牛肝菌在调节肠道菌群中的应用的制作方法

本发明涉及牛肝菌在消化系统中的应用
技术领域：
，具体涉及牛肝菌在调节肠道菌群中的应用。
背景技术：
：牛肝菌多分布于云南，是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的统称，其滋味鲜美，营养丰富，具有一定的食用价值和药用价值，同时也是一种世界性著名食用菌。由于其具有多种抗病的药用保健价值，也随着人们目前的生活水平更多的人已不仅仅满足于自身的食用更加注重营养和健康的追求，目前也引起了众多学者对其的重视，逐渐由食用扩大转入到药用研究及药用开发研究。而菌中的糖类种类繁多，例如果糖、蔗糖、葡萄糖等等，为了进一步研究食用牛肝菌菌的食用价值和药用价值，该实验采用了荧光定量pcr技术对食用牛肝菌的小鼠菌群进行分析来进一步研究其对动物肠道微生物的益生作用及对益生菌群的影响作用。益生元(prebiotics)其作为一类膳食补充剂，益生元种类很多，有低聚糖，多糖，植物中草药提取物，蛋白质水解物，多元醇等等，大量生产商品化的主要是一些有双歧因子功能的低聚糖。低聚糖(由2～10个分子单糖组成)，是一种不被消化或难以被消化的食物成份，更重要的是它只是选择性的刺激一种或少数种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响从而改善寄主健康的食品成分(gibsonandroberfroid，1995)。同时其对双歧杆菌等益生菌有促进作用,目前研究表明益生元已具备如下功效：(1)非消化性和低热量；(2)减轻便秘；(3)调节肠内微生物菌群的平衡,增强免疫促进有益菌群(双歧杆菌等),抑制有害菌群(沙门氏菌等)。在我们肠道中主要有益菌群有乳酸菌和双歧杆菌，二者一起控制着人体生态菌群的平衡，同时对促进人体的健康发育、维持和提高机体的免疫力等方便起着重要的作用，而随着人们生活水平的提高人们更注重健康的饮食，所以市场上越来越多的人流行一种在食品或饮料中添加可以促进双歧杆菌生长的低聚糖，以此来增强自身的免疫和机体的健康。并通过其来刺激肠道内原有的双歧杆菌和乳酸杆菌的生长繁殖，达到同样的目的。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一种牛肝菌在调节肠道菌群中的应用，本发明提供的牛肝菌研磨后经动物口服后，能够有效提高肠道中有益菌乳酸菌和双歧杆菌菌群数量。本发明本发明提供了一种牛肝菌在调节肠道菌群中的应用，所述应用方法将牛肝菌直接口服。优选地，上述牛肝菌研磨成粉，加水溶解成水溶液再口服。本发明的有益效果为：食用一定量的牛肝菌后肠道中的乳酸杆菌属和双歧杆菌属有一定的促进作用,能够刺激二者的生长繁殖，同益生元一样具有一定的益生作用，使得肠道中的乳酸杆菌和双歧杆菌数量增加。附图说明图1为sybrgreen实时荧光定量pcr反应条件图；图2为双歧杆菌标准品标准曲线；图3为乳酸杆菌标准品标准曲线；图4为双歧杆菌dna样品定量pcr扩增图；图5为双歧杆菌dna样品定量pcr扩增熔解曲线；图6为乳杆菌dna样品定量pcr扩增图；图7为乳杆菌dna样品定量pcr扩增熔解曲线；具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：(1)实验材料与试剂昆明小鼠，益生元，粪便dna提取试剂盒，实时荧光定量试剂盒，琼脂糖凝胶电泳槽，冰板，1ml注射器,一次性手套,一次性实验口罩，婴儿双歧杆菌，植物乳杆菌，tae缓冲液，琼脂糖，上样缓冲液，电炉，marker，te缓冲液，灭菌水，dd水，引物。(2)仪器与设备表1主要实验仪器(3)动物喂食：将牛肝菌研磨成粉，加水制备成水溶液；实验小鼠随机分成3组，分别为阳性对照组(灌胃益生元溶剂)、实验组(灌胃牛肝菌粉末溶液)，空白实验组(灌胃生理盐水)每组5只，试验期间各组小鼠每日灌胃0.4ml样品，连续7d，分别采取实验动物第一天和第七天实验动物的新鲜粪便于自封袋中，放于-80摄氏度冰箱中保存。