包含枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌的饲料添加剂、包含所述饲料添加剂的饲料组合物及生产所述饲料添加剂的方法与流程

本发明涉及一种包含枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株的饲料添加剂、一种包含所述饲料添加剂的饲料组合物及一种生产所述饲料添加剂的方法。
背景技术：
：反刍动物(例如牛)的草料占肉牛的饲料的约20％以及占奶牛的饲料的约60％。在摄入之后，草料是通过微生物降解，且必需营养素及能量在瘤胃(也被称为第一胃)中被吸收。从营养学/生理学的角度看，反刍动物从草料中摄入存在于动物的瘤胃及组织中的微生物所必需的大量蛋白质、能量、脂肪酸、矿物质及维生素。草料呈鲜草、干草或青贮饲料的形式。干草料含有≥20％到30％的粗纤维。草料是由相对难以降解的半纤维素、木质素及纤维素构成。已对用于增加草料的消化率以提高饲料的价值的方法进行了大量研究。这些方法的代表性实例包括物理处理方法(浸泡、粉碎、压力蒸气处理、膨胀、γ射线照射及制粒)、化学处理方法(氢氧化钠、尿素、氨、石灰、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氯、臭氧、过氧化氢等)，以及生物处理方法(发酵、酶改性及青贮等)。然而，物理处理方法涉及高的加工成本。化学处理方法会致使加工成本增加且在处置期间造成危险。化学处理方法还会造成土壤污染或影响动物的正常生理功能。由于这些原因，避免使用物理处理方法及化学处理方法。因此，主要使用基于使用纤维素分解酶或添加用于产生大量此类酶的微生物的生物处理方法。具体来说，大量研究已着重于增加纤维素的降解率。将草料与精饲料组合起来喂给奶牛及肉牛，以补充所需要量的能量以及提高牛奶及牛肉的生产率。精饲料体积小且能量含量高。精饲料与草料相比容易消化。然而，喂食大量的精饲料会在淀粉降解的过程中增大乳酸酯的浓度，从而导致瘤胃ph显著降低。瘤胃ph降低会对有益微生物的生长产生不利影响且会导致酸中毒，从而造成摄食量减少、消化不良、严重脱水及腹泻。因此需要开发一种能够使纤维素及乳酸酯高度地降解的饲料添加剂。[现有技术文献][专利文献]韩国专利第10-1721900号技术实现要素：技术问题本发明的一个目的是提供一种有助于提高牛奶脂肪且有益于提高牛奶产量的包含枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株及地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)菌株的饲料添加剂。本发明的另一目的是提供一种包含所述含有枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株的饲料添加剂的饲料组合物。技术解决方案以下，将详细阐述本发明的实施例。应注意，为了清晰起见，将省略对于所属领域中的技术人员来说显而易见的细节的说明。本发明的一个实施例提供一种用于提高牛奶脂肪及牛奶产量的饲料添加剂，所述饲料添加剂包含枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株。可使用能够产生消化酶(例如，纤维素酶和/或甘露聚糖酶)以使纤维素降解的任何属于枯草芽孢杆菌的菌株。枯草芽孢杆菌是通常存在于土壤、发酵豆瓣酱、或红辣椒酱中的革兰氏阳性(gram-positive)需氧细菌。枯草芽孢杆菌菌株可为例如枯草芽孢杆菌cjbs62(bacillussubtiliscjbs62)或枯草芽孢杆菌cjbs16。具体来说，可使用枯草芽孢杆菌cjbs62。枯草芽孢杆菌cjbs62在2017年6月22日存放在韩国微生物保藏中心(koreanculturecenterofmicroorganisms，kccm)(韩国首尔西大门区弘济内2号街支路儒林大厦45楼(yurimbuilding45，hongjenae-2ga-gil，seodaemun-ku，seoul，korea))，且被授予存放编号kccm12039p。枯草芽孢杆菌cjbs62的16s核蛋白dna的序列(5’→3’)在seqidno.3中列出。可使用能够使乳酸酯降解为乙酸酯的任何属于地衣芽孢杆菌的菌株。当在含乳酸酯的培养基中培养9小时到48小时时，地衣芽孢杆菌菌株可将30％到70％、具体来说50％到65％的初始量的乳酸酯转化成乙酸酯或可将至少50％、至少60％、至少70％、或至少80％的所消耗量的乳酸酯转化成乙酸酯。