专利名称：雷怕霉素检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及雷怕霉素及其衍生物的单克隆抗体，它们可用于例如检测血药浓度的检测试剂盒中。
雷怕霉素是由吸水链霉菌产生的大环内酯抗菌素，有广泛的制药学用途，尤其可作为一种免疫抑制剂，例如可应用于治疗和预防器官移植排斥和自身免疫疾病。但是，雷怕霉素在大剂量时会有副作用，并且它的生物利用度在一定程度上可变。在用雷怕霉素治疗的病人中，为了能够及时调整剂量以保持有足够药理作用的最低雷怕霉素含量，以及避免副作用产生的任何过度危害，监测患者血液中雷怕霉素浓度就变得尤为重要。但在临床中缺少能够快速简易操作的灵敏、可靠的检测方法，仍是目前雷怕霉素药物研究的一个主要障碍。
以前有关临床检测雷怕霉素的检测试剂盒的研究都不太成功。例如，EP041795描述了一种微生物学检测法，其中雷怕霉素浓度由其抗真菌活性函数来测定。WO92/02946提供了一种间接测定雷怕霉素的检测系统，即测定其与嗜巨噬因子(macrophilin)间的竞争结合。这两种测定方法都繁琐且不太灵敏。更重要的是，实验条件稍有不同，这两种方法的结果都会有很大变化，难以在不同医院间进行实验结果的比较。
在此之前还没有关于识别雷怕霉素的单克隆抗体的报导。由于雷怕霉素不是致免疫的，而且它自身是极强的免疫抑制剂，因此制备雷怕霉素的单克隆抗体非常困难。此外，由于在文献中雷怕霉素的代谢产物没有明显的特征，因此我们就很难发现能够区分雷怕霉素及其代谢产物的单克隆抗体。
本发明提供的单克隆抗体对雷怕霉素有高度敏感性。用一个新的致免疫的轭合物进行接种可制得本发明的抗体，该致免疫的轭合物包括与致免疫蛋白连接的新的雷怕霉素衍生物。使用这些抗体的检测试剂盒适合于临床应用，它可以提供比以前更精确、可重复的结果。该抗体还可用于雷怕霉素的纯化和分离。
提供雷怕霉素的免疫抑制衍生物的检测方法面临同样的困难。让人特别感兴趣的是雷怕霉素的40-氧-衍生物，即雷怕霉素环己基环(第40位)上羟基的氧被取代，如在US5285389和PCT/EP93/02604(氧-芳基雷怕霉素和氧-烷基雷怕霉素)中所述(在此引入作为参考)；尤其是40-氧-烷基化的雷怕霉素，其中40-氧-取代基为烷基或取代烷基，如羟烷基、羟烷氧烷基、酰氨烷基、氧烷基、这里“烷基”指支链或直链的C1-6烷基，优选C1-3烷基，其中碳链可被醚(-O-)键任意断开；最为特别的是40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素、40-氧-(3-羟丙基)-雷怕霉素、40-O-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷怕霉素，和40-O-(2-乙酰氨基乙基)-雷怕霉素。因此，本发明的另一目的是提供上述40-氧衍生物的单克隆抗体。这些抗体可用于诊断分析，还可用于纯化和生产上述雷怕霉素衍生物。
用于制备本发明新的致免疫轭合物的新的活化的雷怕霉素衍生物是通过雷怕霉素上的一个羟基基团(优选位于雷怕霉素环己基部分(第40位)上的羟基或第28位上的羟基)使雷怕霉素与一个活化的偶合基团[即该活化的偶合基团能够直接与蛋白质反应生成共价键，而不需要应用偶合剂(如碳化二亚胺试剂)]，以实现、引起或促进与蛋白质的反应。该活化的偶合基团最好有一个活化的酯或羧基基团，即，式-CO-O-X，其中X是一个羧基活化的基团，如对-或邻-硝基苯基，1-苯并三唑，五氟苯基或尤其是N-琥珀酰亚胺基。其它合适的活化偶合基团有例如i)可与雷怕霉素连接的活化的联硫基，如式-S-S-Z，其中Z是联硫基活化的基团，如2-吡啶基，或ii)环氧基，如环氧甲基。活化的偶合基团可以通过酯、醚、酰胺、硫或其它合适的键与雷怕霉素连接，但优选酯键。最优选的是带有双酯部分的活化的偶合基团，如琥珀酰，它的一端通过酯键与雷怕霉素连接，另一端有一活化的酯或活化的羧基。
本发明优选的雷怕霉素衍生物是按以下反应I得到的式III 反应I其中式I为雷怕霉素，a)在适当的条件下使式I与-酰化剂反应，并且如果需要脱去保护，得到式II的雷怕霉素，其中y是间隔基基团，优选低级亚烷基，如C2-6亚烷基，最好是亚乙基，反应a)中的酰化剂可选用例如环酐或二羧酸(任意地以半-氧-保护的形式)。b)式II的雷怕霉素与-羧基活化的基团反应，生成式III活化的雷怕霉素，其中羧基活化基团可为HO-X，这里X如前述定义。
