包装流感病毒载体的信号的制作方法

专利名称：包装流感病毒载体的信号的制作方法
政府权益声明本发明至少有一部分是在美利坚合众国政府的资助下完成的(国立卫生院资助号为AI47446)。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术：
流感病毒A和B的基因组由八段负极性单链RNA片段组成，其中两段编码包膜糖蛋白、血凝素(HA)及唾液酸苷酶(NA)。流感病毒复制以病毒颗粒表面上的病毒HA蛋白与含唾液酸的细胞受体结合为起始。与受体结合后，宿主细胞通过胞饮作用将病毒摄入。晚期核内体中的酸性环境激发HA的构象发生变化，启动病毒包膜与核内体膜之间的融合，并使M2离子通道活化，导致质子流入病毒颗粒内。据认为将病毒颗粒内部暴露于低pH中，可以破坏M1蛋白和核糖核蛋白(RNP)复合物之间酸依赖性的相互作用，最终使RNP释放入细胞质中。然后RNP会转运到核，在这里合成病毒mRNA及病毒基因组。mRNA进入细胞质中，从而病毒蛋白得以合成。核蛋白(NP)进入核内并用壳体包装新合成的vRNA，并与三种聚合酶亚基蛋白(PA、PB1、PB2)一起形成RNP。当有M1及NS2蛋白存在时，RNP输出核外。三种浆膜相关蛋白(HA、NA及M2)与RNP相互作用并以芽殖的方式形成新的病毒颗粒。NA负责从细胞的复合糖及病毒糖蛋白中去除唾液酸，从而将病毒从感染细胞中释放出来(Lamb等，2000)。
根据HA(H1～H5)及NA(N1～N9)的抗原性A型病毒分成数种亚型。两种不同的A型病毒所感染的细胞中，可以生成具有各种基因片段组合的类型内重排体(Wright等，2000)。但是，尽管两种病毒均在人类群体共传播，仍未发现A型病毒与B型病毒之间的天然类型间重排体。
研究者已尝试在实验室内生成A型和B型病毒之间的重排体，但没有成功(Kaverin等，1983；Mikheera等，1982；Tobita等，1983)。Muster等(1991)生成了一种突变A型病毒，其中一个片段的NA片段非编码区由B型病毒非结构性(NS)基因的非编码区片段所取代。尽管此突变病毒的复制比野生型病毒慢得多，所达到的滴度也比野生型低，此类病毒的生成表明B型NS片段的非编码区与A型流感病毒组分在RNA转录及复制水平上是兼容的。相反，当RNA片段所含外源编码片段的旁侧为A型流感病毒RNA片段3′和5’端非编码区时，经过反复传代后不能在病毒颗粒内稳定维持(Luytjes等，1989)。Muster等(1991)也发现突变病毒在小鼠中减毒了，用突变病毒感染的动物可以耐受野生型病毒的攻击。
因此需要有一种方法鉴别流感病毒复制期间负责所链接序列导入及/或维持的流感病毒序列。
发明概述本发明提供了分离重组核酸分子(多核苷酸)，如载体，其中该分子含有流感病毒的导入序列(“包装信号”或vRNA衣壳化信号)及任选异源核酸片段。通常导入序列存在于各流感vRNA片段一端或两端约150至250个核苷酸处。在一个实施方案中，流感病毒导入序列包含与NA 3’末端对应的序列，包括与NA编码区N端对应的序列，例如包括3’非编码区19个核苷酸及至少与NA起始19个编码核苷酸对应的序列的A型NA vRNA 3’末端37个核苷酸；与任选NA vRNA 5’末端对应的导入序列，包括与NA编码区C-末端对应的序列，例如包括5’非编码区28个核苷酸的A型NA vRNA 5′末端67个核苷酸；以及至少39个与此NA 3′编码区39个核苷酸对应的核苷酸。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与NS vRNA 3’末端对应的序列，包括与NS编码区N-末端对应的序列。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与HA vRNA 5’末端对应的序列，包括与HA编码区C-末端对应的序列，例如包括5’非编码序列45个核苷酸及至少80个与HA 80个3’编码核苷酸对应的核苷酸的A型HA vRNA 5’末端135个核苷酸；和任选与HA vRNA 3’末端对应的导入序列，包括与HA编码区N-末端对应的序列，例如包括33个3’非编码序列核苷酸及至少3个与HA编码核苷酸起始3个对应的核苷酸的A型HA vRNA 5′末端36个核苷酸。在一个进一步的实施方案中，流感病毒导入序列包含与PB2 vRNA 5’末端对应的序列，包括与PB2编码区C-末端对应的序列。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与M vRNA 3’末端对应的序列，包括与M编码区N端对应的序列，例如包括3’非编码序列26个核苷酸及221个与M编码核苷酸对应的核苷酸的A型M vRNA 3’末端247个核苷酸；与M vRNA 5’末端对应的序列，包括与M编码区C-末端对应的导入序列，例如包括23个3’非编码序列核苷酸及219个与M编码区C-末端核苷酸最后219个对应的核苷酸的A型M vRNA 5′末端242个核苷酸。