初始量的乳酸酯向乙酸酯的转化率以及所消耗量的乳酸酯向乙酸酯的转化率可分别通过式1及式2来计算：[式1]初始量的乳酸酯向乙酸酯的转化率(％)＝(所产生的乙酸酯的量/乳酸酯的初始量)*100[式2]所消耗量的乳酸酯向乙酸酯的转化率(％)＝(所产生的乙酸酯的量/乳酸酯的消耗量)*100地衣芽孢杆菌菌株可另外产生纤维素酶和/或甘露聚糖酶。地衣芽孢杆菌是通常存在于发酵豆瓣酱或红辣椒酱中的革兰氏阳性需氧细菌。地衣芽孢杆菌菌株可为例如地衣芽孢杆菌cjbl215(bacilluslichenformiscjbl215)或地衣芽孢杆菌cjbl219(bacilluslichenformiscjbl219)。具体来说，可使用地衣芽孢杆菌cjbl219。地衣芽孢杆菌cjbl215或地衣芽孢杆菌cjbl219在2017年6月22日存放在韩国微生物保藏中心(kccm)(韩国首尔西大门区弘济内2号街支路儒林大厦45楼)，且分别被授予存放编号kccm12040p及kccm12041p。地衣芽孢杆菌cjbl215及地衣芽孢杆菌cjbl219的16s核蛋白dna的序列(5’→3’)分别在seqidno.1及seqidno.2中列出。包含枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株的饲料添加剂可稳定反刍动物的瘤胃ph，且可增加反刍动物的饲料消化率。饲料添加剂能有效地提高产奶牛的牛奶脂肪生产，且可高效地增加所生产的牛奶量。枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株可分别独立地以每克饲料添加剂至少1×107cfu、具体来说至少1×108cfu、更具体来说1×109cfu的浓度存在。所述菌株以以上所界定的浓度存在会使饲料添加剂有效地降解纤维素以及增加牛奶脂肪。每头动物每天可使用0.1g到1kg、具体来说5g到900g、更具体来说10g到880g的量的饲料添加剂。枯草芽孢杆菌菌株对地衣芽孢杆菌菌株的重量比可介于1∶9到9∶1、具体来说2∶8到8∶2、更具体来说3∶7到7∶3、最具体来说1∶2到2∶1范围内。饲料添加剂可为液体或固体。当饲料添加剂为液体时，枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株可以其生物质(biomass)、培养液(culturebroth)或浓缩液(concentrate)的形式存在。固体饲料添加剂可包含枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株的生物质、培养液或浓缩液。举例来说，固体饲料添加剂可呈通过加热干燥或冷冻干燥所制备的粉末、小片、球粒、颗粒或包衣的形式。本发明的另一实施例提供一种包含所述饲料添加剂的饲料组合物。以所述饲料组合物的重量计，所述饲料组合物可包含0.1重量％到50重量％、具体来说0.1重量％到40重量％、更具体来说1重量％到20重量％的饲料添加剂。所述饲料组合物还可包含选自动物生长促进剂、营养素、营养补充剂、存储稳定剂及涂布剂的至少一种成分。所述饲料组合物可包含选自下列的至少一种成分：其他益生菌；酶，例如淀粉酶及脂肪酶；维生素，例如l-抗坏血酸、氯化胆碱及肌醇；矿物质，例如氯化钾、柠檬酸铁、氧化镁及磷酸盐；氨基酸，例如赖氨酸、丙氨酸及蛋氨酸；有机酸，例如反丁烯二酸、丁酸及乳酸，以及其盐；抗氧化剂，例如维生素c及维生素e；抗真菌剂，例如丙酸钙；乳化剂，例如卵磷脂脂肪酸及甘油脂肪酸；以及着色剂。饲料可为动物饲料，具体来说为反刍动物饲料。这些反刍动物的实例包括但不限于奶牛、水牛、石山羊、绵羊、山羊及鹿。饲料的摄取量可依据动物的种类、重量、年龄、性别及一般健康状况、饲料的成分，以及其他因素进行适当地确定。本发明的再一实施例提供一种用于生产所述饲料添加剂的方法。所述方法包括：对枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株进行培养以及对所述菌株的所培养的生物质、培养液或浓缩液进行干燥。具体来说，所述培养可包括以所述菌株进行接种以及在30℃到50℃下将所述菌株培养2小时到60小时，例如在32℃到40℃下培养5小时到50小时。更具体来说，所述培养可包括以所述菌株进行接种；在30℃到50℃下将所述菌株初级培养2小时到60小时，例如在32℃到40℃下初级培养5小时到50小时，直到所述菌株的含量达到每克培养液至少1×107cfu；向初级培养物中添加选自玉米、小麦蛋白、大豆粉及糖浆的一种或多种原料；以及在30℃到50℃下将所述菌株次级培养2小时到60小时，例如在32℃到40℃下次级培养5小时到50小时。可在40℃到70℃下将所培养的生物质、发酵液、或浓缩液干燥5小时到120小时，例如在40℃到60℃下干燥5小时到60小时。