本发明涉及农产品深加工领域，具体涉及一种饲用大豆与甜高粱混贮制备青贮饲料的方法。
背景技术：
饲用大豆被认为是动物饲料中很有前景的青贮原料之一，富含蛋白质、维生素和矿物质，并且还含有动物所需的微量元素、氨基酸和未知因子，因此饲用大豆可作为一种优质的粗饲料用于动物饲喂。然而由于饲用大豆中较高的缓冲能，较低的可溶性糖和干物质，易导致青贮失败，并且产生难闻气味。甜高粱含糖量丰富，利于青贮发酵，但粗蛋白等营养物质含量较低，饲喂价值不高。目前的青贮技术中多采用传统自然青贮，在其发酵过程中乳酸菌往往很难迅速形成优势菌群，不能短时间内降低ph值；且会因发热造成预备发酵期延长，营养成分和能量损失，气味刺鼻、适口性差；霉菌和腐败菌的大量繁殖，也使青贮料局部发霉和腐烂。通过在青贮加工时有针对性地添加特定的乳酸菌类微生物，加快青贮饲料的前期乳酸发酵进度，提高发酵效率，快速降低青贮原料的酸度，进而有效抑制有害微生物的生长，最大限度减少原料养分损失，避免出现腐败、发霉等情况。技术实现要素：本发明针对豆科植物难以青贮成功的缺点及饲用大豆的营养特性，与甜高粱混合青贮，对制备青贮品质优良和营养均衡的青贮饲料提供新途径。第一方面，本发明要求保护一种制备大豆青贮饲料的方法。本发明所要求保护的制备大豆青贮饲料的方法，可包括如下步骤：将青贮原料与植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01混合，进行固体厌氧发酵，收集所有发酵产物，得到大豆青贮饲料；所述青贮原料为由大豆全株和甜高粱全株组成的混合物；所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.13318。进一步地，在所述青贮原料中，所述大豆全株的质量百分含量可为10-50％。相应的，所述甜高粱全株的质量百分含量为50-90％。在本发明的具体实施方式中，在所述青贮原料中，所述大豆全株的质量百分含量为10％、30％或50％。相应的，所述甜高粱全株的质量百分含量为90％、70％或50％。进一步地，在所述方法中，所述青贮原料与所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01的配比可为1g：(105-106)cfu(如1g：106cfu)。进一步地，所述发酵的温度可为15-30℃，时间为60天。进一步地，作为所述青贮原料的所述大豆全株和所述甜高粱全株在进行青贮时均被切割成2cm长的小段。进一步地，所述大豆可为饲用大豆。在本发明的具体实施方试中，所述大豆具体为鼓粒期含水率65％的饲用大豆，所述甜高粱为乳熟期含水率75％的甜高粱。第二方面，本发明要求保护利用前文所述的方法制备得到的大豆青贮饲料。第三方面，本发明要求保护植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.13318。第四方面，本发明要求保护一种菌剂。本发明所提供的菌剂的活性成分为前文所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01。第五方面，本发明要求保护一种青贮饲料添加剂。本发明所提供的青贮饲料添加剂的活性成分为前文所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01。第六方面，本发明要求保护一种青贮饲料。本发明所提供的青贮饲料中含有前文所述的青贮饲料添加剂。本发明通过采用大豆与甜高粱全株混贮并添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01，有助于促进青贮发酵，提高适口性，减少营养物质损失，具有很好的经济效益和饲用价值。本发明的优点是：1.本发明利用饲用大豆与甜高粱混合青贮不仅解决了饲用大豆自然青贮品质差的问题，而且改善了甜高粱青贮饲料中粗蛋白等营养物质不足的问题。2.通过添加乳酸菌lactobacillusplantarumwq-01，进一步提升了饲用大豆和甜高粱混合青贮的品质，本发明工艺路线可靠，操作简明，保留了饲用大豆原有的营养成分的基础上，为饲用大豆青贮成功提供了新途径，促进畜牧业的可持续发展，具有良好的实用价值。保藏说明建议的分类命名：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)参椐的生物材料(株)：wq-01保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称：cgmcc地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2016年11月28日保藏中心登记入册编号：cgmccno.13318具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01的分离、鉴定及性能测定一、菌株wq-01的分离从饲用大豆、全株玉米和甜高粱植株表面一共分离出105株菌株，在mrs固体培养基上30℃厌氧条件下培养2天。挑选单菌落，每个划线培养两次，然后接种在营养液体培养基上，-80℃保存待用。二、菌株wq-01的筛选与鉴定1、生理生化特性鉴定本发明鉴定分离菌株的生理生化特性包括：温度、耐酸能力等。耐温试验方法：将分离的菌株接种到乳酸菌液体培养基分别放置于5℃、10℃、15℃、20℃、40℃恒温冰箱中培养14天，45℃和50℃恒温水浴锅培养7天。培养结束后，与不加菌液的乳酸菌液体培养基比对生长情况。耐酸试验方法：将分离的菌株接种到ph值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和7.0的乳酸菌液体培养基，于温度30℃恒温培养箱培养7天。