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与NS vRNA 5’末端对应的序列，包括与NS编码区N-末端对应的序列，例如包括3’非编码序列和与NS编码区N-末端对应的至少30个核苷酸的序列；与NSvRNA 5’末端对应的序列，包括与NS编码区C端对应的导入序列，例如包括5’非编码序列及与NS编码区C-末端对应的序列的至少30个核苷酸的序列。在一个实施方案中，流感病毒导入序列包含与PB1 vRNA 5’末端对应的序列，包括与PB1编码区N-末端对应的序列和与PB1 vRNA5’末端对应的序列，包括与PB1编码区C-末端对应的导入序列。在另一实施方案中，流感病毒导入序列包含与PA vRNA 5’末端对应的序列，包括与PA编码区N-末端对应的序列和与PA vRNA 5’末端对应的序列，包括与PA编码区C-末端对应的序列。本文所述流感病毒“导入序列”，是指当存在于具有相应(同源)3’及5’非编码区的vRNA中时可使含该序列的核酸分子导入病毒颗粒中并在反复传代过程中使该分子在病毒颗粒中得以维持的序列。
正如下文所述，利用基于质粒的反向遗传学已在含截短NA片段的突变病毒中鉴定到了NA导入序列。该NA导入序列位于一个包括NAvRNA 3’末端的区域中，其中该3’末端延伸入部分NA编码区中。因此，该区域可用于包装和维持野生型NA RNA以及突变NA RNA，例如内部发生缺失及/或插入的RNA，包括表达目的开放阅读框如含目的开放阅读框的异源核酸片段的重组RNA。
也如此处所述，为了深入了解A型与B型流感病毒之间的类型间不兼容性，采用反向遗传学在A型病毒背景下生成含完整B型HA片段的重排体。尽管B型HA片段确实由A型聚合酶复合物进行了转录，但是并未产生病毒。虽然含由B型HA全部编码序列及其旁侧A型HA非编码序列组成的嵌合HA片段的A型病毒可以存活，但仅能微弱复制。生成一系列基于A型、包含嵌合HA的病毒，其中嵌合HA具有A型非编码区、编码A型病毒信号肽或跨膜/胞浆区或二者均有，以及B型HA来源区域的其它部分。这些病毒在细胞培养物中均长到超过106组织培养感染剂量50/ml，但是A型HA序列越多则复制情况越好，说明蛋白质-蛋白质相互作用或更多HA片段导入病毒颗粒中对于病毒高效生长起一定作用。与野生型A型或B型病毒相比，这些A/B嵌合病毒在小鼠中均减毒了。而且，对这些用嵌合病毒在鼻内免疫的动物给予致死量的野生型B型病毒攻击时，所有动物均存活下来，示范了一种设计全新活疫苗病毒很有希望的方法。
这样，当含特定流感病毒片段导入序列、同源3’及5’非编码序列(区)和异源核酸片段的本发明分离核酸分子，以vRNA生产载体形式且在PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、诸如M1及/或M2之类的M及/或NS中一个或多个的病毒蛋白或编码病毒蛋白的载体存在下，以及在PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、诸如M1及M2之类的M及/或NS中一个或多个的用于vRNA生产的vRNA或载体存在时导入到细胞中，就产生了重组病毒。该重组病毒可用于感染细胞。与本发明核酸分子对应的vRNA优选以是相应野生型vRNA的至少10％、更优选至少30％、甚至更优选至少50％的效率导入病毒颗粒中。在一个实施方案中，该核酸分子包括与野生型vRNA对应的序列和异源核酸片段，其中该异源核酸片段导入vRNA中与该vRNA编码区对应的序列中，优选此插入基本上不破坏该导入序列。例如，该异源核酸片段导入到与NA编码区起始300个核苷酸对应的序列之后。
在另一实施方案中，3’NA导入序列与NA编码区N-末端1～183、1～90、1～45、1～21、1～19或19至183之间任意整数个核苷酸对应，在NA起始密码子处还可包括突变。在另一实施方案中，5’NA导入序列与NA编码区C-末端中的序列、相当于NA编码区C-末端3’最多39、78或157或1至157之间任意整数个核苷酸的序列对应。在另一实施方案中，5’HA导入序列与HA编码区C-末端中的序列、对应于HA编码区C-末端3’最多75、80、268、291或518或1至518之间任意整数个核苷酸的序列对应。3’HA导入序列与HA编码区N-末端的1～3、1～6、1～9、1～15、1～216、1～468或1～468间任意整数个核苷酸对应。