一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法

1.本发明属于食品技术领域，尤其是一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法。


背景技术：

2.乳酸菌发酵上清液为乳酸菌发酵液离心后收集的上清液。乳酸菌发酵上清液中仍含有少量的活菌以及菌种在生长过程中的代谢产物，如有机酸、维生素、乳糖被分解成的半乳糖和乳酸以及蛋白质被分解成的小的肽链和氨基酸等，能够使乳液中的营养成分更易被吸收，扩大受益人群(乳糖不耐受者也可饮用)，并且能够调节人体肠道菌群，增强机体免疫力。
3.活性乳酸菌饮料通常是由乳或乳制品为原料，在经过乳酸菌发酵得到的乳液中加入水、甜味剂、酸味剂、果汁等配料，最后不经杀菌而成的饮料。其生产模式较为单一，缺乏创新性；而且存在大量继续产酸的乳酸菌，保质期内产品的酸度可能不断上升，活性乳酸菌饮料中的酪蛋白处于高度不稳定状态，容易发生分层和沉淀现象，从而影响产品的稳定性，因此产品的贮藏稳定性是活性乳酸菌饮料开发的技术难点之一；并且其主要的食用功效为帮助消化，对人体的保健作用较差。
4.红豆和薏米是极为常用的中药，也是食疗的佳品，为药食同源的食物。红豆又名赤小豆，含有蛋白、脂肪、糖类、皂角甘、叶酸、膳食纤维、多种氨基酸和微量元素，传统中医认为，红豆具有清热解毒、消肿利尿、健脾养胃等功效；薏米，又称薏仁米，含有蛋白质、薏米多糖、甘油三脂、三萜类、甾醇类、多种微量元素和多种氨基酸等。近年研究表明，薏米具有提高免疫力、降压、降血糖等药理活性。红豆和薏米具有相互辅佐的功效，两者经常搭配使用。红枣和乌梅也为药食同源的食品，常被用来搭配使用作为药膳的成分，具有补肺健脾、缩尿止遗的功效，作为其活性成分之一的红枣多糖和乌梅多糖，近年来有研究表明具有抗氧化、免疫调节、保肝、调节肠道菌群等作用。乳酸菌发酵上清液中含有发酵后的小分子代谢物，更易于人体吸收，同时发酵液经离心后除去了发酵液的颗粒感，增加了饮品的饮用口感。
5.活性的乳酸菌饮料的生产模式为首先经过乳酸菌发酵乳品后，再在发酵液中添加调味料，最后不经杀菌制成。活性乳酸菌饮料的储存要求高，一般都需要冷藏，货架期短，大大限制了产品的销售市场，增加了运输和储存成本。发酵原料种类单一，含有的营养成分种类较少，保健效果差。
6.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

7.本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法。
8.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
9.一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法，步骤如下：
10.(1)发酵培养基的制备：向奶制品中加入红豆薏米粉或红豆薏米汁或红豆薏米汤，使红豆薏米的质量浓度含量为5～15％，搅拌均匀，得发酵培养基；
11.(2)菌种的活化及菌液的制备：将具有保健功能的乳酸菌培养活化2
‑
3次后，离心倒掉上清液，用无菌的生理盐水清洗两遍后，将所得的乳酸菌与无菌生理盐水混合，制成乳酸菌菌液，其菌浓为～108cfu/ml；
12.(3)发酵：向发酵培养基中接入接种量1
‑
2％的乳酸菌菌液，厌氧培养10～12小时；
13.(4)发酵上清液的制备：将上述发酵液在6000～10000r的条件下离心5～15min，取上清液，得发酵上清液；
14.(5)多糖的添加：在发酵上清液中加入红枣多糖和乌梅多糖，使红枣多糖的质量终浓度为0.2～0.6％，乌梅多糖的质量终浓度为0.02～0.08％；
