1.本发明属于生物发酵以及动物饲料领域，具体涉及一种低毒素高营养菜籽粕、分段发酵降解菜籽粕毒素的方法及应用。
背景技术：
2.油菜籽榨油后的副产物菜籽粕营养物质丰富，是一种重要的蛋白质饲料资源，粗蛋白质含量在35％～45％，氨基酸组成较为合理，但菜籽粕中存在硫苷、单宁、植酸等多种抗营养因子，在一定程度上影响了饲料的适口性和安全性，动物过多采食易中毒，造成脏器如肝脏和甲状腺的损伤，甚至引起畜禽死亡，这使其营养价值的利用受限。目前菜籽粕多运用于对抗因子不敏感的水产饲料中，而在畜禽饲料中很少使用。为改善菜籽粕的饲用价值，很有必要对菜籽粕进行脱毒处理。另外，菜籽粕中粗纤维、非淀粉纤维等含量高，菜籽粕的综合营养消化利用率低于豆粕、棉粕等植物蛋白源。预处理菜籽粕，降解大分子纤维素、木质素、蛋白质等，产生小肽、氨基酸、维生素等活性因子，提高菜籽粕的营养价值，对改善菜籽粕的饲用价值具有重要意义。
3.现有对菜籽粕毒素进行降解的方法如菌酶协同降解，尽管能够有效降解菜籽粕中的硫苷、单宁等毒素，但存在酶联微生物发酵工艺复杂，存在酶制剂使用量大，成本高的问题。而现有以米曲霉、黑曲霉作为菌剂进行好氧发酵，菜籽粕物料的损耗大，发酵时间超3天，物料干物质损耗超过20％，且发酵后的菜籽粕的气味不友好，适口性差。此外，采用混菌发酵的方法，存在菌株生长相互抑制，或者个别菌株生长良好，其他菌株生长不良的问题，对菜籽粕中的硫苷有一定的降解，但降解率不高，或者营养物质损耗大。
4.综上所述，现有技术在消除抗营养因子与改善菜籽粕营养品质、低物料损耗等方面难以做到平衡，且投资大，生产成本高。
技术实现要素：
5.针对现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种低毒素高营养菜籽粕、分段发酵降解菜籽粕毒素的方法及应用。本发明采用分段发酵的方式，兼顾好氧发酵与厌氧发酵，确保菜籽粕中抗营养因子的高效降解，同时缩短好氧发酵时间，降低微生物呼吸作用对菜籽粕中营养成分的损耗，最大限度保留菜籽粕的营养成分。
6.基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.第一方面，本发明提供一种分段发酵降解菜籽粕毒素的方法，包括如下步骤：
8.s1：将含有长柄木霉和米曲霉的复合曲种接种于菜籽粕，并向菜籽粕中加入碳源，进行好氧固态发酵；
9.s2：将含有近平滑假丝酵母菌和鼠李糖乳杆菌的复合菌液接种于菜籽粕，并向菜籽粕中加入碳源，进行兼性厌氧固态发酵；
10.s3：将经步骤s1发酵后的菜籽粕与经步骤s2发酵后的菜籽粕按照一定重量比混
合，将混合后的菜籽粕于30℃～40℃下厌氧发酵3～5天，将发酵结束的菜籽粕干燥制得低毒素高营养菜籽粕。
11.本发明第一段采用复合曲种发酵菜籽粕，利用复合曲种产生丰富的消化酶，利于后段大分子营养物质及抗营养因子的降解；第二段采用复合菌发酵菜籽粕，辅助降解大分子营养物质及抗营养因子，酵母菌、乳杆菌兼性厌氧生长，降低菌种呼吸作用对物料的损耗。
12.优选地，在步骤s3中，经步骤s1发酵后的菜籽粕与经步骤s2发酵后的菜籽粕的重量比为1:(2.3～9)。
13.经试验发现，随着混合物料中步骤s2发酵后的菜籽粕的比例的提高，硫苷降解率、单宁降解率及干物质损耗率也随之提高，当步骤s1发酵后的菜籽粕与经步骤s2发酵后的菜籽粕的重量比为1:(2.3～9)时，同时达到硫苷和单宁降解率高、干物质损耗率低的最佳效果。
14.优选地，在步骤s1和步骤s2中，所述碳源为大豆蜜糖，所述大豆蜜糖的加入量为5wt％～10wt％。
15.在步骤s1中，额外添加的碳源不仅作为复合曲种的能量来源，还对复合曲种发酵的产酶性能具有重要影响，经对分别由大豆蜜糖、蔗糖、葡萄糖、蔗糖蜜糖、玉米粉、可溶性淀粉等作为碳源时复合曲种的产酶性能进行试验，结果发现，相对于其他碳源，大豆蜜糖作为碳源具有更优的综合产酶性能，且中性蛋白酶、木聚糖酶、纤维素酶的酶活相对较高。