在一实施方案中，3’PB1导入序列与PB1编码区C-末端的1～250、1～200、1～150或1～250间任意整数个核苷酸对应。在一实施方案中，3’PA导入序列与PA编码区N-末端的1～250、1～200、1～150或1～250间任意整数个核苷酸对应。在一实施方案中，5’PA导入序列与PA编码区C-末端3’绝大部分核苷酸对应，如与PA编码区C-末端3′1～250、1～200、1～150或1～250间任意整数个核苷酸对应。在另一实施方案中，3’M导入序列与M编码区N-末端的1～250、1～242、1～240或1～250间任意整数个核苷酸对应，在M起始密码子处还可包括突变。在另一实施方案中，5’M导入序列与M编码区C-末端中的序列、对应于M编码区C-末端3’最多50、100或220或1至250之间任意整数个核苷酸的序列对应。在另一实施方案中，3’NS导入序列与NS编码区N-末端的1～250、1～200、1～150、1～30、1～20或1～250间任意整数个核苷酸对应，在NS起始密码子处还可包括突变。在另一实施方案中，5’NS导入序列与NS编码区C-末端中的序列、对应于NS编码区C-末端3’最多10、30、150、200或250或1至250之间任意整数个核苷酸的序列对应。
相应地，本发明提供了包含与特定vRNA 3’及5’非编码区对应的序列、相应vRNA的导入序列以及异源核酸片段的流感病毒载体。这样，在一实施方案中，该载体包含NA vRNA 3’非编码区、3’或5’NA vRNA导入序列、和任选3’或5’NA导入序列、异源核酸片段及NA vRNA 5’非编码区。在另一实施方案中，该载体包含HA vRNA 3’非编码区、5’或3’HA vRNA导入序列、或5’和3’HA导入序列、异源核酸片段及HAvRNA 5’非编码区。在另一实施方案中，该载体包含NS vRNA 3’非编码区、NS导入序列、异源核酸片段及NS vRNA 5’非编码区。在另一实施方案中，该载体包含M vRNA 3’非编码区、5’或3’M导入序列、或5’和3’M导入序列、异源核酸片段及M vRNA 5’非编码区。在另一实施方案中，该载体包含PB2 vRNA 3’非编码区、异源核酸片段、PB2导入序列、及PB2 vRNA 5’非编码区。当在载体中使用两段导入序列时，优选用异源核酸片段将它们隔开。可使用各载体制备用于导入细胞的vRNA或在细胞中表达vRNA，细胞中也存在病毒生产所需的其它流感病毒vRNA及蛋白。
在一实施方案中，该异源核酸片段包含与标记基因开放阅读框对应的序列。在另一实施方案中，该异源核酸片段包含与治疗基因开放阅读框对应的序列。在另一实施方案中，该异源核酸片段包含与病原体或肿瘤细胞免疫原性肽或蛋白的开放阅读框对应的序列，如用于诱导保护性免疫反应的肽或蛋白。举例来说，该异源核酸片段可编码在癌症治疗或疫苗中使用的免疫原表位。因而可以制备包含该异源核酸片段的载体，以便载体vRNA的转录可生成编码与诸如NA之类流感病毒蛋白融合的蛋白的mRNA。由此可考虑将该异源核酸片段与病毒导入序列融合以编码融合蛋白，如与NA N-末端21个残基的融合体。该融合蛋白可包含来自两种不同流感病毒蛋白的序列，包括来自两种不同NA或HA蛋白的序列。在另一实施方案中，异源核酸片段可包含与连接于开放阅读框5’端的IRES对应的序列。
为通过基于质粒的反向遗传学用大量流感病毒载体制备重组病毒，载体中的流感病毒DNA相对于启动子来说可以在正义的也可以在反义的方向。这样，载体可编码A型、B型或C型流感病毒、病毒株或隔离体或重组流感病毒的流感病毒蛋白(正义)或vRNA(反义)[参见《病毒学》第45及46章相关部分(Fields等编，Lippincott-Rawen出版社，费城，PA(1996))，在此特别引入作为参考]。可用任意启动子来表达病毒蛋白，所得载体包括与特定流感病毒蛋白的DNA操纵性连接的启动子。用于编码vRNA的载体的启动子优选包括但不限于RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子及T3启动子。在一实施方案中，RNA聚合酶I启动子为人RNA聚合酶I启动子。编码vRNA的载体其转录终止序列优选包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。因此，vRNA载体包括与流感病毒蛋白cDNA以相对于启动子反义的方向操纵性连接的启动子，所述cDNA与转录终止序列操纵性连接。为生成带有本发明载体的重组病毒，可省略一些野生型vRNA载体和对一些编码野生型病毒蛋白的载体加以代替。例如，对于含HA 3’和5’非编码序列、5’HA导入序列以及与流感病毒蛋白编码序列如VSV G蛋白编码序列对应的异源核酸片段的vRNA载体来说，可以忽略HA的野生型vRNA载体。本发明的载体可以依次或同时导入一个细胞中。也提供了含多个上述所提到载体的组合物、与这些载体一个或多个相接触的宿主细胞及病毒感染的细胞。