15.(6)调配：在上述溶液中加入蜂蜜，使蜂蜜的质量终浓度为0.2～0.8％，即得含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料。
16.进一步地，所述步骤(1)中奶制品为新鲜的纯牛奶、奶粉或炼乳调配的液体的一种或几种的混合物。
17.进一步地，所述步骤(2)中乳酸菌为乳杆菌属、微球菌属、链球菌属、片球菌属、乳球菌属、酵母菌、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属中的一种或几种的混合物。
18.进一步地，所述步骤(6)中添加蜂蜜后，再添加具有水果口味或蔬菜口味或者药食同源的液体或固体。
19.本发明取得的优点和积极效果为：
20.1、本发明方法将牛奶和红豆薏米作为原料进行乳酸菌发酵，再在发酵上清液中添加红枣多糖、乌梅多糖、蜂蜜等进行调配，开发出一种可口且营养丰富的乳酸菌发酵饮料，提高了红豆、薏米等产品的产值，促进红豆薏米和红枣乌梅等行业的精深加工，增强了人体的免疫力，丰富目前市场中乳酸菌饮料的种类。
21.2、本发明方法以牛奶和红豆薏米粉为培养基的发酵上清液，并向其添加含有药食同源食品的活性成分，提升产品的创新性与功能性。
附图说明
22.图1为本发明中红豆薏米粉添加量对饮料品质的影响图；
23.图2为本发明中发酵过程中培养基ph的测定图；
24.图3为本发明中蜂蜜添加量对饮料品质的影响图；
25.图4为本发明方法制得的饮料风味物质的总离子流图；
26.图5为本发明中成品饮料a和b中总糖的含量图；
27.图6为本发明中成品饮料a和b中还原糖的含量图；
28.图7为本发明中成品饮料a和b中蛋白质的含量图；
29.图8为本发明中成品饮料a和b中总酸的含量图；
30.图9为本发明中成品饮料a和b中总酚的含量图；
31.图10为本发明中成品饮料a和b中总黄酮的含量图；
32.图11为本发明中成品饮料a和b中的铁离子还原能力图；
33.图12为本发明中成品饮料a和b中的dpph自由基的清除能力图；
34.图13为本发明中成品饮料对小鼠外周血白细胞数的影响图；
35.图14为本发明中成品饮料对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响图；
36.图15为本发明中成品饮料对小鼠淋巴细胞转化的影响图；
37.图16为本发明中成品饮料对小鼠血清溶血素的影响图；
38.图17为本发明中成品饮料对小鼠抗体分泌功能的影响图；
39.图18为本发明中成品饮料对小鼠il
‑
2的影响图；
40.图19为本发明方法的一种工艺流程图。
具体实施方式
41.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
42.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
43.一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法，步骤如下：
44.(1)发酵培养基的制备：向奶制品中加入红豆薏米粉或红豆薏米汁或红豆薏米汤，使红豆薏米的质量浓度含量为5～15％，搅拌均匀，得发酵培养基；
45.(2)菌种的活化及菌液的制备：将具有保健功能的乳酸菌培养活化2
‑
3次后，离心倒掉上清液，用无菌的生理盐水清洗两遍后，将所得的乳酸菌与无菌生理盐水混合，制成乳酸菌菌液，其菌浓为～108cfu/ml；
46.(3)发酵：向发酵培养基中接入接种量1
‑
2％的乳酸菌菌液，厌氧培养10～12小时；