在一个实施例中，所述方法还可包括粉碎经干燥的所培养的生物质、培养液或浓缩液。本发明的又一实施例提供一种用于增加动物的牛奶脂肪及牛奶产量的方法，所述方法包括将包含枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株的饲料添加剂投喂给动物。对本实施例的详细说明相同于对本文所述的其他实施例的详细说明。本发明的又一实施例提供一种用于稳定动物(尤其是反刍动物)的瘤胃ph的方法，所述方法包括将包含枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株的饲料添加剂投喂给动物。对本实施例的详细说明相同于对本文所述的其他实施例的详细说明。本发明的又一实施例提供一种用于提高动物(尤其是反刍动物)的消化性的方法，所述方法包括将包含枯草芽孢杆菌菌株及地衣芽孢杆菌菌株的饲料添加剂投喂给动物。对本实施例的详细说明相同于对本文所述的其他实施例的详细说明。有利效果根据本发明的饲料添加剂有助于提高反刍动物的牛奶脂肪且当在夏季暴露于高温胁迫时，可阻止牛奶脂肪减少。另外，根据本发明的饲料添加剂能有效地使瘤胃中的乳酸酯降解。因此，根据本发明的饲料添加剂可防止瘤胃ph因乳酸酯而降低，且因此有益于防止瘤胃酸中毒。附图说明图1示出在本发明的一个实例中分离的枯草芽孢杆菌cjbs62以及地衣芽孢杆菌cjbl215及cjbl219的电子显微镜图像。图2示出在本发明的一个实例中用于筛选消耗乳酸酯的菌株的培养基的颜色变化。当培养基的颜色从黄色(左边)转变为紫色(右边)时，判断出培养基中的菌株会消耗乳酸酯。图3是示出在本发明的一个实例中所测量的通过菌株向乙酸酯的转化率的直方图。图4示出在本发明的一个实例中通过地衣芽孢杆菌cjbl215及cjbl219所消耗的乳酸酯的量及所产生的乙酸酯的量(左边，y轴)以及在培养9h及48h时向乙酸酯的转化率(右边，x轴)。图5是在本发明的一个实例中确认枯草芽孢杆菌cjbs62以及地衣芽孢杆菌cjbl215及cjbl219是否发生溶血的图像。图6示出当将根据本发明一个实例的饲料添加剂添加到精饲料中时乳酸酯浓度随培养时间的变化。图7示出当将根据本发明一个实例的饲料添加剂添加到精饲料中时乙酸酯浓度随培养时间的变化。图8将根据本发明一个实例的饲料添加剂与精饲料的混合物对ph稳定的影响和对照组对ph稳定的影响进行比较。图9是示出根据本发明一个实例的饲料添加剂与精饲料的混合物对提高消化率的影响的直方图。图10是示出根据本发明一个实例的饲料添加剂与全混合日粮饲料的混合物对提高消化率的影响的直方图。具体实施方式接下来，将参照实例更详细地阐述本发明。然而，应注意提供这些实例只是为了说明目的，而不应被视为以任何方式限制本发明。[实例]<实例1：菌株分离及筛选>(1)取样及菌株分离从传统发酵豆瓣酱及辣椒酱中收集样本。逐步对样本进行了稀释，植种在脑心浸液(brainheartinfusion(bhi)，difco(迪福科)固体培养基上，并在37℃下培养了24小时(h)。将所述培养物转移到新鲜的培养基中并进行培养。对纯菌株进行分离，将其置于添加有以总重量计20重量％的甘油的培养基中，并在≤-70℃下进行存储。将菌株划分成具有良好纤维素酶活性的菌株以及能够通过下述方法使乳酸酯降解成乙酸酯的菌株。(2)形态性质及生物学性质的探究首先，对所分离菌株的形态性质及生物学性质进行探究以辨识菌株。作为用于形态探究的革兰氏染色法(gramstaining)的结果，发现了所有所分离菌株为革兰氏阳性。电子显微镜揭示了菌株为芽孢杆菌(bacillussp.)(图1)。对所分离菌株的生物学性质进行了分析。为此，使用api50chb系统(法国的生物梅里埃维特克公司(biomerieuxvitek，inc.，france))对菌株的糖发酵图案进行了分析。结果示于表1中。[表1]+：阳性，-：阴性作为对菌株的糖发酵图案进行分析的结果，发现了cjbl215属于地衣芽孢杆菌(可靠性为99.7％)，且发现了cjbl219属于地衣芽孢杆菌(可靠性为99.9％)。发现了cjbs62属于枯草芽孢杆菌/解淀粉芽孢杆菌(可靠性为99.6％)。(3)菌株辨识为了更准确地辨识菌株，实施了基于dna测序的分子系统学分析(molecularsystematics)。为了进行dna测序，使用pcrpremix(预混合料)(韩国生物柏业公司(bioneer，korea))以及通用引物27f(5’agagtttgatcmtggctcag3’)及1492r(5’ggttaccttgttacgactt3’)执行了16srdna基因扩增。