本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种改善仔猪生长性能的猪源乳酸菌及益生元组合产品。
背景技术：
益生菌的最新定义是“产生小分子代谢副产物的微生物，对宿主生物学功能发挥有益的调节作用，并可能具有免疫调节剂作用”。益生元是“不可被消化的发酵底物，可选择性地刺激胃肠道微生物菌群的组成、生长和活性，从而改善宿主的健康”，目前应用的大多数益生元都是非消化性寡糖(2～10个单糖通过糖苷键形成)。将益生元和益生菌组合在一起就是合生素。单一的益生菌在消化系统中不能很好地存活，益生菌和益生元组合成合生素可产生协同效果。益生元不会增加现有菌群数量，而是为现有菌群提供营养，使菌株自然生长。益生菌主要在小肠中起作用，而益生元只在大肠中有效，所以两者组合可产生协同效应。益生菌是一种对宿主有益的活菌，而益生元是一种不易消化的日粮成分，通过选择性刺激一种或多种结肠微生物的生长和活性，潜在改善宿主健康。合生素是益生菌和益生元的混合物，通过改变肠道菌群组成起到有益宿主的作用。常用合生素包括乳酸菌+菊粉、双歧杆菌+低聚半乳糖、乳酸杆菌+低聚果糖等。
目前大多数猪场主要采用抗生素治疗仔猪腹泻，而结果往往会造成动物肠道内菌群的失调，而微生物添加剂与抗生素相反，它能抑制肠道病原菌的繁殖，并使其逐渐减少，使有益微生物在竞争中占优势，从而防止仔猪腹泻，提高其生产性能。vassalo等报道乳酸菌制剂可以提高仔猪对干物质和能量利用率，降低腹泻率。siuta报道双歧杆菌、乳酸菌、链球菌可极显著提高仔猪增重，降低死亡率。
研究发现，畜禽饲喂益生元后，肠道菌群会发生显著变化。益生元能够显著增加肠道双歧杆菌或乳酸杆菌数量，抑制肠道致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌等)的增殖。益生元被肠道微生物发酵后能够产生短链脂肪酸和气体。某些益生元可以通过表面糖基直接与细菌表面的植物凝集素结合，竞争性减少细菌与上皮细胞结合的机会，抑制其定植。益生元可以通过糖基与宿主免疫活性细胞膜上的相关受体结合，激活天然免疫应答。益生元能够促进钙、镁的吸收。如，delzenne等发现菊粉使胆固醇血症大鼠血清胆固醇水平下降了15％，fiordaliso等发现寡果糖使甘油三酯血症大鼠血清甘油三酯水平下降了50％。石宝明，单安山等试验表明0.1％与0.2％的寡聚糖添加量能显著(p<0.05)抑制断奶仔猪直肠中大肠杆菌的增值，促进结肠中双歧杆菌的增殖。周红丽等在断奶仔猪饲料中添加0.1％的甘露寡糖后，结肠、盲肠和直肠中的大肠杆菌显著减少，同时显著地提高了结肠和直肠双歧杆菌的增殖效果(p<0.05)，但盲肠中的增殖效果与对照组相比差异不显著，却可以显著提高乳酸菌的浓度(p<0.05)，而且当添加量为0.1％时效果最好。
合生素在猪生产上的应用研究报道尚不多见。研究发现，胃肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌等能利用果聚糖，大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌不能利用果聚糖。hassanpour(2014)等研究发现添加0.1％和0.2％水平的合生素对肉鸡小肠形态影响不尽相同，添加0.1％水平的22日龄和42日龄肉鸡以及添加0.2％水平的42日龄肉鸡十二指肠绒毛高度明显升高，但是，添加0.1％、0.2％水平的22日龄肉鸡空肠以及添加0.2％水平的42日龄肉鸡回肠绒毛高度却明显下降，高浓度合生素对肉鸡肠道结构不利影响的原因尚不明确。林勇等研究了益生菌和益生元对仔猪生产性能的影响，发现两者混合饲喂仔猪其日增重比单喂益生元组提高4.03％(p<0.05)，饲料利用率差异不显著，但与单喂益生元相比具有提高的趋势，同时其腹泻率是试验组中最低的。