47.(4)发酵上清液的制备：将上述发酵液在6000～10000r的条件下离心5～15min，取上清液，得发酵上清液；
48.(5)多糖的添加：在发酵上清液中加入红枣多糖和乌梅多糖，使红枣多糖的质量终浓度为0.2～0.6％，乌梅多糖的质量终浓度为0.02～0.08％；
49.(6)调配：在上述溶液中加入蜂蜜，使蜂蜜的质量终浓度为0.2～0.8％，即得含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料。
50.较优地，所述步骤(1)中奶制品为新鲜的纯牛奶、奶粉或炼乳调配的液体的一种或几种的混合物。
51.较优地，所述步骤(2)中乳酸菌为乳杆菌属、微球菌属、链球菌属、片球菌属、乳球菌属、酵母菌、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属中的一种或几种的混合物。
52.较优地，所述步骤(6)中添加蜂蜜后，再添加具有水果口味或蔬菜口味或者药食同源的液体或固体。
53.具体地，相关制备及检测实施例如下：
54.实施例1
55.一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法，步骤如下：
56.(1)发酵培养基的制备：向新鲜的纯牛奶中加入红豆薏米粉，使红豆薏米粉的含量为11％，搅拌均匀。
57.(2)菌种的活化及菌液的制备：乳酸菌菌种如乳球菌属等具有保健功能的菌种于37℃下培养活化2
‑
3次后，离心倒掉上清液，用无菌的生理盐水清洗两遍后，将所得的乳酸
菌与无菌生理盐水混合，制成乳酸菌菌液。
58.(3)发酵：向培养基中接入2％的乳酸菌菌液，在37℃的温度下厌氧培养10～12小时。
59.(4)发酵上清液的制备：将上述发酵液在8000r的条件下离心10min，取上清液。
60.(5)多糖的添加：在发酵上清液中加入红枣多糖和乌梅多糖，使红枣多糖含量为0.43％，乌梅多糖含量为0.05％。
61.(6)调配：在上述溶液中加入蜂蜜，使蜂蜜含量为0.5％，即得到成品饮料。
62.其工艺流程可以如图19所示。
63.实施例2
64.一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法，步骤如下：
65.(1)发酵培养基的制备：向新鲜的纯牛奶中加入红豆薏米粉，使红豆薏米粉的含量为8％，搅拌均匀。
66.(2)菌种的活化及菌液的制备：乳酸菌菌种如乳球菌属等具有保健功能的菌种于适宜温度下培养活化2
‑
3次后，离心倒掉上清液，用无菌的生理盐水清洗两遍后，将所得的乳酸菌与无菌生理盐水混合，制成乳酸菌菌液。
67.(3)发酵：向培养基中接入1％的乳酸菌菌液，在适宜的温度下厌氧培养10～12小时。
68.(4)发酵上清液的制备：将上述发酵液在10000r的条件下离心5min，取上清液。
69.(5)多糖的添加：在发酵上清液中加入红枣多糖和乌梅多糖，使红枣多糖含量为0.2％，乌梅多糖含量为0.02％。
70.(6)调配：在上述溶液中加入蜂蜜，使蜂蜜含量为0.4％，适当添加黄瓜汁、番茄汁等具有蔬菜口味的液体或固体，即得到具有蔬菜牛奶口味的成品饮料。
71.实施例3
72.一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法，步骤如下：
73.(1)发酵培养基的制备：向新鲜的纯牛奶中加入红豆薏米粉，使红豆薏米粉的含量为7％，搅拌均匀。
74.(2)菌种的活化及菌液的制备：乳酸菌菌种如乳球菌属等具有保健功能的菌种于适宜温度下培养活化2
‑
3次后，离心倒掉上清液，用无菌的生理盐水清洗两遍后，将所得的乳酸菌与无菌生理盐水混合，制成乳酸菌菌液。
