉米样品置于300ml无菌的锥形瓶中，加入225ml无菌水，在调速多用振荡器上剧烈震荡30min由此得到10^-1稀释度的玉米样品菌悬液，后用1ml菌悬液与9ml无菌水混合制成10^-2稀释度的玉米样品菌悬液，然后采用10倍梯度稀释法将玉米样品菌悬液依次稀释。

2、玉米样品带菌量及种类分析

2.1总带菌量及不同种类真菌数量测定

选取三个适宜稀释度菌悬液，吸取各梯度菌液1ml分别涂布在drbc、dg18、pda培养基上，重复三次。在30℃恒温培养箱中黑暗培养，5d后观察菌落特征，7d后计数。观察平板中不同微生物的种类，统计所有真菌的数量及其种类真菌的数量并记录。同时将上述平板在30℃恒温培养箱中黑暗培养5d后，观察平板中不同微生物的种类和数量，挑取单个菌株进行纯化、分离。

2.2菌株dna提取

在100ml锥形瓶中加入50mlyes液体培养基(蔗糖150g/l，酵母提取物20g/l，大豆蛋白胨10g/l，ph5.9)，在121℃条件下高压灭菌15min。向灭过菌的培养基中加入1ml的菌悬液，使孢子悬浮液的终浓度为1×10⁵孢子/ml，然后将培养液放置摇床上，在30℃，200rpm条件下培养5d。将培养好的液体发酵液中的菌丝挑出，用灭菌的滤纸吸干。使用omega基因组dna提取试剂盒(fungaldnakit)提取菌株dna。

3、菌株鉴定

3.1形态学鉴定

观察其单菌落的颜色、孢子量、菌丝形态等，以及在显微镜下观察其孢子形态和分生孢子梗形态，比照国家标准《真菌鉴定手册》(魏景超，上海科学技术出版社，13119-718)及《gb/t26628.1-2011粮油检验储粮真菌标准图谱第1部分：曲霉属》，进行形态学鉴定。

3.2分子鉴定

利用真菌共有的its1、its4基因对分离到的单一菌株进行分子鉴定。其pcr扩增所用的引物为its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgc-3′和its4：5′-gctgcgttcttcatcgatgc-3′。pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。

结果如图1显示，总体看来在为期一年的储藏时间内，相比于空白组经过防霉剂处理的玉米样品霉菌菌落总数明显减少，在整个储藏过程中菌落总数均低于600cfu/g，真菌丰度和优势度受到明显抑制，证明复合植物精油直接接触玉米样品有抑制霉菌生长的作用。经过以上形态学鉴定和分子鉴定，发现储藏初期玉米所带真菌以镰刀菌、青霉、灰绿曲霉为主，玉米储藏过程中真菌菌群分布情况如表1所示。至储藏8月末，精油处理组黄曲霉数量为3.5cfu/g，抑制率为99.4％，镰刀菌则受到完全抑制；丙酸处理组黄曲霉、镰刀菌的抑制率分别为82.6％、100％，精油及丙酸处理对黄曲霉、镰刀菌等产毒真菌具有良好的抑制作用。

表1玉米储藏过程中真菌菌群分布情况

实施例7复合植物提取物熏蒸抑制储藏期玉米真菌毒素的污染

1、样品前处理

玉米样品经高速万能粉碎机粉碎(90％通过40目筛)混匀后，称取25.00g±0.01g置于150ml锥形瓶中，加入100ml乙腈溶液(乙腈：去离子水，84:16，v/v)，手动混匀，然后于恒温培养振荡器中振荡1h后，采用快速定性滤纸过滤。转移上清液8ml至226萃取柱的玻璃试管中，加入80μl乙酸酸化，将226的带有红色橡胶头的萃取柱插入玻璃试管内，用至少1min的时间将萃取柱缓慢推入玻璃试管底部，使提取液通过固定相进入套管中。量取纯化液4ml至洁净的带有刻度的5ml离心管中，将离心管置于50℃金属浴中氮吹至近干，用甲醇-10mm乙酸铵水溶液(1:1，体积比)溶解，定容至1ml，回旋振荡器上震荡1min，过0.22μm有机滤膜于2ml样品瓶中，待测。