多个本发明的载体可物理连接，或各载体位于单个质粒或其它例如线性核酸输送载体上。
用上述重组DNA分子增大的宿主细胞可用于制备具有感染性复制缺陷的流感病毒。例如，用编码HA、NA、M1、M2及NS2的重组DNA分子稳定转化的宿主细胞，可与多个载体接触，即表达包含PA的vRNA、包含NP的vRNA、包含PB1的vRNA、包含PB2的vRNA和任选包含目标基因的vRNA的载体；以及编码PA、PB1、PB2及NP的载体。
本文所述的病毒生产方法不需要辅助病毒的感染，在病毒突变性研究、疫苗(如用于AIDS、流感、B型肝炎、丙型肝炎、鼻病毒感染、丝状病毒感染、疟疾、疱疹、以及口蹄疫的疫苗)和基因治疗载体(如用于癌症、AIDS、腺苷脱氨酶、肌营养不良、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏及中枢神经系统肿瘤)的生产中很有用。
这样就提供了药物治疗(如疫苗治疗或基因治疗)中使用的重组病毒。例如，本发明提供了使个体对病原体如细菌、病毒、寄生虫或恶性肿瘤产生免疫的方法。该方法包括将有效免疫个体的一定量本发明至少一种分离病毒施用于个体，任选与佐剂联用。所述病毒包括含病原体所编码多肽或肿瘤特异性多肽的vRNA。
本发明也提供了增大或促进内源性蛋白在哺乳动物中表达的方法，其中所述哺乳动物具有以该内源性蛋白含量下降或缺乏为特征的适应症或疾病。该方法包括向哺乳动物施用可有效增大或促进内源性蛋白在哺乳动物中表达的一定量本发明重组病毒。哺乳动物优选人类。
本发明进一步提供了抑制流感病毒感染及/或复制的方法。该方法包括让细胞与可有效抑制流感病毒感染及/或复制的一定量组合物接触，其中包含于组合物中的分离核酸分子含有NA、M、HA、NS、NP、PB1、PB2、PA或其任意组合的流感病毒导入序列。细胞可以是未感染的细胞，也可以是流感病毒感染的细胞。导入序列可以对一种或多种类型NA或HA特异。在一实施方案中，细胞还进一步与M2通道抑制剂或唾液酸苷酶抑制剂接触。
本发明也提供了鉴定可选择性抑制或防止流感病毒导入病毒颗粒的试剂的方法。该方法包括让流感病毒感染的细胞与试剂接触，检测或测定该试剂是否抑制诸如NA vRNA或重组NA vRNA之类的流感病毒RNA导入病毒颗粒中。也提供了通过此方法鉴定的试剂及其用途，如抑制或防止流感病毒复制。
附图简述

图1.凝集素抗性细胞系的结合。对于每一细胞系，细胞与洋地黄毒甙标记的朝鲜槐(maakia amurensis)(MAA)或西洋接骨木(Sambucus)(SNA)凝集素一起孵育，再与异硫氰酸荧光素标记的抗洋地黄毒甙抗体一起孵育，然后用FACS分析。粗线为MAA凝集素的结合，细线为SNA凝集素的结合，阴影部分为阴性对照(不加凝集素)。
图2.AL3(MaKS)-13及K4(MaKS)-13突变体的NA基因结构。(A)AL3(MaKS)-13包含一个936-核苷酸的缺失(第220个碱基至1253个碱基)，该缺失去除了NA基因的一大部分编码区。该突变也将一个TAG终止密码子带入到缺失外两个碱基的框架中，使该基因仅编码66个氨基酸的肽，该肽与NA的胞浆尾端、跨膜区、茎及头部的一部分对应。(B)K4(MaKS)-13包含一个1066-核苷酸的缺失(第130个碱基至1193个碱基)，该缺失去除了NA基因的一大部分编码区。该突变也将一个TAG终止密码子带入到缺失外四个碱基的框架中，使该基因仅编码38个氨基酸的肽，该肽与NA基因的胞浆尾端及跨膜区对应。
图3.AM2AL3和K4亲代病毒及AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13突变体的唾液酸酶活性。对于每一样品来说，将一式两份病毒(5×102PFU)在可产生荧光的唾液酸酶底物(4-甲基伞形酮基-α-D-N-乙酰神经氨酸)存在的条件下于37℃孵育1小时。用荧光仪(LabsystemsFluoroskan II)测定4-甲基伞形花内酯的荧光强度，激发波长为360nm，发射波长为460nm。
图4A.野生型及NAFLAG载体的示意图。
图4B.NAFLAG病毒的生产方法示意图。
图4C.NAFLAGWT病毒或NA(-)病毒感染的MDCK细胞的免疫染色。细胞用抗-FLAG单克隆抗体(MAb)M2或抗-WSN多克隆抗体染色。
图5.重组7片段流感病毒和NAFLAG病毒的竞争分析示意图。
图6A.NAFLAG及NAFLAGM(-)(“-ATG”)载体的示意图。
图6B.用NAFLAGM(-)病毒感染的MDCK细胞的免疫染色。细胞用抗-FLAG单克隆抗体M2或抗-WSN多克隆抗体染色。