16.优选地，在步骤s1中，好氧固态发酵为浅层固态发酵，发酵物料的堆积深度为25～30cm，发酵物料的含水量为45％～48％，好氧发酵的温度为25～32℃，发酵时间为28h，发酵期间每隔4h将发酵物料翻耙一次。
17.优选地，在步骤s2中，发酵物料的堆积深度为50～60cm，发酵物料的含水量为45％～48％，兼性厌氧发酵的温度为25～32℃，发酵时间为28h。
18.优选地，在步骤s3中，干燥的温度不高于95℃，干燥后低毒素高营养菜籽粕的含水量低于12％。
19.优选地，在步骤s1中，含有长柄木霉和米曲霉的复合曲种于菜籽粕中的接种量为0.5～2.0
‰
；在步骤s2中，含有近平滑假丝酵母菌和鼠李糖乳杆菌的复合菌液于菜籽粕中的接种量为0.5～2.0
‰
。
20.优选地，复合曲种中总孢子数≥1
×
109cfu/g；复合曲种中长柄木霉孢子数占比为10％～30％；米曲霉孢子数占比为70％～90％。
21.优选地，复合菌液中平滑假丝酵母的活菌数≥5
×
108cfu/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数≥5
×
108cfu/g。
22.第二方面，本发明提供一种由上述方法制得的低毒素高营养菜籽粕。
23.优选地，本发明低毒素高营养菜籽粕中粗蛋白含量≥40.0％，酸溶蛋白≥20.0％，粗纤维含量≤6.0％；有效磷含量≥0.5％，植酸含量≤1.0％，单宁含量≤0.7％，硫甙含量≤8μmol/g。
24.第三方面，本发明提供上述低毒素高营养菜籽粕替代豆粕在动物饲料中的应用。
25.优选地，本发明低毒素高营养菜籽粕在动物饲料中对豆粕的替代率达80％。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
27.(1)本发明第一段采用复合曲种发酵菜籽粕，利用复合曲种产生丰富的消化酶，利于大分子营养物质及抗营养因子的降解；第二段采用复合菌发酵菜籽粕，酵母菌、乳杆菌兼性厌氧生长，降低菌种呼吸作用对物料的损耗，辅助降解大分子营养物质及抗营养因子。本发明采用两步两段发酵工艺兼顾了好氧发酵与厌氧发酵的的优缺点，在保证抗营养因子硫苷、单宁等充分降解的同时，缩短菜籽粕好氧发酵时间，控制菜籽粕中干物质损耗在8％以下，干物质损耗率低，味道酸香，畜禽适口性好，降本增效显著。
28.(2)由本发明所述发酵方法处理后的菜籽粕中抗营养类物质降解充分，硫苷类降解率≥80％、单宁降解率≥60％，植酸降解率≥50％，能够高比例添加于猪禽饲料中；且菜籽粕中酸溶蛋白占总蛋白比≥12％，粗纤维含量降低至≤6.5％，味道酸香，畜禽适口性好，更有利于消化吸收，提高营养物质的利用率，能够替代80％的豆粕应用于畜禽饲料。
具体实施方式
29.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
30.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
31.实施例1
32.本实施例提供一种分段发酵降解菜籽粕毒素以获得低毒素高营养菜籽粕的方法，具体步骤如下：
33.s1：复合曲种的制备
34.米曲霉曲种的制备：发酵物料包括菜籽粕50～80％、麸皮5～20％、玉米粉10～30％，按照固液比10∶7将米曲霉孢子悬液加入发酵物料并混合均匀，随后装入浅盘(浅盘深度为25～30cm)，于28℃培养2天，制得米曲霉曲种。