将整个反应溶液调整到20μl，且在94℃下历时1分钟、在56℃下历时1分钟，以及在72℃下历时1分钟重复基因扩增总计30次。对经扩增的dna序列进行了分析。所分离的菌株的16srdna序列在seqidno.1到seqidno.3中列出。作为分析的结果，cjbl215及cjbl219的序列中的每一者与地衣芽孢杆菌的序列具有99％的同源性，且cjbs62的序列与枯草芽孢杆菌的序列具有99％的同源性。所分离的菌株被命名为“地衣芽孢杆菌cjbl215”、“地衣芽孢杆菌cjbl219”及“枯草芽孢杆菌cjbs62”。新辨识的微生物地衣芽孢杆菌cjbl215、地衣芽孢杆菌cjbl219及枯草芽孢杆菌cjbs62在2017年6月22日存放在了韩国微生物保藏中心(kccm)，且分别被授予存放编号kccm12040p、kccm12041p及kccm12039p。<实例2：所分离的菌株的消化酶活性>(1)菌株的消化酶活性针对作为消化酶的甘露聚糖酶(mannase)及纤维素酶，对从酱(pastes)衍生出的所分离的细菌的复杂消化酶活性进行了评估。依据在含有酶底物的培养基中是否形成清晰的区(clearzone)对菌株的消化酶活性进行了测量。在脑心浸液(brainheartinfusion(bhi)，difco(迪福科)液体培养基中将所分离的菌株培养了24h。对所得培养液进行了收集并用作进行酶活性分析的粗酶溶液。培养基中的底物的降解程度如下进行确定。1)甘露聚糖酶活性的测量制备了添加有1％的甘露聚糖(槐豆胶(longustbeangum)，美国西格玛公司(sigma，usa))的基质培养基(酵母萃取物3g/l、蛋白胨5g/l、kh2po41g/l、琼脂20g/l、ph5)。将粗酶溶液(分别为1.5μl)滴到基质培养基中。在37℃下使反应进行15h到18h之后，依据是否形成清晰的区而对酶的活性进行了测量。结果示于表2中。2)纤维素酶活性的测量制备了添加有1％的羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose，cmc)底物的ym培养基。将粗酶溶液(分别为1.5μl)滴到底物培养基中。在37℃下使反应进行了15h到18h。以0.2％的刚果红(congored)溶液对反应溶液染色达30分钟，并以1mnacl水溶液进行了漂白以测量清晰的区。依据由于底物的降解是否导致在菌株周围形成清晰的区，对酶的活性进行了测量。结果示于表2中。基于评估的结果，发现了枯草芽孢杆菌cjbs16及cjbs62具有最好的甘露聚糖酶活性及最好的纤维素酶活性。[表2]所筛选的菌株的消化酶活性(毫米(mm))cjbs16cjbl215cjbl219cjbs62甘露聚糖酶502.53.5纤维素酶2323.5(2)培养上清液的纤维素分解活性对所筛选的菌株的培养上清液的纤维素分解活性进行了确认。首先，将菌株中的每一者培养了24h并在10,000每分钟转速(revolutionsperminute；rpm)下离心分离了5分钟。通过0.2μm的注射器过滤器对所得上清液进行了过滤。将20μl的上清液滴到添加有纤维素(cellulose)的培养基(羧基甲基纤维素钠盐(carboxymethylcellulosesodiumsalt)10g/l、细菌用琼脂(bactoagar)15g/l)中。在37℃下使反应进行了1天。以0.4％的刚果红溶液将反应溶液染色达20分钟并以1mnacl溶液进行了漂洗。对清晰的区的大小进行了测量以确认培养上清液的纤维素分解能力。结果示于表3中。发现了枯草芽孢杆菌cjbs62的培养上清液具有最好的纤维素分解活性。[表3]所筛选的菌株的培养上清液的纤维素分解活性(mm)cjbs16cjbl215cjbl219cjbs62纤维素分解活性16.516.51424<实例3：消耗乳酸酯的菌株与产生乙酸酯的菌株的筛选>在添加有乳酸酯的培养基中培养之后，通过显色底物法(chromogenicmethod)使用溴酚蓝对消耗乳酸酯的菌株进行了定性筛选。首先，制备了添加有15mm乳酸酯(lactate)、酵母萃取物(yeastextract)10g/l、蛋白胨(peptone)20g/l、nacl10g/l及溴酚蓝(bromophenolblue，bcp)0.0004g/l的培养基。将培养基(分别为1.5ml)植种在微量离心管上，且以在脑心浸液(bhi)(迪福科)培养基中预先培养的菌株(分别为50μl)对管进行了接种。在37℃下将菌株在管中静止培养了4天到5天。当培养基的颜色从黄色转变为紫色时，初步地判断出菌株会消耗培养基中的乳酸酯。对自样本分离的117个菌株进行了培养，且筛选出总计4个菌株cjbs16、cjbl215、cjbl219及cjbs62(图2)。