按照反应II可得到下式III’的琥珀酰亚氨基衍生物，它是优选的雷怕霉素活化衍生物， 反应II其中式I为雷怕霉素，反应II为a)在DMAP和吡啶存在下，用琥珀酐将雷怕霉素氧-酰化，得到式II’的雷怕霉素半琥珀酸酯(40-氧-(3-羧基)丙酰基-雷怕霉素)；b)在EDC、Et3N和CH2Cl2存在下，用N-羟基琥珀酰亚胺活化式II’，得到式III’的40-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰雷怕霉素，该反应在实施例1中有详尽描述。用半抗原制备的单克隆抗体通常会在雷怕霉素和雷怕霉素的40-氧-衍生物(如前所述)间发生交叉反应，该半抗原常被连接在第40位上。如以下所述，这些单隆抗体可被选为识别雷怕霉素或雷怕霉素40-氧-衍生物的特殊部位(如在结合区或效应区)的化合物。
在某些情况下，要求单隆抗体对环己基部份的修饰有较好的敏感性，如为了区分雷怕霉素和雷怕霉素40-氧-衍生物，或为了确定环己基部份的代谢产物。这时，半抗原优选连接在28-氧位置，而不是连接在40-氧位置。例如，式A的雷怕霉素衍生物， 式A按照反应I进行反应(如果需要，脱去保护)，生成类似的28-氧活化的半抗原，如式B化合物； 式B式A中R是氧-保护基团或如上所述的取代基，如羟烷基，羟烷氧烷基，酰氨烷基或氨烷基，它们任选被保护的形式，式B中R1是氢或如前所述的氧-取代基，如羟烷基，羟烷氧烷基、酰氨烷基或氨烷基，Y是如前所述的连接基团，X是前述的羧基活化基团。制备上述半抗原时(其中R是氧-保护基团或氧-被护的取代基)，酰化剂优选以半-氧被护形式的二羧酸，这样酰化过后，两个氧-保护基团在加入羧基活化基团之前可以一步脱去。例如，能够识别40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素单克隆抗体的半抗原可以按反应III制备保护伯羟基，用半-氧被护形式的二羧酸酰化第28位上的羟基，脱去保护，活化羧基。 反应III
同样地，雷怕霉素自身也可以在第28-氧位而不是40-氧位被活化，其过程如反应IV所示保护C40羟基的氧，用半-氧-被护的二羧酸酰化28位的羟基，脱去保护，活化羧基。 反应IV
然后将活化的雷怕霉素或雷怕霉素衍生物连接于一个合适的致免疫蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，钥孔血蓝素(KLH)等)上，以便形成致免疫轭合物。单克隆抗体可用常规方法制备，例如将此新的致免疫轭合物给予某种适合的动物，以产生致免疫的激发作用，收集被这种轭合物致敏的产生抗体的细胞；将产生该抗体的活存的细胞与合适的骨髓瘤细胞融合，从如此建立并选择的存活细胞系中收集单克隆抗体。
然后本发明的抗体可用于适合的检测方法中。熟悉本专业的技术人员都清楚有几种可能的方法供选择。一种方法为竞争性测定法，需使用抗体和一个雷怕霉素示踪物如其中微量滴定板用抗体包被，在存在和不存在被认为可能含有雷怕霉素的待测液(如病人的血浆或全血)的情况下，暴露于一个竞争物，这里竞争物是一个被标记的雷怕霉素(如用荧光或放射性同位素标记，尤其是可用生物素标记)。清洗滴定板，测定结合于抗体的被标记的竞争物的量，这个量与待测液中雷怕霉素含量成反比。另一种方法是ELISA法，该法需用抗体、雷怕霉素蛋白轭合物和一个被标记的(例如酶标记的)示踪抗体，并且该抗体能识别小鼠IgG，例如其中微量滴定板可用雷怕霉素-蛋白轭合物(如前所述的含有连接于雷怕霉素或40-氧-烷基化雷怕霉素的一个蛋白质的致免疫轭合物)包被。然后在存在和不存在待测液的情况下暴露于抗体，清洗滴定板，结合于雷怕霉素轭合物的抗体通过把示踪抗体结合在已结合于雷怕霉素轭合物的抗体上来测定。同样，结合抗体的量与待测液中雷怕霉素的量成反比例。在上述两种方法中，测定均可用含有己知浓度雷怕霉素的待测液来使之标准化。本发明提供的检测试剂盒包括(i)本发明的单克隆抗体，最好以冷冻干燥的形式或包被在微量滴定板上，(ii)还可选择地包括一个雷怕霉素蛋白轭合物，(而此轭合物也可以是将其包被在滴定板上)，和/或一个被标记的雷怕霉素衍生物，(iii)任选一个进而还可选择地包括一个用于标准化的雷怕霉素溶液和使用说明。这样一个试剂盒可以测定低于10ng/ml浓度的雷怕霉素，例如低于1ng/ml，甚至低至0.25-0.5ng/ml 。