35.长柄木霉曲种的制备：发酵物料包括菜籽粕50～80％，麸皮5～20％，玉米粉10～30％，按照固液比10∶7将长柄木霉的孢子悬液加入发酵物料并混合均匀，随后装入浅盘(浅盘深度为25～30cm)，于28℃培养2天，制得长柄木霉曲种。
36.将长柄木霉曲种与米曲霉曲种按重量比1∶1混合制得复合曲种，复合曲种中总孢子数≥1
×
109cfu/g；复合曲种中长柄木霉孢子数占比为10％～30％；米曲霉孢子数占比为70％～90％。
37.s2：复合菌液的制备
38.鼠李糖乳杆菌菌种的制备：培养基包括蛋白胨5～20g/l、牛肉膏5～20g/l、酵母提取物3～10/l、葡萄糖3～10g/l、乙酸钠3～10g/l、柠檬酸二胺1～5g/l、吐温80 0.5～2g/l、磷酸氢二钾1～3g/l、七水硫酸镁0.1～0.5g/l、七水硫酸锰0.01～0.1g/l、碳酸钙10～30g/l，将鼠李糖乳杆菌接种于该培养基，37℃静置培养48h，制得鼠李糖乳杆菌菌液。
39.近平滑假丝酵母菌种的制备：培养基包括糖蜜20～50g/l、硫酸铵2～10g/l、酵母粉0.5～2g/l、蛋白胨1～3g/l、kh2po4 0.1～1g/l，将近平滑假丝酵母接种于该培养基，于37℃，180r/min，摇瓶培养36h，制得近平滑假丝酵母菌菌液。
40.将鼠李糖乳杆菌菌液与近平滑假丝酵母菌菌液按照重量比1:1混合制得复合菌
液，复合菌液中平滑假丝酵母的活菌数≥5
×
108cfu/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数≥5
×
108cfu/g。
41.s3：第一段好氧发酵
42.将大豆糖蜜经管道输送至配料罐，向配料罐中加入重量为大豆蜜糖6倍的水，搅拌混匀形成大豆蜜糖稀释液，步骤s1制得的复合曲种接种量为2
‰
，加入大豆糖蜜稀释液中，搅拌混匀形成混合液。
43.将粗粉碎的菜籽粕经配料秤称重进入混合机，配料罐中混合液经配料秤称重，管道输送至混合机，菜籽粕与混合液重量比为9:7，菜籽粕与混合液进行固液充分混合，最终物料水分含量为45％～48％，大豆蜜糖的重量百分比为6.3％。将充分混合后的物料输送至发酵槽，平铺深度为25～30cm，保持室内发酵温度为25℃～32℃，相对湿度为75％～85％，发酵时间为28h，期间每隔4h翻耙一次物料，增加物料的透气性，以便促进胞外酶的分泌，同时延缓孢子的形成。
44.s4：第二段兼性厌氧发酵
45.将大豆糖蜜经管道输送至另一配料罐，并加入重量为大豆蜜糖6倍的水，搅拌混匀形成大豆蜜糖稀释液，步骤s2制得的复合菌种接种量为2
‰
，加入大豆糖蜜稀释液中，搅拌混匀形成混合液。
46.将粗粉碎的菜籽粕经配料秤称重进入混合机，配料罐中混合液经配料秤称重，管道输送至混合机，菜籽粕与混合液进行固液充分混合，最终物料水分含量为45％～48％，大豆蜜糖的重量百分比为6.3％。将充分混合后的物料装入发酵木箱(深度为50～60cm)，保持发酵室温度30℃～35℃，相对湿度75％～85％，发酵时间28h。
47.s5：混合厌氧发酵
48.将步骤s3复合曲种初步发酵的菜籽粕与步骤s4复合菌液发酵的菜籽粕经皮带称重机称重，按重量比1:4输送至滚筒式混合机混合，混合后物料经绞龙进入厌氧发酵池，经3～5天充分发酵，将发酵成熟物料在95℃以下，干燥至含水量低于12％，制得本发明低毒素高营养的菜籽粕成品。
49.由本发明工艺所获得的菜籽粕产品质量如下：
50.发酵后菜籽粕的外观呈棕黄色粉末，菜籽粕的气味呈酸香味；发酵前后菜籽粕中的指标对比如表1所示，发酵后菜籽粕中底物损耗≤8％，发酵后菜籽粕中粗蛋白含量≥40.0％，酸溶蛋白≥20.0％，粗纤维含量≤6.0％，植酸≤1.0％，单宁≤0.7％，硫甙含量≤8μmol/g，水分≤12％。