以所筛选的cjbs16、cjbl215、cjbl219及cjbs62对脑心浸液(bhi)(迪福科)培养基进行了接种，并在37℃及200rpm下培养了16h以将其活化。以每一菌株(5％)对添加有15mm乳酸酯、酵母萃取物(yeastextract)10g/l、蛋白胨(peptone)20g/l及10g/lnacl的培养基进行了接种并在37℃及200rpm下培养了48h。在完成培养之后，向培养液中添加了10％的溴酚蓝(bcp)以重新确认是否消耗了乳酸酯。作为结果，确认四个菌株消耗乳酸酯(培养液的颜色从黄色转变成紫色)。<实例4：所消耗的乳酸酯的量及所产生的乙酸酯的量的测量>(1)测量所产生的乙酸酯的量以所筛选的cjbs16、cjbl215、cjbl219、及cjbs62对脑心浸液(bhi)(迪福科)培养基进行了接种，并在37℃及200rpm下培养了16h以将其活化。以每一菌株(5％)对添加有15mm乳酸酯、酵母萃取物(yeastextract)10g/l、蛋白胨(peptone)20g/l及10g/lnacl的培养基进行了接种并在37℃及200rpm下培养了48h。对培养液进行了离心分离，将0.2ml25％的偏磷酸(metaphosphoricacid)添加到1ml所收集的上清液中，然后在10,000rpm下离心分离5分钟。通过0.2μm的过滤器对所收集的上清液进行了过滤，且通过气相色谱仪(gaschromatograph，gc)(安捷伦科技公司(agilenttechnologies)的7890a)对所收集的上清液的乙酸酯含量进行了分析。四个消耗乳酸酯的菌株消耗了乳酸酯从而产生乙酸酯。对乙酸酯含量进行了测量。转化率是由式1表示。作为结果，cjbl219的乳酸酯向乙酸酯转化率最高(59.4％)，且cjbl215的乳酸酯到乙酸酯转化率为44.9％(表4、图3)。[式1]初始量的乳酸酯向乙酸酯的转化率(％)＝(所产生的乙酸酯的量/乳酸酯的初始量)*100[表4]在培养基中消耗乳酸酯之后所产生的乙酸酯的量以及转化率菌株号乙酸酯含量(mm)通过式1计算的转化率(％)cjbl2198.9159.4cjbl2156.7444.9cjbs163.7424.9cjbs621.9913.3(2)由所筛选的菌株所消耗的乳酸酯的量以及所产生的乙酸酯的量的测量对由培养基中的所筛选的菌株所消耗的乳酸酯的量以及所产生的乳酸酯的量进行了量化。以所筛选的cjbs16、cjbl215、cjbl219及cjbs62对脑心浸液(brainheartinfusion(bhi)，difco(迪福科)培养基进行了接种，并在37℃及200rpm下培养了16h以将其活化。以每一菌株(5％)对添加有15mm乳酸酯、酵母萃取物(yeastextract)10g/l、蛋白胨(peptone)20g/l及10g/lnacl的培养基进行了接种并在37℃及200rpm下培养了48h。在开始培养之后的9h及48h时，对样本进行了收集。1)乳酸酯的量化对每一种培养液进行了离心分离且通过0.2μm的过滤器对所收集的上清液进行了过滤。在过滤之后，将培养上清液置于微量离心管(microcentrifugetube)中，且使用塞德斯生物分析器(cedexbioanalyzer)(瑞士罗氏公司(roche))的乳酸酯生物测试套件对培养上清液的乳酸酯含量进行了测量。结果示于表5中。2)乙酸酯的量化对每一种培养液进行了离心分离，将0.2m125％的偏磷酸添加到1ml所收集的上清液中，然后在10,000rpm下离心分离5分钟。通过0.2μm的过滤器对所收集的上清液进行了过滤，且通过气相色谱仪(安捷伦科技公司的7890a)对所收集的上清液的乙酸酯含量进行了分析。结果示于表5以及图4及图5中。[式2]所消耗量的乳酸酯向乙酸酯的转化率(％)＝(所产生的乙酸酯的量/乳酸酯的所消耗量)*100参照表5，cjbl215在培养48h期间消耗了乳酸酯的初始量的49.8％，且将约91.1％的所消耗乳酸酯转化成乙酸酯。cjbl219在培养48h期间消耗了乳酸酯的初始量的48.6％，且将所有所消耗乳酸酯转化成乙酸酯(图4)。[表5]在培养期间的不同时间点的培养基中的乳酸酯及乙酸酯的含量以及转化率<实例5：菌株的稳定性>(1)菌株的溶血的确认β-溶血(β-hemolysis)是指由红细胞提供的磷脂被从有害细菌产生的磷脂酶水解、从而导致红细胞溶血的现象。使用血琼脂平板培养基(羊血(sheepblood)5％，韩国哈尼尔卡尔玛有限公司(hanilkomedco.ltd.，korea))对所分离的菌株的溶血进行了探究。将菌株划线(streaking)接种到血琼脂平板培养基上并在37℃下培养24h。