本发明的抗体还可能具有对免疫抑制的子囊菌素(如KF-506)相对结合亲合性的特征。FK-506是一个具有免疫抑制作用的大环内酯，它与雷怕霉素在结合区有一定的结构相似性。雷怕霉素族(如雷怕霉素及其免疫抑制衍生物)和FK-506都可与嗜巨噬因子(FKBP)结合，对于两者，据信与嗜巨噬因子结合对其免疫抑制活性是一个必要的但不充分的条件。但是雷怕霉素的效应区与FK-506有很大的差别，而且确实这二个化合物具有完全不同的作用机理。(例如FK-506似乎主要通过抑制IL-2转录而引起免疫抑制作用，而雷怕霉素对IL-2转录没有明显的作用。)因此，雷怕霉素的特征可能是具有一个FKBP结合区和一个效应区，这样就可以将在FKBP结合区被修饰的雷怕霉素代谢产物和在效应区被修饰的雷怕霉素代谢产物区分开来，区分方法可通过用本发明的单克隆抗体测定本发明的单克隆抗体与KF-506的相对交叉反应性(例如用竞争性ELISA法测定交叉反应性)具有高程度交叉反应性(例如大于50％)的单克隆抗体可识别与FK-506类似的雷怕霉素FKBP结合区的抗原决定基。具有低程度交叉反应性(例如小于20％，或者小于10％)的单克隆抗体可识别雷怕霉素所特有的效应区的抗原决定基。
本发明的抗体还可以根据它们区分雷怕霉素和雷怕霉素的40-氧衍生物(如前所述)的能力来筛选和鉴定。在此希望抗体不能识别雷怕霉素和雷怕霉素的40-氧衍生物，可选择在雷怕霉素和其40-氧衍生物间至少有70％(最好大于90％)交叉反应性的抗体。在这种情况下，用于制备单克隆抗体的半抗原最好是40-氧活化的雷怕霉素，例如反应I中的式III。在此希望抗体能识别雷怕霉素及其40-氧衍生物或其代谢产物，可选择具有低于30％(最好选低于10％)的交叉反应性的抗体。这样，用于制备抗体的半抗原最好是28-氧-活化的雷怕霉素或雷怕霉素衍生物，例如式B。实施例1. 40-氧-活化的雷怕霉素的制备a)雷怕霉素的40-氧-半琥珀酸酯的制备向1.5g(1.64mmol)雷怕霉素和0.577g(5.77mmol)琥珀酐的12ml吡啶的搅拌溶液中，加入195mg(1.64mmol)DMAP。生成的混合物在环境温度下搅拌19小时，减压浓缩。剩余物溶于乙酸乙酯中，并用水洗涤3次。有机溶液用无水硫酸钠干燥过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱(9∶1 CH2Cl2-MeOH)层析纯化。收集含有产品的部分，并再次用硅胶柱层析(19∶1 CH2Cl2-MeOH)纯化。减压除去溶剂，得到40-氧-(3-羧基)-丙酰基-雷怕霉素(即上述式II’所示的雷怕霉素半琥珀酸酯)，为一白色泡沫状物质。有以下特征光谱学性质1H NMR(CDCl3)δ2.68(7H，m，H33，H25和O2CCH2CH2CO2H)，3.14(3H，s和m，OCH3和H39)，3.34(3H，s，OCH3)，338(3H，s，OCH3)，4.68(1H，m，H4O)，4.72(1H，broad s，10-OH)；MS(FAB)m/z1036([M＋Na]+)，982([M-CH3O]+)，964([M- (CH3O＋H2O)]+)，946([M-(CH3O＋2H2O)]+)。
b)40-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰雷怕霉素的制备向120mg(0.118mmol)雷怕霉素半琥珀酸酯(步骤a)中的产物)，16.5μL(0.118mmol)Et3N和22.7mg(0.118mmol)EDC的8mLCH2Cl2的搅拌溶液中，加入13.6mg(0.118mmol)N-羟基琥珀酰亚胺。生成的混合物在室温下搅拌18小时，用乙酸乙酯稀释，用水洗涤2次。有机溶液用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。