51.由表1结果可知，本发明所述发酵工艺使得菜籽粕中粗蛋白、粗纤维等大分子物质得到了有效降解，更利于营养物质的吸收利用；菜籽粕中的硫甙、单宁等抗营养因子含量大幅降低，使得本发明发酵菜籽粕在猪禽饲料中高比例添加应用成为可能。
52.表1菜籽粕发酵前后物质含量的比较(以风干物质计，％)
53.项目发酵前发酵后增加量(％)发酵底物重/kg10093.6-6.4粗蛋白/％38.3340.194.86酸溶蛋白(占总蛋白比)/％2.1621.76907.40粗纤维/％11.825.33-54.90
植酸/％1.560.83-46.79单宁/％1.810.65-64.44硫甙/μmol/g39.757.25-81.76
54.实施例2
55.本实施例旨在探究碳源的种类对复合曲种固体发酵产酶的影响，具体试验方法如下：
56.参照实施例1中复合曲种的制备方法，复合曲种中总孢子数≥1
×
109cfu/g；复合曲种中长柄木霉孢子数占比为10％～30％；米曲霉孢子数占比为70％～90％。将复合曲种添加于粉碎菜籽粕，接种量为2
‰
，并向菜籽粕中添加碳源大豆糖蜜6.3wt％，调节发酵物料的水分至46.5％，将发酵物料装入浅盘(浅盘深度为25～30cm)进行浅层固态发酵，于28℃，培养28h，随后于55℃烘干并粉碎过筛，进行发酵后菜籽粕中酶活的测定。
57.仅将碳源依次调整为蔗糖、葡萄糖、蔗糖糖蜜、玉米粉、可溶性淀粉等碳源代替大豆糖蜜，其他条件不变，测定发酵后菜籽粕中的酶活。
58.蛋白酶活力测定方法按照gbt23874-2009《木聚糖酶活性测定分光光度法》进行，酶活定义为在温度40℃
±
0.2℃、ph7.2条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μ酚基氨基酸的酶量为1个酶活单位。
59.木聚糖酶活力测定方法按照gbt28715-2012《酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法》进行，酶活定义为在37℃、ph为5.50的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位。
60.纤维素酶活力测定方法按照nyt912-2004《饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法》进行，酶活定义为在37℃、ph为5.50的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
61.不同碳源对复合曲种固体发酵产酶的影响试验结果如表2所示，发酵后菜籽粕中的中性蛋白酶活在4845.6～5387.9u/g，以蔗糖糖蜜作为碳源最优，酶活达5387.9u/g，其次为大豆糖蜜，酶活达5327.5u/g，与蔗糖糖蜜组接近；木聚糖酶活在3867.7～4534.9u/g，以大豆糖蜜作为碳源最优，酶活达4534.9u/g，比蔗糖糖蜜组提高了7.4％；纤维素酶活在256.1～464.4u/g，以大豆糖蜜作为碳源最优，酶活达464.4u/g，比蔗糖糖蜜组提高了48.7％。
62.综上结果可知，大豆糖蜜作为碳源比蔗糖糖蜜、葡萄糖等有着更优的综合产酶性能，发酵后所产生的中性蛋白酶、木聚糖酶、纤维素的酶活相对较高，且大豆糖蜜的价格相对低廉、更有利于工业化生产。
63.表2不同碳源对复合曲种固体发酵产酶的影响
64.项目大豆糖蜜蔗糖葡萄糖蔗糖糖蜜玉米粉可溶性淀粉中性蛋白酶活(u/g)5327.55334.25323.85387.95226.24845.6木聚糖酶活(u/g)4534.93764.14063.24221.44054.33867.7纤维素酶(u/g)464.4321.2256.1312.3356.3331.8
65.实施例3
66.本实施例探究两段发酵菜籽粕的复配比例对菜籽粕干物质损耗率及硫甙降解率的影响，试验方法如下：