75.(3)发酵：向培养基中接入1％的乳酸菌菌液，在适宜的温度下厌氧培养10～12小时。
76.(4)发酵上清液的制备：将上述发酵液在6000r的条件下离心10min，取上清液。
77.(5)多糖的添加：在发酵上清液中加入红枣多糖和乌梅多糖，使红枣多糖含量为0.3％，乌梅多糖含量为0.03％。
78.(6)调配：在上述溶液中加入蜂蜜，使蜂蜜含量为0.3％，再适当添加草莓汁、苹果汁、香蕉汁等具有水果口味的液体或固体，即得到具有水果牛奶口味的成品饮料。
79.实施例4
80.一种含有乳酸菌发酵上清液的功能性饮料的制备方法，步骤如下：
81.(1)发酵培养基的制备：向新鲜的纯牛奶中加入红豆薏米粉，使红豆薏米粉的含量
为10％，搅拌均匀。
82.(2)菌种的活化及菌液的制备：乳酸菌菌种如乳球菌属等具有保健功能的菌种于适宜温度下培养活化2
‑
3次后，离心倒掉上清液，用无菌的生理盐水清洗两遍后，将所得的乳酸菌与无菌生理盐水混合，制成乳酸菌菌液。
83.(3)发酵：向培养基中接入2％的乳酸菌菌液，在适宜的温度下厌氧培养10～12小时。
84.(4)发酵上清液的制备：将上述发酵液在7000r的条件下离心10min，取上清液。
85.(5)多糖的添加：在发酵上清液中加入红枣多糖和乌梅多糖，使红枣多糖含量为0.4％，乌梅多糖含量为0.04％。
86.(6)调配：在上述溶液中加入蜂蜜，使蜂蜜含量为0.6％，再适当添加枸杞汁、山药汁等其他药食同源的液体或固体，即得到成品饮料。
87.本发明的相关检测：
88.一、饮料品质的感官测定
89.从滋味、气味、组织形态及色泽三方面对含乳饮料进行评分，根据3者的重要性分配分数比例，总分为100分，感官评分标准见表1。
90.表1感官评分标准
[0091][0092]
二、发酵上清液的配制
[0093]
1.菌种活化
[0094]
将乳酸菌菌种cicc 23191(市售)接种于mrs/m17培养基中，于37℃左右培养活化2
‑
3次，收集菌液留作备用。
[0095]
2.菌液制备
[0096]
将培养好的菌液离心倒掉上清液，用无菌的生理盐水清洗两遍后，将所得的乳酸菌与无菌生理盐水混合，制成乳酸菌菌液。
[0097]
3.发酵培养基的调配
[0098]
牛奶具有浓郁的奶香味，红豆薏米粉具有清香的豆粉味道，两者作为发酵培养基
的原料决定了乳酸菌饮料口感的基调，要想研制口感好的乳酸菌饮料，需要调整加入牛奶中的红豆薏米粉的比例来实现。依次按4％、7％、11％、15％、19％添加红豆薏米粉，得到感官评分(图1)。因此，确定红豆薏米粉的添加量最佳范围为7％～11％。
[0099]
4.乳酸菌的接种与发酵
[0100]
将乳酸菌菌液按2％的比例接种在发酵培养基中，在36℃的温度下厌氧培养，检测培养基在发酵过程中的ph值(图2)，有研究表明谷物饮品在ph值为4～5时口感优良，故确定发酵时间为12h。发酵液在8000r的条件下离心10min，得到发酵上清液备用。
[0101]
三、发酵上清液的调配
[0102]
1.红枣多糖、乌梅多糖的添加
[0103]
借鉴民间常用的红枣乌梅汤的做法(乌梅20克，大枣100克，清水1200克)并结合多糖的得率，确定发酵上清液中添加红枣多糖0.43％，乌梅多糖0.054％。
[0104]
2.蜂蜜的添加
[0105]
蜂蜜是糖的过饱和溶液，主要营养成分为果糖、葡萄糖和水分，还含有各种维生素、矿物质和氨基酸，具有清热，补中，润燥止痛美容养颜等功效。在饮料中添加蜂蜜不仅可以增强其的功能性，也可以提升其口感。在40ml的上述溶液中依次加入0g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g的蜂蜜，即蜂蜜含量为0％、0.25％、0.5％、1％、2％、4％，得到感官评分(图3)，因此确定蜂蜜的最佳添加量为0.5％，并得到饮料成品。