图7A.NAFLAG及NAFLAGM(-)感染细胞的FLAG序列原位杂交分析。
图7B.NAFLAGWT病毒或NAFLAGM(-)病毒的复制效率。
图8A.NA缺失病毒的示意图。
图8B.NA缺失病毒的包装率。
图9.含6、7或8个片段的流感病毒随时间变化的病毒滴度。
图10.显示流感病毒片段(stipled)导入信号的示意图。
图11A.流感病毒的电子显微镜断层摄影图。
图11B～F.用电子显微镜断层摄影所发现的流感病毒颗粒彩色图谱。
图12.A)A型流感病毒及HA编码序列用B型HA取代的A型流感病毒的病毒片段。B)A型流感病毒及HA编码序列用B型HA取代的A型流感病毒的病毒颗粒。
图13.A/B嵌合HA构建体图。嵌合HA构建体如Neumann等(1999)所述在基于pPolI的质粒(pHH21)中于野生型A型/WSN病毒HA(pPolI-WSN-HA)和野生型B型/LEE病毒HA(pPolI-B-HA)之间生成。
图14.A/B HA嵌合病毒的B型HA表达。用各病毒感染的MDCK细胞在感染后24小时固定，然后用抗-A/HA、抗-B/HA或抗-A/NP抗体免疫染色。
图15.A/B HA嵌合病毒的生长性。用MOI为0.01 TCID50的各病毒感染MDCK细胞，然后监测病毒的生长。图中所示为两次独立试验相似结果中的一次结果。
图16.接种A/B HA嵌合病毒的小鼠对B型病毒的抗体反应。A)鼻内接种各病毒(103TCID50)的小鼠(3只小鼠/组)。接种3天后，从各鼠取鼻/气管洗液和血清样品用ELISA方法检测抗B型病毒特异性IgA(鼻/气管洗液)或IgG(血清)抗体。B)测定血清样品中的HI滴度。每条柱代表用该嵌合病毒感染的小鼠个体。
图17.突变HA vRNA及其病毒颗粒导入效率的示意图。所有突变HA RNA均以与正义相反的方向表示。每个突变体包含旁侧有终止密码子、HA vRNA(黑色柱条)3’非编码区33个核苷酸及5’非编码区45个核苷酸的GFP开放阅读框(插入到带HA开放阅读框的框架中)。这些突变体根据来源于HA编码区的核苷酸数来命名。HA编码区用灰色柱条表示。水平虚线表示缺失。区域的长度不按比例描绘。感染后16小时固定，将表达GFP的细胞数除以VLP-感染细胞中表达NP的细胞数，以此测定突变HA vRNA导入VLPs的导入效率。
图18.用表达突变HA vRNA的质粒所感染的293T细胞中的vRNA水平。293T细胞用pPol IHA(0)GFP(0)或pPol IHA(9)GFP(80)及表达PA、PB1、PB2和NP的质粒感染。
图19.VSVG(HA)GFP(NA)病毒感染的细胞表达VSV G和GFP。MDCK细胞用VSVG(HA)GFP(NA)病毒或WSN病毒感染，并用1.0％的琼脂糖覆盖。感染的细胞于37℃孵育48小时，将噬斑在正常光线下(A、B)及带有限正常光的荧光下(C、D)拍照以鉴定噬斑。用溶于3％甲醛中的0.1％Triton-X100固定细胞并穿透。用抗-VSVG单克隆抗体(E、F)、抗-HA单克隆抗体(G、H)或抗-NP单克隆抗体(I、J)作为第一抗体和生物素化的第二抗体，使用Vectastain ABC试剂盒(Vector，Burlingame，CA)，进行免疫染色来检测病毒蛋白。
图20.VSG蛋白向VSVG(HA)GFP(NA)病毒的导入。浓缩的WNS、VSVG(HA)GFP(NA)和VSV病毒在样本缓冲液中裂解。病毒蛋白用2-巯基乙醇处理，10％SDS-PAGE分离，转到PVDF膜上，与抗-VSV G单克隆抗体或抗-WSN-HA-单克隆抗体一起孵育。左边所示为标记蛋白的分子量。
图21.VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK、CHO及MDCK细胞中的生长曲线。BHK(A)、CHO(B)及MDCK(C)细胞用MOI为0.001的病毒感染。在感染后指定时间用MDCK细胞测定上清液中的病毒滴度。所示值为两次试验值的均值。
图22.突变NS vRNA及其导入效率的示意图。
图23.突变M vRNA及其导入效率的示意图。
图24.病毒片段(A)及表达两种异源蛋白的病毒颗粒(B)的示意图。
图25.病毒片段含有HIV gp160和gag两种异源蛋白的流感病毒示意图。
图26.使用Cre/lox生产不可复制型病毒的示意图。
发明详述本文所用术语“分离的及/或纯化的”指本发明的宿主细胞或病毒在体外制备、分离及/或纯化，从而与体内物质无关联，或从体外物质基本纯化出来。本文所用“基本纯化”意为目标物质占主要部分(即按摩尔数算，它的丰度比组合物中的其它任意物质均高)，优选的基本纯化组分为目标物质至少构成所有存在大分子物质的50％(按摩尔数算)的组合物。一般地，基本纯化的组合物将包含组合物存中所有存在大分子物质的约50％、更优选约80％、甚至更优选约85％、90％、95％及99％。最优选的是，目标物质纯化到基本同质(用常规检测方法不能检测到组合物中的污染物质)。