67.参照实施例1分段发酵降解菜籽粕毒素以获得低毒素高营养菜籽粕的方法，仅调整步骤s5中由步骤s3复合曲种初步发酵的菜籽粕与由步骤s4复合菌液发酵的菜籽粕的复配比例依次为1:19、1:9、3:17(1:5.6)、1:4、1:3、3:7(1:2.3)、7:13(1:1.86)、2:3(1:1.5)，其余未述及部分均同实施例1，测定最终发酵产物菜籽粕中硫苷降解率、单宁降解率及干物质损耗率等指标。
68.表3不同配比对硫苷降解率、单宁降解率及干物质损耗的影响
69.复配比例硫苷降解率％单宁降解率％干物质损耗率％1:1976.758.95.11:980.261.35.63:1781.162.86.11:481.864.56.41:382.666.77.23:784.570.17.97:1385.171.69.32:385.472.210.8
70.由表3结果可知，随着复合曲种好氧发酵菜籽粕与复合菌液兼性厌氧发酵菜籽粕复配比例的不断提高，菜籽粕中硫苷降解率、单宁降解率及干物质损耗率也随之提高，当两者复配比例为2:3时，尽管硫苷、单宁的降解率最高，但同时干物质的损耗率也高达10.8％，因此，综合菜籽粕成品中抗营养因子的降解率以及干物质损耗量，选择两种发酵菜籽粕的复配比例介于1:9～3:7即1:(2.3～9)较为适宜。
71.对比例1
72.参照实施例1分段发酵降解菜籽粕毒素以获得低毒素高营养菜籽粕的方法，将步骤s4和步骤s5均调整为步骤s3中好氧发酵的方式，步骤s1-s3同实施例1。
73.本对比例步骤s4的过程调整如下：
74.将大豆糖蜜经管道输送至另一配料罐，并加入重量为大豆蜜糖6倍的水，搅拌混匀形成大豆蜜糖稀释液，步骤s2制得的复合菌液接种量为2
‰
，加入大豆糖蜜稀释液中，搅拌混匀形成混合液。
75.将粗粉碎的菜籽粕经配料秤称重进入混合机，配料罐中混合液经配料秤称重，管道输送至混合机，菜籽粕与混合液进行固液充分混合，最终物料水分含量为45％～48％，菜籽粕中大豆蜜糖的重量百分比为6.3％。将充分混合后的物料装入发酵槽，堆料深度为25～30cm，保持发酵室温度30℃～35℃，相对湿度75％～85％，发酵时间28h。
76.步骤s5的过程调整如下：
77.将步骤s3复合曲种初步发酵的菜籽粕与步骤s4复合菌液发酵的菜籽粕经皮带称重机称重，按重量比1:4输送至滚筒式混合机混合，混合后物料经绞龙进入发酵槽，堆料深度为25～30cm，经3～5天充分发酵，将发酵成熟物料在95℃以下，干燥至含水量低于12％，制得本对比例菜籽粕成品，记为对比例1。
78.对比例2
79.参照实施例1分段发酵降解菜籽粕毒素以获得低毒素高营养菜籽粕的方法，将步骤s3和步骤s5均调整为步骤s4中兼性厌氧发酵的方式，步骤s1～s2以及s4同实施例1。
80.本对比例步骤s3的过程调整如下：
81.将大豆糖蜜经管道输送至配料罐，向配料罐中加入重量为大豆蜜糖6倍的水，搅拌混匀形成大豆蜜糖稀释液，步骤s1制得的复合曲种接种量为2
‰
，加入大豆糖蜜稀释液中，搅拌混匀形成混合液。
82.将粗粉碎的菜籽粕经配料秤称重进入混合机，配料罐中混合液经配料秤称重，管道输送至混合机，菜籽粕与混合液进行固液充分混合，最终物料水分含量为46.5％，菜籽粕中大豆蜜糖的重量百分比为6.3％。将充分混合后的物料输送至装入发酵木箱(堆料深度为50～60cm)，保持室内发酵温度为25℃～32℃，相对湿度为75％～85％，发酵时间为28h。
83.本对比例步骤s5的过程调整如下：
84.将步骤s3复合曲种初步发酵的菜籽粕与步骤s4复合菌液发酵的菜籽粕经皮带称重机称重，按重量比1:4输送至滚筒式混合机混合，混合后物料经绞龙进入装入发酵木箱(堆料深度为50～60cm)，经3～5天充分发酵，将发酵成熟物料在95℃以下，干燥至含水量低于12％，制得本对比例菜籽粕成品，记为对比例2。