用硅胶柱层析(乙酸乙酯)纯化剩余物，得到40-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰-雷怕霉素(即反应II中的式III’)，为一白色泡沫状物质，有以下特征光谱学性质1H NMR(DMSO)δ2.67(2H，t，O2CCH2CH2CO2)，2.81(7H，s，CH3O和琥珀酰亚胺CH2)，2.92(2H，t，O2CCH2CH2CO2)，4.55(1H，m，H40)，5.26(1H，d，28-OH)，6.43(1H，s，1O-OH)；MS(FAB)m/z1133([M＋Na]+)，1111([M＋H]+)，1092([M-H2O]+)，1079([M-CH3O]+)，1061((M-(CH3O＋H2O)]+)，1043([M-(CH3O＋2H2O)]+).实施例2.雷怕霉素的28-氧-活化的40-氧衍生物的制备a)40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素的28-氧-半琥珀酸酯向搅拌和冷却(0℃)的958mg(1.00mmol)40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素的2.2mL10∶1二氯甲烷-吡啶溶液中加入0.160mL(1.50mmol)烯丙基氯甲酸酯。在0℃继续搅拌，将1份0.080mL(1.00mmol)吡啶和1份0.053mL(O.50mmol)烯丙基氯甲酸酯分别于反应3小时后和4小时后加入。待全部加完后继续搅拌1个多小时，用1M碳酸氢钠水溶液终止反应。反应混合物用乙酸乙酯提取3次。有机溶液依次用1N盐酸水溶液，1N碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，减压过滤、浓缩。剩余物用硅胶柱层析(50∶50己烷-乙酸乙酯)纯化，得到烯丙氧羧基-被保护的化合物(如反应III中式2所示)，为-白色泡沫状物质。
向冷却(0℃)和搅拌的208mg(0.200mmol)上述产物的2ml二氧甲烷溶液中，加入2.4mg(0.020mmol)DMAP和82mg(0.400mmol)DCC，随后加入63mg(0.400mmol)单烯丙基琥珀酸酯的0.5ml二氯甲烷溶液。反应混合物在0℃搅拌14小时，生成的悬浮液用多孔玻璃漏斗过滤，有机溶液经减压浓缩，剩余物用硅胶柱层析(30∶70己烷-乙酸乙酯)纯化，得到-白色泡沫状产物(如反应III中式3所示)。
向177mg(0.150mmol)上述产物的5ml二氯甲烷的搅拌溶液中加入17.3mg(0.015mmol)四(三苯膦)钯和0.08mL(0.3mmol)氢化三丁基锡。该黄色溶液在环境温度下搅拌2小时，用乙酸乙酯稀释，用2N冷的柠檬酸水溶液洗涤1次，用饱和食盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压，浓缩。用硅胶柱层折(85∶15乙酸乙酯-甲醇)纯化，得到半琥珀酸酯(如反应III中式4所示)，为浅黄色油状物质。
b)28-氧-琥珀酰亚胺基氧琥珀酰基-40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素将53mg(0.050mmol)上述步骤a)的产物半琥珀酸酯的2.5mL二氯甲烷溶液用2mgDMAP，24mg(0.125mmol)EDC和14mg(0.125mmol)N-羟基琥珀酰亚胺处理。在环境温度下搅拌2小时之后，用1N碳酸氢钠水溶液终止反应。用3份乙酸乙酯提取混合物。有机溶液用碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，再用无水碳酸氢钠干燥，过滤，浓缩，得到标题活化的半抗原(如反应III中式5所示化合物)，它不用再纯化就可用于制备蛋白-半抗原轭合物。它有以下特征光谱学性质1H NMR(CDCl3)δ2.43(1H，dd，H33a)，2.50-2.98(10H，m，H25，H33b，琥珀酸酯的氢，琥珀酰亚胺的氢)，3.58(2H，m，H6b，1羟乙基的氢)，3.68(3H，m，H16，2羟乙基的氢)，3.81(2H，m，H14，1羟乙基的氢)，3.93(1H，d，H27)，5.28(2H，m，H2，H30)，534(1H，d，H28)；MS(FAB)1161([M＋Li]+).