本文所用术语“重组核酸”或“重组DNA序列或片段”指核酸如DNA等，已从原始材料进行衍生或分离，随后可在体外进行化学改变，使其序列不是天然存在的，或与天然存在的序列一致但其位置与天然基因组中的位置不同。鉴定为有用片段DNA序列或从RNA逆转录而来然后以基本纯化形式合成的DNA序列是“衍生”于原始材料的DNA实例。此类从原始材料“分离”的DNA实例之一是，将有用DNA序列用化学方法如使用限制性内切酶，从所述原始材料切下来、移走，以便利用基因工程方法进一步操作如扩增以便在本发明中使用。重组病毒从重组核酸制备。
本文使用的“异源”核酸片段、序列或分子意为片段、序列或分子所来源的原始材料与参照核酸片段、序列或分子的来源不同。例如，A型流感病毒片段或其中一部分对相应的B型流感病毒片段或其中一部分来说是异源的，一种流感病毒株或血清型的NA病毒片段对于不同株或血清型的NA病毒片段来说是异源的，非流感病毒核酸分子如HIVgap160对于流感病毒核酸分子来说是异源的。相反，同源核酸片段来源于与参照核酸片段来源相同的原始材料。因此，本发明的核酸分子是嵌合分子，它包括3’非编码区、互为同源的至少一段导入序列及5′非编码区。
短语“高效复制”在本发明的上下文中定义为在体外组织培养系统中产生很高的感染滴度，如104～1010PFU/ml、优选106～109PFU/ml。复制或疫苗生产中使用的流感病毒筛选，可使用本领域内任意已知及/或合适的测定方法进行测定。适合于筛选的测定方法(单用或任意联用)包括但不限于，使用诸如反向遗传学、重排、互补及/或感染的方法的病毒复制、灭活(如使用抗血清灭活)的定量及/或定性测定、转录、复制、翻译、病毒颗粒导入、毒性、HA或NA活性、病毒产率及/或形态学。例如，病毒复制测定可用于筛选病毒的减毒或灭活。参见Krug，R.M.等，《流感病毒》，Plenum出版社，纽约，1989。
“唾液酸”指一族含9个或更多碳原子的氨基糖，如神经氨酸的N-及O-取代衍生物。
本文使用的“位点特异性重组”应包括下列三种事件1)旁侧有位点特异性重组位点或序列如lox位点的目标DNA片段删除；2)旁侧有位点特异性重组位点或序列如lox位点的目标DNA片段的核酸序列反转；和3)不同DNA分子上位点特异性重组位点或序列如lox位点旁边的目标DNA片段发生相互交换。位点特异性重组酶系统包括但不限于，噬茵体P1的Cre/lox系统(No.5,658,772号美国专利)、酵母的FLP/FRT系统(Golic和lindquist，1989)、Mu的Gin重组酶(Maeser等，1991)、E.coli的Pin重组酶(Enomoto等，1983)及质粒pSR1的R/RS系统(Araki等，1992)。
可在本发明中使用的细胞系和流感病毒根据本发明，任何支持流感病毒高效复制的细胞均可在本发明中使用，包括作为流感病毒受体的一种或多种唾液酸表达水平减少或下降的突变细胞。此方法所得病毒可制备成重排体病毒。
优选的细胞是WHO鉴定的或可鉴定的可连续传代细胞系。认证此类细胞系的需求包括系谱学、生长特性、免疫学标记、病毒易感性、致瘤性及储存条件中至少一种特征，以及动物、卵及细胞培养。这些特征用于确认细胞不含可检测的外来物。在一些国家中，还需要细胞核学。另外，优选在与疫苗生产所用细胞同代水平的细胞中检验致瘤性。在疫苗生成的灭活或减毒前，病毒优选用已表明可给出一致结果的方法进行纯化(参见世界卫生组织，1982)。
优选完成所用细胞系的全部鉴定，以包括合适的终产品纯度检验。可用于本发明中所用细胞鉴定的数据包括(a)其起源、衍生及传代历史的信息；(b)其生长及形态学特征的信息；(c)外源性物质检验结果；(d)可在其它细胞系中清楚识别该细胞的明显特性，如生化、免疫学及细胞遗传模式；及(e)致瘤性检验结果。优选的是，所用宿主细胞的传代水平或数量扩增尽可能低。
优选在疫苗或基因治疗制剂制备前将细胞中产生的病毒高度纯化。一般地，纯化过程可以除去大量细胞DNA、其它细胞组分及外源性物质。使DNA广泛降解或变性的方法也可使用。参见Mizrahi，1990。
疫苗本发明的疫苗可包含包括任意病原体糖蛋白在内免疫原性蛋白，如来自一种或多种细菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一实施方案中，本发明的流感病毒可以是流感病毒或其它病毒性病原体的疫苗载体，这些病原体包括但不限于诸如HIV、B型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的慢病毒，诸如CMV或HSV或口蹄疫病毒之类的疱疹病毒。