[0106]
四、成品测定
[0107]
在上述饮料的调配中，发现两种配方的饮料口感相近，将其命名为饮料a(牛奶中红豆薏米粉添加量4％，红枣多糖添加量0.43％，乌梅多糖添加量0.054％，蜂蜜添加量0.5％)、饮料b(牛奶中红豆薏米粉添加量11％，红枣多糖添加量0.43％，乌梅多糖添加量0.054％，蜂蜜添加量0.5％)，并检测两者的部分营养成分、生物活性物质及抗氧化能力的等指标，以确定饮料a与b的功能性能力的高低以此确定成品饮料的最佳配方。
[0108]
1.ph的测定
[0109]
检测成品饮料ph均为4.8左右。
[0110]
2.风味成分的测定
[0111]
检测结果如图4和表2所示。
[0112]
表2本发明方法制得的饮料挥发性物质gc
‑
ms分析结果
[0113]
[0114][0115]
香气成分是检测发酵饮料风味的主要指标，利用gc
‑
ms技术分离鉴定饮料的挥发性成分，饮料a与b的挥发性成分相近。由表2可知，样品中分析出45种成分，主要的挥发物质包括醇类9种，芳香杂环类9种，酸类7种，酮类4种，酯类3种，醛类1种。
[0116]
醇类物质为是饮料中的主要风味成分，对整体风味具有促进作用，例如正己醇具有果子香气，苯乙醇具有天然的玫瑰花香。芳香杂环类物质也是饮料中的主要风味成分，如呋喃类物质主要是糖与氨基酸发生美拉德反应，具有水果香、焦糖香、烤箱味；吡嗪类物质一般具有坚果香、爆米花香、咖啡香等香味。酸类物质可以使产品具有酸味感。酮类物质经过不饱和脂肪酸和氨基酸氧化、降解或是在发酵过程中代谢产生，赋予产品独特的风味，如2
‑
庚酮具有类似梨的水果香味。酯类物质具有成熟果香味或坚果味，如乙酸庚酯有玫瑰香梨的香气。醛类物质给饮料带来独特的花香味，如3
‑
甲基
‑
对茴香醛有茴芹和山楂香气。其余物质为烷烃类物质，其香气较弱，对饮料风味贡献较少。
[0117]
3.总糖含量的测定
[0118]
糖类在生命活动过程中起着重要的作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源。利用苯酚硫酸法测定饮料a与b中总糖的含量，如图5所示，结果显示饮料a中总糖的浓度为41.81mg/ml，即4.1％，饮料b中总糖的浓度为63.37mg/ml，即6.3％，可见饮料b的总糖含量高于a。
[0119]
4.还原糖含量的测定
[0120]
还原糖是指具有还原性的糖类。利用3,5
‑
二硝基水杨酸法检测饮料a与b中还原糖的含量，如图6所示，结果显示饮料a中还原糖的含量为1.10mg/ml，即0.11％，饮料b为1.25mg/ml，即0.12％，可见饮料b的还原糖含量高于a。
[0121]
5.蛋白含量的测定
[0122]
蛋白质是生命的物质基础，对人体的生命活动至关重要。利用考马斯亮蓝法检测饮料a与b中蛋白的含量，如图7所示，结果显示饮料a中的蛋白含量为7.66mg/ml，即0.77％，饮料b的蛋白含量为7.85mg/ml，即0.78％，可见饮料b的蛋白含量与a的较为接近。
[0123]
6.总酸含量的测定
[0124]
饮料中含有的有机酸既可以提高营养物质，也可以形成饮料的风味，还具有一定的抑菌效果，对饮料的生产具有重要的影响。利用酸碱滴定法测定饮料a与b中总酸的含量，如图8所示，结果显示饮料a与b中总酸的含量均为0.33mg/g，即0.03％，可见饮料b与a总酸的含量相同。
[0125]
7.总酚含量的测定
[0126]