实施例3. 28-氧活化的雷怕霉素的制备a)雷怕霉素的28-氧半琥珀酸酯向搅拌、冷却(0℃)的914mg(1.00mmol)雷怕霉素的2.2mL10∶1二氯甲烷-吡啶溶液中加入0.212mL(2.00mmol)烯丙基氯甲酸酯。3小时后加入0.080mL(1.000mmol)吡啶和0.053mL(0.50mmol)烯丙基氯甲酸酯。继续搅拌1个多小时，用1M碳酸氢钠水溶液中止反应。反应混合物用甲基-t-丁基醚提取3次。有机溶液依次用1N冷的盐酸水溶液，1N碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。剩余物用硅胶柱层析(70∶30(正)己烷-乙酸乙酯)纯化，得到烯丙氧基羰基保护的化合物(反应IV中式2所示)，为-白色泡沫状物质。
向冷却(0℃)和搅拌的400mg(0.400mmol)上述产物的5mL二氯甲烷溶液中加入4.8mg(0.040mmol)DMAP和164mg(0.800mmol)DCC，再加入127mg(0.800mmol)单烯丙基琥珀酸酯的1ml二氯甲烷溶液。反应混合物在-15℃搅拌14小时，生成的悬浮液用多孔玻璃漏斗过滤。有机溶液减压浓缩后，剩余物用硅胶柱层析(40∶60己烷-甲基-t-丁基醚)纯化，得到反应IV中式3化合物，为-白色泡沫状物质。
向285mg(0.250mmol)上述产物的5ml二氯甲烷的搅拌溶液中加入28.8mg(0.025mmol)四(三苯膦)钯和0.133mL(0.5mmol)氢化三丁基锡。该黄色溶液在环境温度下搅拌1小时，用甲基-t-丁基醚稀释，用2N冷的柠檬酸水溶液洗涤2次，用饱和食盐水洗涤3次，用无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩。用硅胶柱层析(90∶10至60∶40甲基-t-丁基醚-甲醇)纯化，得到28-氧雷怕霉素半琥珀酸酯(反应IV中式4所示化合物，为-浅黄色油状物质。
6)28-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰基-雷怕霉素将51mg(0.050mmol)上述步骤a产物的2ml二氯甲烷溶液用2mgDMAP，24mg(0.125mmol)EDC和14mg(0.125mmol)N-羟基琥珀酰亚胺处理。在环境温度下搅拌4小时，用1N碳酸氢钠水溶液中止反应。用3份甲基-t-丁基醚提取混合物，有机溶液依次用碳酸氢钠水溶液和食盐水洗涤，用无水碳酸氢钠干燥，过滤，浓缩，得到活化的标题化合物，它不用再纯化就可用于制备蛋白-半抗原轭合物，它有以下特征光谱学性质1H NMR(CDCl3)δ2.43(1H，dd，H33a)，2.55-3.02(11H，m，H25，H33b，H39，琥珀酸酯的氢，琥珀酰亚胺的氢)，3.56(1H，m，H6b)，3.68(1H，dd，H16)，3.83(1H，m，H14)，3.93(1H，d，H27)，5.28(2H，m，H2，H30)，534(1H，d，H28)；MS(FAB)1117([M＋Li]+).实施例4.致免疫轭合物的制备a)40-氧连接的雷怕霉素轭合物将17.4mg实施例1中40-氧-活化的雷怕霉素溶于400μlDMF或DMSO中。将此溶液120μl(即含5.22mg活化的雷怕霉素)在剧烈搅拌下滴入含有8mgKLH的2ml0.1MNaHCO3缓冲液(PH7.7)的溶液中。反应混合物在室温下搅拌2小时。将所得的雷怕霉素-KLH轭合物在4℃时对51PBS透析48小时以上，换液3次，使之纯化。轭合物用微型浓缩试管通过离心进一步随意浓缩。雷怕霉素-BSA和雷怕霉素-OVA轭合物可用同样的方法制备，只需分别用BSA或OVA代替上述方法中的KLH。
b)28-氧-连接的(任选40-氧-烷基化的)雷怕霉素轭合物将5mg实施例2中28-氧-活化的化合物溶于2mLDMSO中，并在剧烈搅拌下滴加到含有5mgKLH的1ml50mM磷酸缓冲液(pH 7.3)中。反应混合物在室温下搅拌2小时。将所得轭合物通过在4℃下对21PBS透析48小时以上，换液3次，使之纯化。与BSA的轭合物和OVA轭合物可用同样的方法制备。用实施例3中28-氧活化的化合物按同样的方法，可使雷怕霉素通过第28位置与KLH，BSA和OVA轭合。实施例5.单克隆抗体的制备a)雷怕霉素的单克隆抗体单克隆抗体可用常规技术制备，基本上按照Khler和Milstein在Nature25649中的叙述。每只雌性Balb/C小白鼠(20-25g)各给予10或50μg用0.2ml弗罗因德氏完全佐剂配制的实施例4