因此，合生素较单独使用益生素和益生菌对仔猪生长性能及改善肠道微生物水平较强。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种改善仔猪生长性能的猪源乳酸菌及益生元组合产品，使用本猪源乳酸菌菌剂可降低猪的腹泻率，组合益生元更可以提高猪的生长速度，降低料肉比，减少猪喂养过程中的抗生素使用量，符合绿色饲料添加剂的要求。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种改善仔猪生长性能的猪源乳酸菌，其制备方法包括以下步骤：
(1)以无菌方法取猪直肠内粪便，准确称取10g新鲜猪粪便，置于90ml生理盐水中，震荡30min进行混匀，进行10倍梯度稀释涂布，培养24h，待培养基中长出菌落后，挑选类似乳酸菌菌落形态的菌株进行纯化，对纯化后的菌株进行镜检确定其菌体形态，同时对其生物学特性进行测定；
对纯化后的菌株进行液体试管接种，提取其基因组dna，以基因组dna为模板通过pcr进行16s扩增测序，完成后进行序列比对，确定菌株的分类地位；选取生长速度快，同时对低酸有很强的耐受性的目标猪源乳酸菌菌株，所述目标猪源乳酸菌菌株能够保证菌体顺利通过胃的酸性环境进入肠道进行定植；
(2)将斜面保藏的目标菌种接种于液体摇瓶培养基中，震荡至对数期；
(3)将上述培养好的菌种按5％接种量接入5升发酵罐，培养至对数生长期，培养温度为37℃，全流程培养时间为24小时，发酵结束后菌体数量可达到10亿个/ml以上；
(4)向发酵罐中的菌液加入助悬剂，制成猪源乳酸菌菌剂。
优选地，所述步骤(1)中，所述源乳酸菌其特性为g+，菌体细长杆状，椭圆形芽孢，兼性厌氧，不耐高温，兼性厌氧生长，耐受低酸(ph2.0)，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制效应。
优选地，所述步骤(3)中，培养基配方为蛋白胨、酵母提取液、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、吐温、mgso4.7h2o、mnso4.4h2o、k2hpo4、caco3；ph值为5.5。
一种益生元组合产品，由本发明中的猪源乳酸菌菌剂与丁酸梭菌、益生素菊粉、益生素果寡糖组成。
优选地，所述猪源乳酸菌菌剂与丁酸梭菌、益生素菊粉、益生素果寡糖的质量比为1：1～5：1～5：1～4。
优选地，所述猪猪源乳酸菌菌剂与丁酸梭菌、益生素菊粉、益生素果寡糖的质量比为1：3：3：2。
本发明的有益效果是：
使用本菌剂可降低猪的腹泻率，组合益生元更可以提高猪的生长速度，降低料肉比，减少猪喂养过程中的抗生素使用量，符合绿色饲料添加剂的要求。
使用该发明生产的猪源乳酸菌具有生产成本低、使用方便，使用效果好的优点，适用于个体养殖和规模化猪场的大面积推广使用。本发明可有效降低猪腹泻率的发生，腹泻率降低60％以上，既降低了对环境的污染，又可减少猪生长过程中的抗生素使用，降低了养猪成本，保障了猪肉品质。同时，本产品还可提高猪的生长速度，降低了料肉比，提高了生产效益。由于本发明所用菌株分离自猪的肠道，菌体更容易定植于猪的肠道内，且所用菌株属于益生菌，对猪无任何副作用。该猪源乳酸菌菌剂与丁酸梭菌、益生素菊粉、益生素果寡糖共用后，可使使用效果更好。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、菌株的分离和鉴定