培养结束后，与不加菌液的乳酸菌液体培养基比对。实验结果表明，其中一株编号为wq-01的菌株能够在5-45℃和ph3.0-7.0条件下生长(表1)，具有较宽的生育范围。表1菌株wq-01的耐温耐酸能力其中+表示能生长，w表示生长微弱。有机酸检测方法：将1000g饲用大豆和1000g甜高粱新鲜材料与5000ml去离子水混合榨汁，然后用4层纱布过滤，121℃灭菌15min，最后将过滤液放置于4℃条件下贮藏待用。将分离的乳酸菌分别接种到在mrs液体培养基培养30℃条件下培养24h，每个菌株培养液取100μl注入20ml混合汁液中于30℃条件下培养，每个菌株培养液2个重复。经过48h发酵后，取1ml发酵液，利用hplc法检测有机酸的含量。发酵结果表明，添加菌株wq-01的发酵液具有较低的ph值和较高的乳酸含量(表2)。表2菌株wq-01在饲用大豆和甜高粱混合汁液中的发酵实验结果碳源发酵试验:采用analyticalprofileindex(api50,biomerieux,france)实验条进行测试，方法依据说明书进行操作。分别培养48h后记录实验结果。实验结果表明，wq-01能利用d-葡萄糖、d-甘露糖、乳糖、龙胆二糖等多种糖原。表3菌株wq-01碳源发酵利用能力甘油-肌醇-菊糖-赤藓醇-甘露醇+松三糖+d-阿拉伯糖-山梨醇+棉子糖+l-阿拉伯糖+α-甲基-d-甘露糖甙+淀粉-d-核糖+α-甲基-d-葡萄糖甙-糖原-d-木糖-n-乙酰-葡糖胺+木糖醇-l-木糖-苦杏仁甙+龙胆二糖+阿东醇-熊果甙+d-松二糖+β-甲基-d-木糖甙-七叶灵+d-来苏糖-d-半乳糖+水杨苷+d-塔格糖-d-葡萄糖+纤维二糖+d-岩藻糖-d-果糖+麦芽糖+l-岩藻糖-d-甘露糖+乳糖+d-阿拉伯糖醇+l-山梨糖-蜜二糖+l-阿拉伯糖醇-l-鼠李糖+蔗糖+葡萄糖酸盐-卫茅醇-海藻糖+2-酮基-葡萄糖酸盐-其中，+表示能利用，-表示不能利用。2、革兰氏染色、过氧化氢酶接触试验以及6srdna序列同源性分析革兰氏染色：参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》。过氧化氢酶接触试验：用接种环挑取在固体乳酸菌培养基上的单菌落，涂布在含有过氧化氢液体的玻璃培养皿上，观察在接触过程是否有气泡产生，有气泡的是过氧化氢酶阳性，无气泡的是过氧化氢酶接触阴性。16srrna基因鉴定：将实验菌株在乳酸菌固体培养基上活化，在厌氧培养箱培养48h后，挑取单菌落进行菌落pcr实验。选取扩增16srrna引物是：27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’)[112]。pcr反应体系是：premix25μl，27f和1492r各1μl，再加灭菌蒸馏水至50μl。pcr反应条件是：96℃10秒，50℃5秒，60℃4min，经过30个循环后，在1％琼脂糖凝胶中电泳，使用marker含有1.5kb条带，电泳结束后，用eb染液，在紫外凝胶成像系统观察。最后，将pcr成功的扩增产物送至生物公司检测基因序列。wq-01细胞形态和理化实验结果如表4所示。wq-0116srrna基因序列测定结果如seqidno.1所示。该序列与ncbi数据库中的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的序列同源性高达100％。表4wq-01细胞形态和理化实验结果根据上述鉴定结果，将所得的菌株wq-01鉴定为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，并于2016年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.13318。实施例2、饲用大豆与甜高粱混贮制备青贮饲料一、试验方案i饲用大豆全株(鼓粒期，含水率65％)和甜高粱全株(乳熟期，含水率75％)同天收获。青贮前饲用大豆和甜高粱均切成2cm长，按照饲用大豆与甜高粱1：9的重量比例混匀，每袋重20kg，同时喷洒乳酸菌(lactobacillusplantarum)wq-01菌粉(菌粉活性为1011cfu/g)，添加量为每克鲜重106cfu(cfu，菌落形成单位)。然后人工压实，采用聚乙烯口袋抽真空密封青贮，每处理组5个重复，避光防鼠，室温(15-30℃)条件下贮藏。60天后开袋检测其营养品质、发酵品质。结果显示，10％全株大豆+90％甜高粱混合青贮相对全株大豆单独青贮，发酵品质显著改善，具体表现为：ph下降，乳酸上升，丁酸降低。添加乳酸菌比未添加组粗蛋白含量高。表明10％全株大豆+90％甜高粱混合青贮具有优良的青贮品质，添加乳酸菌进一步改善了青贮品质(表5)。表510％全株大豆与90％甜高粱混合青贮品质检测dm，干物质。同行肩标不同小写字母代表差异显著(p<0.05)。二、试验方案ii饲用大豆全株(鼓粒期，含水率65％)和甜高粱全株(乳熟期，含水率75％)同天收获。青贮前饲用大豆全株和甜高粱全株均切成2cm长，按照饲用大豆与甜高粱重量比为3：7的比例混匀，每袋20kg，同时喷洒植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01菌粉(菌粉活性为1011cfu/g)，添加量为每克鲜重添加106cfu(cfu，菌落形成单位)。然后人工压实，采用聚乙烯口袋抽真空密封青贮，每处理组5个重复，避光防鼠，室温(15-30℃)条件下贮藏。60天后开袋检测其营养品质、发酵品质。结果显示，30％全株大豆+70％甜高粱混合青贮ph值降至3.8左右，乳酸含量达到7.5％dm，均优于全株大豆单独青贮。