85.对比例3
86.参照实施例1分段发酵降解菜籽粕毒素以获得低毒素高营养菜籽粕的方法，将步骤s3和步骤s4均调整为步骤s5中厌氧发酵的方式，步骤s1、s2、s5同实施例1。
87.本对比例步骤s3调整如下：
88.将大豆糖蜜经管道输送至配料罐，向配料罐中加入重量为大豆蜜糖6倍的水，搅拌混匀形成大豆蜜糖稀释液，步骤s1制得的复合曲种接种量为2
‰
，加入大豆糖蜜稀释液中，搅拌混匀形成混合液。
89.将粗粉碎的菜籽粕经配料秤称重进入混合机，配料罐中混合液经配料秤称重，管道输送至混合机，菜籽粕与混合液进行固液充分混合，最终物料水分含量为45％～48％，菜籽粕中大豆蜜糖的重量百分比为6.3％。将充分混合后的物料输送至厌氧发酵池，保持室内发酵温度为25℃～32℃，相对湿度为75％～85％，密封发酵时间为28h。
90.本对比例步骤s4调整如下：
91.将大豆糖蜜经管道输送至另一配料罐，并加入重量为大豆蜜糖6倍的水，搅拌混匀形成大豆蜜糖稀释液，步骤s2制得的复合菌液接种量为2
‰
，加入大豆糖蜜稀释液中，搅拌混匀形成混合液。
92.将粗粉碎的菜籽粕经配料秤称重进入混合机，配料罐中混合液经配料秤称重，管道输送至混合机，菜籽粕与混合液进行固液充分混合，最终物料水分含量为45％～48％，菜籽粕中大豆蜜糖的重量百分比为6.3％。将充分混合后的物料装入厌氧发酵池，保持发酵室温度30℃～35℃，相对湿度75％～85％，发酵时间28h。
93.参照本对比例所述工艺制得的发酵菜籽粕成品记为对比例3。
94.对比例4
95.本对比例与实施例1的区别仅在于步骤s3和步骤s4不同，步骤s1、s2、s5同实施例1。本对比例采用将步骤s1复合曲种和步骤s2的复合菌液共同接种于粉碎菜籽粕中，进行好氧发酵。
96.本对比例采用将复合曲种及复合菌种均按照2
‰
的接种量接种于粉碎菜籽粕，添加大豆糖蜜6.3％，调节发酵物料的含水量为45～48％，将发酵物料输送至发酵槽，平铺深
度为25～30cm，保持室内发酵温度为28℃～30℃，相对湿度为75％～85％，发酵时间为28h，期间每隔4h翻耙一次物料。
97.由本对比例所述发酵工艺制得的菜籽粕记为对比例4。
98.对比例5
99.本对比例与实施例1的区别仅在于步骤s3和步骤s4不同，步骤s1、s2、s5同实施例1。本对比例采用将步骤s1复合曲种和步骤s2的复合菌液共同接种于粉碎菜籽粕中，进行兼性厌氧发酵。
100.本对比例采用将复合曲种及复合菌种均按照2
‰
的接种量接种于粉碎菜籽粕，添加大豆糖蜜6.3％，调节发酵物料的含水量为45～48％，将发酵物料装入发酵木箱(堆料深度为50～60cm)，保持室内发酵温度为28℃～30℃，相对湿度为75％～85％，发酵时间为28h。
101.由本对比例所述发酵工艺制得的菜籽粕记为对比例5。
102.对比例6
103.本对比例与实施例1的区别仅在于步骤s3和步骤s4不同，步骤s1、s2、s5同实施例1。本对比例采用将步骤s1复合曲种和步骤s2的复合菌液共同接种于粉碎菜籽粕中，进行厌氧发酵。
104.本对比例采用将复合曲种及复合菌种均按照2
‰
的接种量接种于粉碎菜籽粕，添加大豆糖蜜6.3％，调节发酵物料的含水量为45～48％，将发酵物料装入厌氧发酵池，保持室内发酵温度为28℃～30℃，相对湿度为75％～85％，发酵时间为28h。
105.由本对比例所述发酵工艺制得的菜籽粕记为对比例6。
106.对对比例1～6中所述菜籽粕中的硫苷降解率、单宁降解率和干物质损耗率进行检测，结果如表4所示。
107.表4不同发酵处理对硫苷降解率、单宁降解率及干物质损耗的影响