针对是否发生溶血进行了观察。未观察到溶血，如图5所示。(2)菌株对抗生素的敏感性的确认通过以下程序对所筛选的菌株对抗生素的敏感性进行了确认。首先，以所筛选的菌株对脑心浸液(brainheartinfusion(bhi)，difco(迪福科)培养基进行了接种并在37℃及200rpm下培养了16h。使用以所培养的菌株浸泡的无菌棉拭子将菌株植种在穆勒辛顿(muellerhinton)ii琼脂平板(迪福科)上。将抗生素片置于平板培养基上，然后在37℃下培养15h到18h。制备了氨苄青霉素(ampicillin)、克林霉素(clindamycin)、庆大霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、四环素(tetramycin)、万古霉素(vancomycin)、红霉素(erythromycin)、氨苄青霉素/舒巴坦(ampicillin/sulbactam)、氯霉素(chloramphenicol)及链霉素(streptomycin)片(oxoid)以用于抗生素测试。依据在培养之后在抗生素片周围形成清晰的区(clearzone)来确认菌株对抗生素的敏感性。作为抗生素敏感性测试的结果，发现了所筛选的菌株对抗生素的抗性较低(表6)。[表6]抗生素对菌株的生长抑制的程度<实例6：包含菌株的饲料添加剂的制备>以芽孢杆菌菌株cjbl215、cjbl219及cjbl62(两种地衣芽孢杆菌(bacilluslichenformis)以及一种枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis))中的每一者对9l胰酶大豆培养液(trypticsoybroth)进行了接种，并在36℃下培养了36h。将菌株植种在胰酶大豆琼脂(trypticsoyagar)培养基上，且对菌落的数目进行了测量。此时，对菌株进行了培养直到菌落的数目达到每克菌株≥1×109cfu。制备了20kg玉米、30kg小麦蛋白、45kg大豆粉及5kg糖浆的混合物作为用于固态发酵的原料。将所述三种芽孢杆菌菌株(分别为9l)的培养液混合在一起。将培养液的混合物(总计27l)添加到100kg用于固态发酵的原料中。在34℃的温度下随着搅拌在用于固态发酵的原料中将菌株均质地发酵了48h。在发酵完成之后，在50℃的温度下将混合物干燥了48h并粉粹以产生饲料添加剂。<实例7：饲料添加剂依据基质对瘤胃的发酵性能的影响>为了探究饲料添加剂对提高干燥物质消化率及提高乙酸酯的影响，使用瘤胃模型中的静止培养系统进行了测试。处理组：将50mg在实例6中生产的饲料添加剂以及0.5g基质馈送到200ml的血清瓶中。使用二氧化碳气体将37.5ml被二氧化碳气体还原的缓冲剂以及12.5ml瘤胃流体维持在厌氧状态。在以二氧化碳气体填充血清瓶达～30秒之后，以隔膜将血清瓶的入口封闭，以铝盖对血清瓶进行密封，然后在39℃下在静止培养器中培养了24h。此时，使用精饲料或全混合日粮(totalmixedration，tmr)作为基质。添加了每0.5g基质10重量％的量的饲料添加剂。通过将以下进行混合而制备了缓冲剂：9.3g/l磷酸二氢钠(sodiumphosphate，monobasic，nah2po4-2h2o)、9.8g/l碳酸氢钠(sodiumbicarbonate，nahco3)、0.47g/l氯化钠(sodiumchloride，nacl)、0.57g/l氯化钾(potassiumchloride，kcl)、0.256g/l氯化镁(magnesiumchloride，mgcl2)、0.106g/l氯化钙(calciumchloride，cacl2)、2.5g/l酪蛋白(n-z-胺)(casein，n-z-amine)及1.25ml/l刃天青(resazurine)溶液。*对照组：除了不添加饲料添加剂以外，在与处理组相同的条件下对菌株进行了培养。在39℃下在静止培养器中对处理组及对照组中的每一者进行了培养，且通过以下方法对其乳酸酯含量、乙酸酯含量、ph及干燥物质消化率进行了测量。对培养液中的每一者进行了离心分离且通过0.2μm的过滤器对所收集的上清液进行了过滤。在过滤之后，将培养上清液置于微量离心管(microcentrifugetube)中，且使用塞德斯生物分析器(瑞士罗氏公司)的乳酸酯生物测试套件对培养上清液的乳酸酯含量进行了测量。对每一种培养液进行了离心分离，将0.2ml25％的偏磷酸(metaphosphoricacid)添加到1ml所收集的上清液中，然后在10,000rpm下离心分离5分钟。