(4)粪便细菌dna的提取：①称取0.2g的粪便，加入400ul的sa溶液，在冰板上放置10min，12000rpm离心1min；②弃上清液，向沉淀中加入400ul溶液sb，加入10mg/ml的rna酶a，20ul10mg/ml的k,涡旋30s，在65℃水浴1h，期间进行数次的颠倒，12000rpm离心2min；③取上清于1.5ml的离心管中，加入400ul溶液sc，12000rpm离心2min，取上清；④吸取上清于吸附柱中，静置1-2min，12000rpm离心1min。⑤倒掉收集管中的废液，在吸附柱中加入漂洗液500ul，12000rpm离心1min。⑥倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心1min。⑦拿出吸附柱干燥数分钟将吸附柱放入一个新的离心管中，加入100ul的洗脱液(65℃预热)，12000rpm离心1min。⑧将离心管中的液体加入吸附柱中，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为dna溶液。并置于-20℃冰箱中保存。(5)dna浓度及纯度检测：①制胶：称取1g的琼脂糖置于锥形瓶中，加100ml1×tae溶液，加热至琼脂糖全部融化。冷却至60摄氏度左右，加入10ul的核酸染料安装好玻璃内槽，使两端边缘封好，形成模子，调平，放置好梳子，将琼脂糖倒入至完全凝固，取下梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，调加1×tae溶液，没过胶板1-2厘米为止。②加样：将10uldna样品与2ul的loadingbuffer混合，取10ul加入小曹内，第一格用marker作对照。③电泳：120v60min,当溴酚蓝移动到距离胶板下缘1cm处时，停止电泳。④观察：在紫外灯下进行观察，dna存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。(6)标准菌模板dna的制备：收集培养好的标准菌新鲜菌体，使用dna提取试剂盒提取dna，方法与粪便与粪便dna提取的方法一致，且dna产物应保存在-20℃，以防止dna的降解，引物序列名称如表2所示。表2引物序列名称将已经提取好的dna按照sybrgreen实时荧光定量pcr试剂盒进行荧光定量pcr实验。反应体系如表3所示。表3sybrgreen实时荧光定量pcr反应体系为方便操作可以按照样品数来配置bifidobacteriumgenus总体系的溶液50ul再分装于八排管中，最后在加入模板dna，同理配置引物lactobacillusgroup的混合体系分装于50个孔中再分别加入模板dna。将配好试剂的八排管按照设计好的顺序平整放置于实时pcr仪中。在电脑上设计好相应的条件，开始跑，于两小时后观察实验结果。反应条件为如说明书附图中图1所示。实验数据与结果分析：(1)标准曲线的制作：收集培养好的标准菌新鲜菌体，采用相同的方法试剂盒提取dna，将得到的dna样品用无菌te稀释10倍，并于紫外分光光度计测定a260，计算dna浓度，并根据每种细菌基因组大小计算相应模板数，将满足纯度要求的每个菌中的dna稀释5个浓度梯度制成系列标准品，将其做阳性模板进行荧光定量pcr反应，以标准品模板数的对数为横坐标，pcr反应过程中出现荧光信号的初始循环数(ct)为纵坐标即可作出标准曲线。其拷贝数＝(6.023x1023xdna浓度)/(660x碱基对数)，计算出每μl的拷贝(见表4)，稀释为5个浓度梯度其拷贝数的对数值作为横坐标，pcr反应过程中出现荧光信号的初始循环数(ct)的平均值为纵坐标即可作出双歧杆菌和乳酸杆菌标准曲线图分别如图2和图3所示。下列表4为双歧杆菌标准曲线数据，表5为乳酸菌标准曲线数据。双歧杆菌、乳杆菌的标准曲线及公式在excel中显示结果见表5和表7。结果显示：双歧杆菌标准曲线方程为y＝-2.59x+43.996，相关系数r2＝0.9881；乳杆菌的标准曲线方程为y＝-3.1x+39.048，相关系数r2＝0.9786。表4双歧杆菌标准曲线数据表5乳酸杆菌标准曲线数据(2)扩增曲线和样品熔解曲线扩增曲线是pcr动态过程中的曲线，呈s型。其中对数期是荧光信号指数扩增的阶段,pcr产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。