以无菌方法取猪直肠内粪便，准确称取10g新鲜猪粪便，置于90ml生理盐水中，震荡30min进行混匀，进行10倍梯度稀释涂布，培养24h，待培养基中长出菌落后，挑选类似乳酸菌菌落形态的菌株进行纯化，对纯化后的菌株进行镜检确定其菌体形态，同时对其生物学特性进行测定。对纯化后的菌株进行液体试管接种，提取其基因组dna，以基因组dna为模板通过pcr进行16s扩增测序，完成后进行序列比对，确定菌株的分类地位。选取生长速度快，同时对低酸有很强的耐受性的目标猪源乳酸菌菌株(nj1菌株)，能够保证菌体顺利通过胃的酸性环境进入肠道进行定植，且其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抑制，该菌经鉴定为乳杆菌，主要生物学特性为g+，菌体细长杆状，椭圆形芽孢，不耐高温。
2、菌株优化实验
2.1ph对猪源乳酸菌的影响
猪源乳酸菌nj1在mrs培养基中培养到对数期后期，取菌液在ph2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的生理盐水中，每隔30min测定其活菌数，结果表明，上述ph对菌株存活率无较大影响，当将ph降至1.0时，菌体数量有所下降，因此，nj1可以耐受ph2.0的酸性环境，当ph进一步降低时，菌株对其耐受性下降。
2.2耐热剂对猪源乳酸菌nj1的耐热性影响
猪源乳酸菌nj1在mrs培养基中培养到对数期后期，耐热组(加脱脂乳、海藻糖、维生素c)、对照组(只有菌体)将菌体接种到已预热至75℃、80℃、85℃的生理盐水中，每隔1min测定其中的活菌数，结果表明，耐热剂保护处理后比未处理存活率高，nj1经75℃处理5min后存活率提高为1.81倍，80℃处理5min后活菌数提高为7.85倍，85℃处理5min后存活率提高为5倍。
2.3猪源乳酸菌nj1的抑菌效果
采用牛津杯法，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌加入培养基后进行混匀，倒平板，将发酵液接入牛津杯内，结果显示，猪源乳酸菌nj1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著。
2.4猪源乳酸菌nj1的毒力实验
制备菌剂，包括以下步骤：
(1)将斜面保藏的猪源乳酸菌nj1接种于液体摇瓶培养基中，震荡至对数期；
(2)将上述培养好的菌种按5％接种量接入5升发酵罐，培养至对数生长期，培养基配方为蛋白胨，酵母提取液，牛肉膏，葡萄糖，乙酸钠，柠檬酸钠，吐温，mgso4.7h2o，mnso4.4h2o，k2hpo4，caco3，ph5.5，培养温度为37℃，全流程培养时间为24小时，发酵结束后菌体数量可达到10亿个/ml以上；
(3)向发酵罐中的菌液加入助悬剂，制成菌剂猪源乳酸菌nj1菌剂。
将菌剂猪源乳酸菌nj1菌剂配制成密度为1×106cfu/ml，分别以每只每天1.0ml、10.0ml菌液饲喂10日龄的健康乳猪，连续服用5天，观察所有试验猪活动状态、食欲、排便，以及10天内乳猪有否任何毒性作用及死亡现象。
结果：猪源乳酸菌nj1菌液饲喂10日龄的健康乳猪，连续服用5天，观察10天，可见乳猪活动状态良好，体温、食欲正常，排出正常粪便，未观察到对乳猪有毒性作用及死亡，说明该菌剂是安全的。
3、益生元组合产品的应用
制备益生元组合产品：将猪源乳酸菌nj1菌剂与丁酸梭菌、益生素菊粉、益生素果寡糖按质量比1：3：3：2混合均匀，即得。
将上述益生元组合产品添加至饲料中进行仔猪饲养，作为实验组；将普通猪用益生元产品添加至饲料中进仔猪饲养，作为对照组。每组三个重复，每个重复12头仔猪，保证仔猪的体重及身体状况基本相同，采样时间点为21～42d每天饲喂；42～70d隔天饲喂。
其对比性能结果如表1或2所示。
表121～42日龄猪的生长性能对比
表242～70日龄猪的生长性能对比
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。