a)的40-氧-连接的雷怕霉素-KLH致免疫轭合物，给药途径为在4个部位作皮下注射给药。二周后作第二次强化注射，给予用0.2ml弗罗因德氏完全佐剂乳化的、含有同样剂量致免疫轭合物，再次同样作皮下注射。可用下述实施例6中所述的直接ELISA法检测动物血清中是否出现了对抗原产生反应的抗体。对小鼠随意作进一步选择，以获得对效应区的抗体(与FK-506有低交叉反应性)和对FKBP结合区的抗体(与FK-506有高交叉反应性)。例如
图1表示了二只小白鼠的抗体滴定曲线小鼠(M1)对雷怕霉素的结合区具有了高水平的抗体，另一只小鼠(M7)对效应区具有较高水平的抗体。对表现出相当特异性最大血清抗体水平的小鼠给于强化注射每次10μg抗原，在倒数第3天注射(其中一半腹膜内注射另一半静脉内注射)，在倒数第2天和第1天腹膜内再注射一次。最后一天小鼠被处死，分离其脾细胞并与PAI-O细胞或其它适合的骨髓瘤细胞系融合。培养产生的杂交瘤细胞，并用ELISA法挑选出对雷怕霉素有高亲和性抗体的细胞。
b)40-(羟乙基)-雷怕霉素的单克隆抗体雌性Balb/C小鼠给予用0.2ml弗罗因德氏完全佐剂配制的10或50μg40-(羟乙基)-雷怕霉素KLH致免疫轭合物(实施例4b))，在4个部位作皮下注射。二周后，以同样剂量的致免疫轭合物用0.2ml弗罗因德氏完全佐剂乳化后对鼠作第2次皮下注射(强化注射)。用下述的直接ELISA法检测对抗原反应的抗体是否已在动物血清中出现。另外，可对小鼠作进一步选择，以获得针对雷怕霉素分子区域的抗体，该分子已在40-氧区内通过连接一个BSA雷怕霉素轭合物而进行了修饰，并与连接一个BSA-40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素轭合物相比较。得到了二种抗体，其中一种只与40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素轭合物相结合但不与已轭合的雷怕霉素相结合，另一种抗体既与40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素相结合又与雷怕霉素轭合物结合。对出现相当特异性的最大血清抗体含量的小鼠给予强化注射，每次注射10μg抗原，在倒数第3天注射(其中一半腹膜内注射，另一半静脉内注射，在倒数第2天和第1天腹膜内再注射一次)。最后一天将小鼠处死，分离其脾细胞并与PAI-O细胞敲合。培养所得到的杂交瘤细胞并用ELISA法进行选择，得到对40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素具有高亲和力的抗体。实施例6.酶联免疫吸附测定法(ELISA)a)雷怕霉素的BLISA法于37℃，将微量滴定板用在PBS中的1-2μg/ml雷怕霉素-BSA轭合物包被2小时，然后在37℃用含2％BSA的PBS将其饱和1小时，并用0.05％Tweem-PBS洗涤3次。将被筛选的杂交瘤细胞上清液用含1％BSA的PBS溶液稀释，室温下培育过夜(或4℃18小时或37℃2小时)。用以碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG羊球蛋白来测定被结合抗体的量，以对-硝基苯基磷酸盐作为底物。37℃时培育2小时后，酶的底物被水解(在室温1小时)、在405nm处测光吸收值。挑选出产生高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞。
用含已知浓度雷怕霉素的溶液(如在血清中1-140ng/ml)来制作测定某一选择抗体与雷怕霉素相对亲合性的标准曲线。例如图2表示单克隆抗体M7-91的标准曲线，它证明被选择对雷怕霉素有较高专一性的单克隆抗体能够检测出低至0.25ng/ml水平的雷怕霉素。