完全病毒颗粒疫苗用超滤法浓缩，然后用区带离心或层析方法纯化。病毒在纯化前或纯化后进行灭活，如用甲醛或β-丙内酯灭活。
亚单位疫苗包含纯化的糖蛋白。此类疫苗可按如下所述制备用去污剂处理片段化的病毒悬液，纯化表面抗原，如利用超速离心。因而亚单位疫苗主要包含HA蛋白，也包含NA。所用去污剂可以是阳离子去污剂，如十六烷基三甲基溴化铵(Bachmeyer，1975)；阴离子去污剂，如去氧胆酸胺(Laver & Webster，1976；Webster等，1977)；或非离子去污剂，如名为TRITON X100的商用去污剂。病毒颗粒用诸如菠萝蛋白酶的蛋白酶处理后，可将血凝素分离出来，然后加以纯化，如用Grand及Skehel(1972)所述的方法纯化。
片段疫苗包含已用可溶解脂质的试剂处理过的病毒颗粒。片段疫苗可按如下所述制备如上述所获得的纯化病毒水性悬液，不管其灭活与否，在振摇下用诸如乙醚或氯仿等与去污剂相关的脂溶解剂处理。水相恢复成包含片段疫苗，主要由起始脂质外界已除去的血凝素及唾液酸酶、核心或其降解产物。如果残留的感染性颗粒还未灭活，则将其灭活。
灭活的疫苗。
本发明的灭活流感病毒疫苗可用已知方法使复制后的病毒灭活而得以制备，这些方法包括但不限于用甲醛或β-丙内酯处理。可在本发明中使用的灭活疫苗类型可包括全病毒(WV)疫苗或亚病毒颗粒(SV)(片段)疫苗。WV疫苗包含完整、灭活的病毒；而SV疫苗包含纯化病毒，该病毒用可溶解含脂病毒包膜的去污剂破坏，然后将残留病毒用化学方法灭活。
另外，可用的疫苗包括含分离HA及NA表面蛋白的疫苗，表面蛋白指表面抗原或亚单位疫苗。通常，对SV及表面抗原(即纯化的HA或NA)疫苗的反应是类似的。含有流行病毒相关NA抗原及不相关HA的试验性灭活WV疫苗似乎比常规疫苗的效率低(Ogra等，1977)。优选包含两种表面抗原的灭活疫苗。
活的减毒病毒疫苗。
按照已知方法的步骤操作，活的减毒病毒疫苗也可用于预防或治疗流感病毒感染。优选按照已知方法(参见Murphy，1993)，在一个步骤中将减毒的基因从减毒的供体病毒转移到复制的分离体或重排病毒，从而实现减毒。由于对流感病毒A的抗性由对HA及NA糖蛋白的免疫反应发展所介导，编码这些表面抗原的基因必须来源于这些重排病毒或高速生长的临床分离体。减毒的基因来源于减毒的亲代。在此方法中，负责减毒的基因优选不编码HA及NA糖蛋白。否则，这些基因不能转移到含重排体的临床病毒分离体表面抗原。
已评价了许多供体病毒再现性地减毒流感病毒的能力。作为非限制性的实施例之一，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)耐寒(ca)的供体病毒可用于减毒疫苗的生产(参见Edwards，1994；Murphy，1993)。另外，可以将ca供体病毒与本发明的有毒复制病毒配对，从而生成活的减毒重排病毒疫苗。然后在H2N2抗血清存在的条件下于25℃(限制有毒病毒的复制)对重排体的子代进行选择，所述抗血清抑制含减毒A/AA/6/60(H2N2)ca供体病毒表面抗原的病毒复制。
已在人类评价了大部分的H1N1及H3N2重排体系列，并发现它们满足(a)具感染性；(b)对血清反应阴性儿童及免疫学刺激的成人发生减毒；(c)具免疫原性；及(d)遗传稳定。Ca重排体的免疫原性与其复制水平平行。因此，通过新的野生型病毒获得ca供体病毒的6个可转移基因可以再现地使这些病毒减毒以用于易感成人及儿童的疫苗接种。
可利用定点突变将其它减毒突变导入流感病毒基因中以维持含这些突变基因的病毒。减毒突变可导入基因组的非编码区和编码区。此类减毒突变也可导入HA或NA之外的基因中，如PB2聚合酶基因(Subbarao等，1993)。这样，新供体病毒生成时也可含有定点突变所导入的减毒突变，并且这些新的病毒可用于以与上述A/AA/6/60 ca供体病毒类同的方式还原活的减毒重排体H1N1和H3N2疫苗侯选者。类似地，其它已知及合适的减毒病毒可与本发明的流感病毒一起进行重排以获得适合在哺乳动物疫苗接种中使用的减毒病毒(Ewami等，1990；Muster等，1991；Subbarao等，1993)。
优选的是这些减毒病毒维持来自于病毒的基因，所述基因编码与原始临床分离体基本类似的抗原决定簇。这是因为减毒疫苗的目标是提供与病毒原始分离体基本相同的抗原性，同时感染性减少到疫苗可导致在接种哺乳动物中诱导严重疾病状态发生微小改变的程度。