108.试样硫苷降解率％单宁降解率％干物质损耗率％实施例181.864.56.4对比例181.966.414.1对比例277.161.29.4对比例328.624.83.5对比例482.268.714.3对比例566.353.98.1对比例623.919.53.2
109.由表4可知，菜籽粕浅层固体发酵即好氧发酵(对比例4)，菜籽粕中硫苷降解率达82.2％、单宁降解率达68.7％、但不及两步两段发酵，而因曲种强烈的呼吸作用，干物质损耗率达14.3％，干物质损耗高、风味差，经济效益差。菜籽粕深层固体发酵，即兼性厌氧发酵(对比例5)，菜籽粕中硫苷降解率达66.3％、单宁降解率达53.9％、但不及两步两段发酵，干物质损耗率达8.1％，干物质损耗率仍然偏高，综合发酵效果仍不及两步两段发酵。菜籽粕密封厌氧发酵(对比例6)，尽管干物质损耗率只有3.2％，但硫苷降解率只有23.9％、单宁降解率只有19.5％，该发酵方法未能发挥曲种有氧呼吸产酶性能、也未能发挥菌种有氧呼吸代谢性能，硫苷、单宁等抗营养物质降解率过低。
110.实施例4
111.本实施例利用实施例1制得的发酵菜籽粕，分析其对生长猪营养物质消化率、生长性能的影响。
112.1、材料与方法
113.试验动物与设计：试验选择100头平均体重为(41.6
±
1.7)kg的生长猪，随机分为4组，每组5个重复，每个重复5头猪，ⅰ组饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，ⅱ组由未发酵处理的菜籽粕替代40％的豆粕，ⅲ组由实施例1制得的发酵菜籽粕替代40％豆粕，ⅳ组由实施例1制得的发酵菜籽粕替代80％豆粕，试验饲粮参照nrc(2012)生长猪营养需要，按等能等氮的原则配制，其组成及营养水平见表5，由于试验日粮组成的营养水平需保持一致，故其原料组分上略有差异。
114.表5试验日粮组成及营养价值(风干基础)
115.原料组ⅰ组ⅱ组ⅲ组ⅳ玉米，％74.169.471.569.6麦麸，％2.5533豆粕，％2012124菜籽粕，％
‑‑8‑‑‑‑
发酵菜籽粕，％
‑‑‑‑
816玉米蛋白粉，％
‑‑
0.511.8大豆油，％
‑‑
1.512石粉，％0.50.50.50.5磷酸氢钙，％1111食盐，％0.30.30.30.3赖氨酸，％0.410.560.480.55蛋氨酸，％0.120.140.130.14苏氨酸，％0.070.10.090.11预混料，％1111营养水平组ⅰ组ⅱ组ⅲ组ⅳ消化能(mj/kg)13.6213.6113.6213.60粗蛋白，％15.4015.4115.4015.40总磷，％0.540.550.560.57赖氨酸，％1.051.061.051.03蛋+半胱，％0.590.610.620.64苏氨酸，％0.630.640.640.64
116.注：每kg预混料含有：维生素a 12000iu；维生素d
3 1100iu；维生素e 25iu；维生素k 4mg；维生素b
12 0.04mg；泛酸28mg；尼克酸32mg；氯化胆碱8g；mgso4100g；feso
4 120g；cuso
4 0.45g；mnso
4 2.2g；znso
4 5g；na2seo
3 10mg；ki 40mg；cocl222mg。
117.试验在广东从化聚祥猪场进行，试验猪饲养在封闭式猪舍内，水泥地面，通风良好。试验期间自由采食和饮水，每天定时清扫猪圈，保持光照和温度适宜；每天观察猪群采食情况、粪便及健康状况，其他饲养管理遵循猪场常规管理制度，试验共开展42d。
118.生长性能的测定测定方法如下：
119.试验猪在试验开始和结束时分别于早晨空腹称重，试验期间记录每个重复的饲粮消耗，计算平均日采食量、平均日增重和料重比。
120.饲料养分表观消化率测定方法如下：