通过测定抗体与FK-506的交叉反应性可以进一步明确抗体的如下特征它能与雷怕霉素的效应区或FKBP结合区相结合，即用一个类似的直接ELISA测定法用FK506-BSA轭合物包被微量滴定板，而该轭合物的制备方法与雷怕霉素-BSA轭合物制备方法类似。例如在图3中比较了17种经选择的单克隆抗体对雷怕霉素-BSA和FK-506的测定，图4表示了交叉反应性的百分率。可见在比较对雷怕霉素-BSA和FK506-BSA的结合中，可检测出有极低亲合性的单克隆抗体。
上述直接ELISA测定法可以转化为竞争性ELISA测定法只需将一个竞争物加到单克隆抗体溶液中，分别测定在加有竞争物和未加竞争物时单克隆抗体与轭合物的结合程度。在此竞争物为FK506或雷怕霉素，将竞争物的乙醇溶液如(1mg/ml)直接加入单克隆抗体溶液中(如，2μl/200μl/孔)，并在微量滴定板中将其进一步稀释。例如在图5中给出了一条抑制曲线，显示在有不同浓度游离雷怕霉素存在时，M7-91抗体(M7.91.13)对BSA-雷怕霉素的结合作用。与直接ELISA测定法相比，在这种竞争性ELISA测定中比较单克隆抗体对游离的雷怕霉素以及对游离的FK506的结合作用，可见在雷怕霉素与FK506之间仅有很低的交叉反应性。这种竞争性测定法在用于选择单克隆抗体时是较好的，因为据信在溶液中游离状态下一些单克隆抗体可能由于亲和力太低，以至于往往不能与抗原相结合，但这些抗体仍然显示对多价抗原有二价或多价结合，这种抗原含有许多半抗原，它们在一个大的蛋白质分子上彼此紧密结合。竞争性测定法可排除这种低亲合性抗体。图6显示了这种竞争性测定法的结果将具有较低交叉反应性的M7-91抗体(M7.91.13)与具有较高交叉反应性的M1-303(M1.303.3)抗体进行了比较。
6)40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素的ELISA测定法该ELISA测定法与a)中所述的程序相似。用40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素-BSA包被微量滴定板，用BSA饱和并洗涤。需筛选的杂交瘤细胞上清液在4℃培育18小时或37℃时培育2小时。用以碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG羊球蛋白来测定被结合抗体的量，以对-硝基苯基磷酸盐作底物。用结合的雷怕霉素-BSA作平行ELISA测定，用以选择能区别雷怕霉素和40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素的单克隆抗体。如图7所示，杂交瘤细胞B3-203的上清液可选择性地结合于40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素-BSA(在图中被标为BSA-28-RAD)(图7A)，杂交瘤细胞B3-113的上清液能识别40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素-BSA和由第28位置共轭结合的雷怕霉素-BSA(图7B)，杂交瘤细胞B3-164的上清液还能识别由第40位置与BSA偶合的雷怕霉素(图7C)。
抗体对40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素和对雷怕霉素的相对亲合性，还可用下述方法进一步测定即通过对已包被的40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素-BSA轭合物和对溶液中游离的40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素或雷怕霉素的竞争性的结合来测定。如图8表明，由杂交瘤细胞B3-203产生的抗体对40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素具有很强的反应，而对雷怕霉素只有弱交叉反应性(图8A)，由杂交瘤细胞B3-113和B3-164产生的抗体对40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素和雷怕霉素有同样较强的结合活性(图8B和8C)。其它杂交瘤细胞，包括B3-22，B3-127和B3-156产生的抗体，对40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素的结合作用比对雷怕霉素的结合作用至少强10-100-倍。另几株杂交瘤细胞B3-29，B3-265和B3-539产生的抗体对40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素和雷怕霉素的亲和力相同。