通过0.2μm的过滤器对所收集的上清液进行了过滤，且通过气相色谱仪(安捷伦科技公司的7890a)对所收集的上清液的乙酸酯含量进行了分析。通过式3来计算干燥物质消化率：[式3]干燥物质消化率(％)＝(培养之前基质的量-培养之后基质的量)/培养之前基质的量*100在使用真空泵通过滤纸对培养液进行过滤以及在60℃下干燥一夜之后，对培养之前基质的量以及培养之后基质的量进行了测量。在培养期间的不同时间点对处理组及对照组的乳酸酯及乙酸酯的浓度的变化进行了测量。结果示于图6及图7中。参照图6，处理组中的乳酸酯的最小浓度比对照组中的乳酸酯的最小浓度低～10％。参照图7，处理组中的乙酸酯的最大浓度是对照组中的乙酸酯的浓度的～2.5倍。处理组及对照组的ph值及干燥物质消化率值(％)(分别)示于图8、图9及图10中。参照图8，对照组的ph比其初始值低0.5，而处理组的ph比其初始值低0.42。这些结果表明，根据本发明的饲料添加剂能有效地稳定瘤胃。参照图9及图10，使用精饲料及全混合日粮基质的处理组的干燥物质消化率值被测量为分别比对照组的干燥物质消化率值高4％及1.3％。总之，根据本发明的饲料添加剂可提高瘤胃中的消化率，且可增加乳酸酯的生产，从而表明对牛奶脂肪的增加具有积极影响。<实例8：用于提高牛奶脂肪的饲料添加剂对产奶牛的牛奶生产率的影响>根据本发明的饲料添加剂是通过在实例6中所提及的方法来生产且用于对产奶牛进行饲料测试。饲料添加剂对产奶牛的牛奶生产率的影响是通过已知的奶牛饲料测试方法来评估。首先，将72头产奶牛划分成对照组及处理组，每组为36头牛。对对照组投喂传统饲料达4周的测试周期，对处理组以追加喂食的形式喂食根据本发明的饲料添加剂与传统饲料的混合物(每头动物每天分别喂食20g(20g/day))。在喂食开始之前以及在喂食之后，对牛奶脂肪及牛奶蛋白的量以及牛奶产量进行了测量。结果示于表7、表8及表9中。作为对产奶牛连续喂食饲料添加剂(每头动物每天分别喂食20g(20g/day))的结果，牛奶脂肪增加了0.3％p，如表7所示。如可从表8中的结果看出，对照组显示出牛奶蛋白的含量无变化，但处理组显示出牛奶蛋白的含量显著提高(0.1％p)。在对照组中观察到牛奶产量无显著变化，但在处理组中观察到牛奶产量显著增加(0.4kg)(表9)。以上结果得出以下结论：根据本发明的饲料添加剂对牛奶脂肪、牛奶蛋白、及牛奶产量的提高具有积极影响，从而实现产奶牛的牛奶的高生产率及高质量。[表7]饲料添加剂对提高牛奶脂肪的影响对照组处理组在开始之前(平均3周)4.7％4.7％在喂食之后(平均4周)4.7％5.0％牛奶脂肪的增量(％p)0.00.3[表8]饲料添加剂对提高牛奶蛋白的影响对照组处理组在开始之前(平均3周)3.4％3.2％在喂食之后(平均4周)3.4％3.3％牛奶蛋白的增量(％p)0.00.1[表9]饲料添加剂对提高牛奶产量的影响对照组处理组在开始之前(平均3周)27.9kg31.9kg在喂食之后(平均4周)28.0kg32.3kg牛奶产量的增量(kg)0.10.4<实例9：当在夏季暴露于高温胁迫时用于提高牛奶脂肪的饲料添加剂对产奶牛的生产率的影响>根据本发明的饲料添加剂是通过在实例6中所提及的方法来生产且用于对产奶牛进行饲料测试。饲料添加剂对产奶牛的牛奶生产率的影响是通过已知的奶牛饲料测试方法来评估。首先，对150头产奶牛喂食包含0.2重量％的根据本发明的饲料添加剂的饲料达4周(从5月26到6月23)，所述4周是奶牛被暴露于高温胁迫环境的共同周期。对在喂食之前及喂食之后来自产奶牛的牛奶的生产率进行了比较。对于对照组，在无高温胁迫的环境中对产奶牛喂食无饲料添加剂的饲料达4周。对于处理组，在高温胁迫环境中对产奶牛喂食包含0.2重量％的饲料添加剂的饲料达4周。喂给处理组的饲料的基本组成相同于喂给对照组的饲料的基本组成。[表10]在夏季饲料添加剂对牛奶的生产率的影响牛奶脂肪牛奶产量对照组3.7％36.2kg处理组3.9％36.7kg增量0.2％p0.5kg参照图10，发现了在处理组中所测量的牛奶脂肪及牛奶产量分别比在对照组中所测量的牛奶脂肪及牛奶产量高0.2％p及0.5kg。众所周知，产奶牛暴露于高温胁迫环境会降低来自产奶牛的牛奶产量以及牛奶脂肪。然而，对产奶牛喂食根据本发明的饲料添加剂即使在暴露于高温胁迫环境时仍可提高牛奶脂肪及牛奶产量。