2、lc-ms/ms检测条件

仪器为安捷伦6420lc/ms/ms(配有1260液相色谱)；色谱柱为agilentproshell120sb-c18(2.1×100mm，3.5μm)；柱温为30℃；进样体积为2μl；梯度洗脱为a0.1％甲酸水和b0.1％乙腈。质谱条件，雾化气温度350℃；气帘气温度350℃；雾化气压力，40psi；电离电压，4kv。

结果如表2所示。玉米储藏过程中常见真菌毒素为afb1、don等，在储藏的8月末空白组2种真菌毒素含量均达到最大积累量，分别为21.14μg/kg、640.17μg/kg。复合植物精油防霉剂及丙酸防霉剂处理后玉米样品的2种真菌毒素积累量明显降低，复合植物精油防霉剂对2种真菌毒素的抑制率分别为90.6％、66.0％。

表2玉米储藏过程中真菌毒素含量变化情况

注：nd表示未检出。

实施例8复合植物提取物熏蒸对玉米品质的影响

1、玉米样品脂肪酸值测定

按照gb/t5510-2011《粮油检验粮食、油料脂肪酸值测定》对储藏期玉米样品脂肪酸值含量进行测定，每个样品做3次平行试验。

2、玉米样品的发芽率测定

养皿或碟子上铺几层经蒸煮消毒的吸水纸或卫生纸，预先浸湿，将种子放在上面，然后加清水淹没种子，浸泡4～6h使其充分吸水，不断加水，保持种子表面湿润。培养7天后统计发芽粒数。

结果如图2所示，储藏1年后脂肪酸值为35.2mgkoh/100g，仅为空白组的57.4％、丙酸组的51.9％；复合植物精油防霉剂能够保持玉米发芽率，储藏1年后仍达到85.0％，而空白组和丙酸组的发芽率分别仅为61.3％和25.8％(图3)；表明复合植物精油防霉剂具有阻控玉米品质劣变、保持其生理活性的作用。

实施例9复合植物提取物与肉桂醛、柠檬醛、丁香酚、薄荷油各单剂对储藏期玉米(水分含量为12％)霉菌生长的抑制效果比较

采用实施例1制备的复合植物提取物。

(一)防霉处理

1、精油单体防霉剂制备

分别将肉桂醛、柠檬醛、丁香酚、薄荷油(33％l-薄荷醇，溶剂为无水乙醇)与硅藻土按质量比1:1进行混合，拌匀后密闭放置20min使其充分吸附，制成固态精油单体防霉剂，备用。

2、试验设计

设置空白组、复合精油组(实施例1)、肉桂醛组、柠檬醛组、丁香酚组和薄荷油组共6个处理，每个处理做3个平行，共18个仓，每仓分装玉米0.4t(800斤)。其中空白组不做任何处理；精油组和各精油单体组，按照0.02％添加量取上述复合植物精油和各精油单体防霉剂160g均匀撒入粮仓中。本实验自2016年1月1日开始，完成防霉实验设计并入库后，在长达360d的储藏过程中分别在储藏的第0d、30d、60d、120d、180d、240d、300d、360d采集样品，用粮食扦样器(1500mm×ф18mm)分别于粮仓的上、中、下层取样2kg，混匀后装入自封袋中，冻存于-20℃冰箱，待检测。

(二)试验指标检测

1、玉米样品菌悬液的制备

具体操作同实施例2。

2、玉米样品带菌量分析

具体操作同实施例2。

结果如图4显示，总体看来，在为期一年的储藏时间内，相比于空白组，经过防霉剂处理的玉米样品霉菌菌落总数明显减少，在整个储藏过程中菌落总数均低于600cfu/g，其中复合植物精油组抑菌效果最好，其次是肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷油，证明在等量添加的条件下，复合植物精油对玉米霉菌的抑制效果显著优于各精油单体。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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