一旦所希望的抗体被选出，相同的ELISA测定法可用于测定病人血液中的雷怕霉素浓度。按照本实施例制得的检测试剂盒将提供下列试剂一个或多个被选用的抗体(冷冻干燥形式)一块以雷怕霉素轭合物(如雷怕霉素-BSA轭合物和40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素-BSA轭合物)包被的微量滴定板，一份雷怕霉素标准和使用说明。本试剂盒还包括一个供选用的标记的雷怕霉素衍生物以用于竞争性测定，还可以另外提供上述的抗鼠IgG-酶轭合物和底物。客户也可以将本发明的抗体用于他们自己建立的ELISA测定或其它测定系统。
权利要求
1.一种能够专门识别雷怕霉素的单克隆抗体。
2.权利要求1的能够识别雷怕霉素FKBP-结合部位上抗原决定基的单克隆抗体。
3.权利要求1的能够识别雷怕霉素效应区上抗原决定基的单克隆抗体。
4.权利要求1至3中任何一项所述的单克隆抗体，通过以下步骤得到或可以得到a)使带有活化偶合基团的雷怕霉素与致免疫蛋白反应，生成致免疫轭合物，b)将上述致免疫轭合物给合适种类的动物服用，以产生致免疫激发，收集对上述轭合物敏感的产生抗体的细胞，c)存活产生上述抗体的细胞，d)从上述建立的活存细胞系中收集单克隆抗体。
5.权利要求1至4中任何一项所述的单克隆抗体，其中雷怕霉素是(i)雷怕霉素；或(ii)40-氧-烷基化的雷怕霉素，其中40-氧烷基取代基优选自羟烷基，羟烷氧烷基，酰氨烷基或氨烷基。
6.权利要求5所述单克隆抗体，其中雷怕霉素可选自i)40-氧-(2-羟乙基)-雷怕霉素，ii)40-氧-(3-羟丙基)-雷怕霉素，iii)40-氧-[2-(2-羟基)乙氧基]乙基-雷怕霉素，和iv)40-氧-(2-乙酰氨基乙基)-雷怕霉素。
7.上述权利要求中任何一项所述能够识别雷怕霉素和权利要求5或6中所述40-氧-烷基化雷怕霉素的单克隆抗体。
8.一种包括雷怕霉素部分和蛋白质部分的致免疫轭合物。
9.权利要求8所述致免疫轭合物，它由蛋白质和带有活化偶合基团的雷怕霉素衍生物反应得到。
10.权利要求9所述致免疫轭合物，其中雷怕霉素衍生物可选自i)40-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，ii)28-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，或iii)28-氧-(琥珀酰亚胺氧琥珀酰基)-40-氧-(2-羟乙基)雷怕霉素。
11.一种具有活化偶合基团的雷怕霉素。
12.权利要求11所述雷怕霉素，它可选自i)40-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，ii)28-氧-琥珀酰亚胺氧琥珀酰基-雷怕霉素，或iii)28-氧-(琥珀酰亚胺氧琥珀酰基)-40-氧-(2-羟基)乙基-雷怕霉素。
13.一种能够产生权利要求1至7中任何一项所规定的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
14.一种用于检测血液中雷怕霉素浓度的免疫检测试剂盒，它含有权利要求1至7中任何一项规定的单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了雷怕霉素和40-氧-烷基化的雷怕霉素衍生物的单克隆抗体、新型半抗原，致免疫轭合物，以及生产它们的方法和使用它们的检测试剂盒。
文档编号C12N15/09GK1120854SQ94191718
公开日1996年4月17日 申请日期1994年3月30日 优先权日1993年4月8日
发明者R·塞兰尼, V·奎斯尼奥 申请人:山道士有限公司