序列表<110>cj第一制糖株式会社<120>包含枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌的饲料添加剂、包含所述饲料添加剂的饲料组成物及生产所述饲料添加剂的方法<130>p17-6152<141>2017-08-04<150>kr2017/0088646<151>2017-07-12<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1506<212>dna<213>cjbl21516srdna<400>1tcacctttttcgggtttcccctttacgacttcaccccaatcatctgtcccaccttcggcg60gctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgg120gcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagc180gattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgg240gattggcttagcctcgcggcttcgctgccctttgttctgcccattgtagcacgtgtgtag300cccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcacc360ggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgt420tgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtca480ctctgcccccgaaggggaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggta540aggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtc600aattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgtttg660ctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggac720taccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacaga780ccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacac840gtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccgg900ttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgcgcgctttacgcccaat960aattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgt1020ggctttctggtcaggtaccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtacttgttcttccct1080aacaacagagttttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagac1140tttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctc1200agtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccg1260ttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagctaaaagccac1320cttttatgtttgaaccatgcggttcaaacaagcatccggtattagccccggtttcccgga1380gttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatc1440agggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttc1500gtctga1506<210>2<211>1504<212>dna<213>cjbl21916srdna<400>2ttttttccggtttcccctttacgacttcaccccaatcatctgtcccaccttcggcggctg60gctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcgg120tgtgtacaaggcccgggaacgtattca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