其用于表示不同拷贝数的模板循环数与荧光强度的关系,分为基线期、对数期以及平台期3个阶段。通过实时荧光定量进行实时监测可得到标准品dna扩增图和样品熔解曲线，如图4-7所示。从双歧杆菌和乳酸杆菌pcr扩增熔解曲线中可以看出乳酸杆菌的峰只有一个说明其引物的特异性良好而双歧杆菌出现了两个峰值说明其特异性不是很好，存在的原因可能是引物的浓度太大。且扩增图中克看出dna模板随着循环数的增加，其荧光强度不断增，在pcr扩增图中找到相对应的样品的ct值并取三者的平均数。如表6和表7所示。表6引物lactobacillusgroup未知样品ct值样品ct值ct值ct值平均ct值1-121.405920.204220.643120.75111-231.474623.120123.444126.01292-124.541227.626825.644725.93762-231.724032.023332.540732.09603-122.420325.458924.307924.06243-227.693427.503729.207728.13493表7引物bifidobacteriumgenus未知样品ct值样品ct值ct值ct值平均ct值1-133.403130.794532.411432.20301-234.297734.552829.541732.79742-135.529635.473635.732935.57872-235.507736.322036.322036.05053-134.567428.494831.754131.605433-234.786635.923034.311735.0071(3)粪便样品中菌数的对数值计算双歧杆菌、乳杆菌的标准曲线及公式在excel中显示结果见表5和表7。结果显示：双歧杆菌标准曲线方程为y＝-2.59x+43.996，相关系数r2＝0.9881；乳杆菌的标准曲线方程为y＝-3.1x+39.048，相关系数r2＝0.9786.将lactobacillusgroup未知样品的ct值代入公式y＝-3.1x+39.048中得乳酸杆菌对数转换后的拷贝数，如表所示，将bifidobacteriumgenus未知样品ct值代入公式y＝-2.59x+43.996中得到双歧杆菌对数转换后的拷贝数，如表所示。表8乳酸杆菌对数转换后的拷贝数样品ct值(y)对数转换后的拷贝数(x)1-120.75115.90221-226.01294.20492-125.93764.22912-232.09602.24253-124.06244.83403-228.13493.5203表9双歧杆菌对数转换后的拷贝数样品ct值(y)对数转换后的拷贝数(x)1-132.20304.55321-232.79744.32372-135.57873.24992-236.05053.06773-131.60544.78603-235.00713.4706实验动物连续灌胃给予0.2ml益生元，牛肝菌，生理盐水7d，在灌胃第一天、灌胃7d时采集各组粪便样品。同时采用实时荧光定量pcr这一方法来检测各粪便样品中双歧杆菌、乳杆菌的数量。实时荧光定量pcr法是将采集的粪便样品提取dna，然后用相应的引物进行实时荧光定量pcr反应，可得到不同的ct值，根据标准曲线分别求出初始反应模板数的对数，进一步求得每组的每克粪便样品菌数的对数值。通过将未知样品的ct值带入到相应的标曲中对未知样品进行比对，阳性对照组(益生元实验组)的对数转换后的拷贝数高于实验组及空白对照组，且第五天的样品的拷贝数高于贝第一天样品的拷数，就实验组的拷贝数而言，其第五天的数据同样高于第一天样品的拷贝数，说明小白鼠在灌胃前后它的肠道内的微生物发生了一定的变化，通过连续灌胃牛肝菌使得体内的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量增多，再通过与空白实验组进行对照，进一步说明牛肝菌的益生作用，其对动物肠道内的有益微生物具有一定的促进作用。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12