相对于甜高粱单独青贮，混合青贮显著增加粗蛋白和粗脂肪含量。此外，添加乳酸菌中粗蛋白含量高于未添加组(p<0.05)。结果表明30％全株大豆+70％甜高粱混合青贮并复配乳酸菌具有最优青贮品质(表6)。表630％全株大豆与70％甜高粱混合青贮品质检测dm，干物质。同行肩标不同小写字母代表差异显著(p<0.05)。三、试验方案iii饲用大豆全株(鼓粒期，含水率65％)和甜高粱全株(乳熟期，含水率75％)同天收获。青贮前饲用大豆全株和甜高粱全株均切成2cm长，按照饲用大豆与甜高粱重量比为5：5的比例混匀，每袋20kg，同时喷洒植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wq-01菌粉(菌粉活性为1011cfu/g)，添加量为每克饲用大豆和甜高粱混合物鲜重添加106cfu(cfu，菌落形成单位)。然后人工压实，采用聚乙烯口袋抽真空密封青贮，每处理组5个重复，避光防鼠，室温(15-30℃)条件下贮藏。60天后开袋检测其营养品质、发酵品质。结果显示，相对全株大豆单独青贮，50％全株大豆+50％甜高粱混合青贮也能够显著改善发酵品质显著改善：ph值下降，乳酸含量显著上升，丁酸显著降低。添加乳酸菌，能够减少粗蛋白损失。表明50％全株大豆+50％甜高粱混合青贮具有优良的青贮品质，添加乳酸菌进一步改善了青贮品质(表7)。表750％全株大豆与50％甜高粱混合青贮品质检测dm，干物质。同行肩标不同小写字母代表差异显著(p<0.05)。<110>中国科学院微生物研究所；山西省农业科学院经济作物研究所；中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>一种饲用大豆与甜高粱混贮的方法<130>gncln181096<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1304<212>dna<213>lactocacillusplantarum<400>1tccccaccgactttgggtgttaaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggccc60gggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtag120gcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaagagattagcttactctcgcg180agttcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggca240tgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcaccagagtg300cccaacttaatgctggcaactgataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaac360atctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtatccatgtccccgaagggaa420cgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagctt480cgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcag540ccttgcggccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcg600gaaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatggactaccagggtatctaatcc660tgttatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagt720ttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctg780cgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctg840ctggcacgtagttagccgtggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactc900tcagatatgttcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgc960ggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtag1020gagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtat1080cattgccatggtgagccgttaccccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaa1140gtgatagccgaagccatctttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtatt1200agcatctgtttccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcacc1260agttcgccactcactcaaatgtaaatcatgatgcaagcaccaat1304当前第1页12