酚类化合物是植物的重要代谢产物，主要包括酚酸、黄酮类化合物、单宁等，其具有抗氧化、清除自由基、预防心血管疾病等多种活性。利用福林酚比色法测定饮料a与b中总酚的含量，如图9所示，结果显示饮料a中的总酚的含量为1.49mg/ml，即0.15％，饮料b中的总酚含量为1.81mg/ml，即0.18％，可见饮料b的总酚含量高于饮料a。
[0127]
8.黄酮含量的测定
[0128]
黄酮类化合物具有抗自由基和抗氧化作用，在防治心血管疾病上具有很好的作用，同时能够诱发癌细胞和肿瘤细胞的凋亡，发挥抗癌抗肿瘤作用，提高机体免疫能力，促进机体健康。利用亚硝酸钠
‑
硝酸铝法测定饮料a与b中总黄酮的含量，如图10所示，结果显示饮料a中的总黄酮的含量为3.11mg/ml，即0.31％，饮料b中的总黄酮含量为3.73mg/ml，即0.37％，可见饮料b的总黄酮含量高于饮料a。
[0129]
9.抗氧化能力的测定
[0130]
科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联，研究抗氧
化可以有效克服其所带来的危害，抗氧化被保健品、化妆品企业列为主要的研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。人体的抗氧化物质有自身合成的，也有由食物供给的，机体抗氧化的能力越强，就越健康。
[0131]
由图11可知，饮料a的铁离子还原能力对应的od值为0.51，饮料b的铁离子还原能力对应的od值为0.64，可见两者都具有铁离子还原能力，且饮料b的还原能力强于饮料a。
[0132]
由图12可知，饮料a的dpph自由基清除率为80.24％，饮料b的dpph自由基清除率为86.25％，可见饮料b的dpph自由基清除能力强于a。
[0133]
综合结果可知，就感官评价及风味来说，饮料b与a相近；但就营养成分、生物活性物质及抗氧化能力来说，均是饮料b的指标高于a的，因此确定饮料b为最终的成品饮料。
[0134]
10.功能性动物实验
[0135]
实验分组：雄性健康小鼠80只，随机分为4组，每组20只。4组分别为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。
[0136]
给药方法：前3天，模型组灌胃生理盐水(每天25ml/kg)，低、中、高剂量组灌胃成品饮料b(低剂量组按人体推荐的5倍灌胃为每天14ml/kg、中剂量组按人体推荐的10倍灌胃为每天28ml/kg、高剂量组按人体推荐的15倍灌胃为每天42ml/kg)；第6～10天，每组均灌胃还琳酰胺(每天25mg/kg)。
[0137]
实验方法：外周血白细胞计数；腹腔巨噬细胞吞噬中性红细胞实验采用半体内法；cona诱导淋巴细胞转化实验采用mtt法；血清血溶素含量的测定采用半数溶血值；抗体分泌细胞测定采用玻片法；细胞因子il
‑
2使用lisa试剂盒检测。试验结果：统计结果如图13～图18所示。
[0138]
根据图13～图18，成品饮料b高剂量组可明显提高免疫力低下小鼠的外周血白细胞数、巨噬细胞的吞噬功能、脾脏t淋巴细胞的转化功能、血清血溶素含量、抗体生成细胞量及血清中il
‑
2的水平。提示本发明产品可能能提高机体一定的免疫能力。
[0139]
以上数据较充分地论证了乳酸菌发酵上清液、红豆薏米粉、红枣多糖、乌梅多糖、蜂蜜等制备药食同源功能性饮料的可行性。该饮品由乳酸菌发酵上清液与药食同源的食材制备而成，具有含量较高的黄酮和多酚功能性成分，兼具有药食同源食材的功能性，又具有较高的抗氧化活性和提高免疫力能力，不仅使产品具有顺滑的口感，清香得气味还具着营养保健的功能。可以作为休闲饮品广泛应用于食品工业。
[0140]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。