121.每个重复随机选取1头猪分别于试验15、25、35d采集粪样200g，加10％盐酸进行固氮，所采集的粪样在55℃条件下烘干至恒重，粉碎过60目分样筛，用于相关指标测定。试验采用酸不溶灰分(aia)法测定饲料养分表观消化率，参照美国aoac(2000)的分析方法测定饲料和粪便中的养分含量。
122.统计分析
123.试验结果以平均值和集合标准误(sem)表示，试验数据采用spss 21.0统计软件进行方差分析，用duncan's法进行多重比较，用一般线性模型进行回归分析，以p《0.05表示差异显著，0.05≤p《0.1表示有差异显著趋势。
124.2、结果与分析
125.2.1发酵菜籽粕对生长猪生长性能的影响
126.发酵菜籽粕对生长猪的生长性能影响结果如表6所示，试验组ⅱ平均日增重及平均日采食量均低于其他各组，料重比也高于其他各组，表明未发酵处理的菜籽粕的添加对生长猪的采食与生长产生了一定负面影响；试验组ⅲ与试验组ⅳ平均日增重、平均日采食量与料重比与组ⅰ没有显著差异，表明发酵菜籽粕代替豆粕对生长猪的采食与生长无不良影响，发酵菜籽粕最高可以替代日粮中80％的豆粕。
127.表6发酵菜籽粕替代豆粕对生长猪生长性能的影响
128.项目组ⅰ组ⅱ组ⅲ组ⅳ初始体重/kg41.6
±
1.541.7
±
1.341.5
±
1.541.6
±
1.7末重/kg73.4
±
1.672.2
±
2.973.5
±
1.773.4
±
2.0平均日增重(g/d)756.36
±
25.36725.27
±
46.68762.81
±
17.59758.93
±
26.78平均日采食量(kg/d)1.85
±
0.051.80
±
0.091.85
±
0.071,86
±
0.09料重比2.45
±
0.92.48
±
0.122.42
±
0.072.45
±
0.08
129.2.2发酵菜籽粕对生长猪养分表观消化率的影响
130.发酵菜籽粕对生长猪养分表观消化率的影响试验结果如表7所示，与组ⅰ相比，组ⅱ粗蛋白质表观消化率降低了3.82％(p《0.05)，组ⅲ、组ⅳ粗蛋白表观消化率分别提高了0.19％、0.62％(p《0.05)，表明未经发酵处理的菜籽粕的表观消化率低于豆粕，而经本发明所述工艺发酵处理的菜籽粕的表观消化率高于豆粕。与组ⅰ相比，组ⅱ粗脂肪表观消化率分别降低了0.76％(p《0.05)，粗纤维表观消化率分别降低了4.53％，总磷表观消化率分别降低了1.26％(p《0.05)；与组ⅰ相比，组ⅲ、组ⅳ粗脂肪表观消化率分别提高了3.51％、3.57％(p《0.05)，粗纤维表观消化率分别提高了3.80％、6.17％，总磷表观消化率分别提高了2.01％、3.30％(p《0.05)，表明菜籽粕通过本发明所述发酵工艺处理后有助于粗脂肪、粗纤维、磷等营养物质的吸收。
131.表7发酵菜籽粕对生长猪养分表观消化率的影响(％)
132.项目组ⅰ组ⅱ组ⅲ组ⅳ粗蛋白质/％85.76
±
0.4382.48
±
0.5685.92
±
0.4286.29
±
0.40
粗脂肪/％72.73
±
0.5872.18
±
0.7575.28
±
0.5375.33
±
0.53粗纤维/％45.52
±
0.73a43.46
±
0.65a47.25
±
0.6848.33
±
0.79b总磷/％61.16
±
0.8560.39
±
0.7462.73
±
0.8763.18
±
0.72
133.注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(p＜0.05)，肩标相同字母或无字母表示差异不显著(p＞0.05)。
134.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。