这样病毒可根据已知方法减毒或灭活，制成制剂作为疫苗施用以在动物如哺乳动物中诱导免疫反应。此类减毒或灭活疫苗是否保持了与临床分离体或其衍生高速生长株类似的抗原性，其测定方法在本领域内众所周知。这样的方法包括使用抗血清或抗体清除表达供体病毒抗原决定簇的病毒；化学选择(如金刚烷胺或rimantidine)；HA及NA的活性和抑制；以及DNA筛选(诸如探针杂交或PCR)来确认减毒病毒中不存在编码抗原决定簇(如HA或NA基因)的供体基因。参见Robertson等，1988；Kilbourne等，1969；Aymard-Henry等，1985；Robertson等，1992。
药用组合物本发明适合于接种、非肠道使用或口服的药用组合物包含减毒或灭活的流感病毒，任选还包括无菌水性或非水性溶液、悬液及乳液。组合物还可进一步包含领域内已知的辅助剂或赋形剂，参见Berkow等，1987；Goodman等，1990；Avery的药物治疗，1987；Osol，1980；Katzung，1992。本发明的组合物通常以单剂(单位剂量)的形式提供。
常规疫苗通常包含约0.1～200μg、优选约10～15μg来自各株而进入其组合物的血凝素。构成本发明疫苗组合物的主要成分的疫苗可包含A型、B型或C型或是其任意组合，如三种类型中的至少两种、不同亚型的至少两种、相同类型的至少两种、相同亚型的至少两种，或不同的分离体或重排体。A型人类流感病毒包括H1N1、H2N2及H3N2亚型。
非肠道施用制品包括无菌水性或非水性溶液、悬液及/或乳液，它们可包含领域内已知的辅助试剂或赋形剂。非水性溶媒实例包括丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油之类的植物油及诸如油酸乙酯之类的可注射有机酯类。可用载体或密闭的敷料增强皮肤的渗透性和抗原吸收。口服的液体制剂通常可包括含该液体制剂的脂质体溶液。用于悬浮脂质体的合适形式包括乳液、悬液、溶液、糖浆及含纯化水等本领域内常用惰性稀释剂的酏剂。除了惰性稀释剂外，此类组合物也可包括佐剂、润湿剂、乳化剂及悬浮剂、甜味剂、调味剂或加香剂。参见Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery’s等，1987；Osol等，1980；以及Katzung，1992。
当本发明的组合物用于个体施用时，它还可包括盐、缓冲液、佐剂或其它增强组合物效能所需的物质。例如，可使用佐剂这种能扩大特异性免疫反应的物质。正常情况下，在施用给免疫系统前将佐剂和组合物混合，或分开施用但进入接种器官的同一部位。适合在疫苗组合物中使用的材料实例见Oso1(1980)。
疫苗中的异源性可以通过使诸如2～50株或其任意范围内、任意数目的至少两种流感病毒株的复制流感病毒混合而实现。优选含现代抗原组合物的A型或B型流感病毒株。根据本发明，可提供使用本领域内已知技术使流感病毒单株发生变异的疫苗。
根照本发明，药用组合物还可进一步或另外包含一种化学治疗化合物如用于基因治疗的化合物、免疫抑制剂、抗炎剂或免疫增强剂；对于疫苗来说，化学治疗剂包括但不限于γ-球蛋白、金刚烷胺、胍类、羟基苯并咪唑、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲类、美替沙腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦酰基乙酸、阿昔洛韦、双脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦。参见Katzung(1992)，及其在第798-800和680-681页分别引用的文献。
组合物也可包含可调但小量的无内毒素甲醛及防腐剂，它们均已知是安全的，并不会在组合物所施用的生物体内产生不需要的效应。
药学目的施用组合物(或其所激发的抗血清)的目的可以是“预防性”的，也可以是“治疗性的”。当预防性使用时，本发明组合物为疫苗，在病原体感染的任何症状显现前使用。本发明组合物的预防性施用可作预防或减弱随后的感染用。当治疗性使用时，减毒或来活的病毒疫苗在检测到真正感染的症状后施用。本发明组合物的治疗性施用可用于减弱任何真正的感染。参见Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
因此，本发明的减毒或灭活疫苗组合物可以在感染发生前使用(以便预防或减弱预期的感染)，也可在真正的感染启动后使用。
类似的，对于基因治疗来说，组合物可以在病症或疾病的任意症状显现出来之前使用，也可在检测到一个或多个症状后使用。
如果组合物可以为接受患者所耐受，则该组合为称为“药理学可接受”。如果所用量具有生理学上的意义，则称“以治疗有效量”施用。如果本发明组合物的存在可以使接受患者发生可检测到的生理学变化，例如增强针对感染性流感病毒至少一株的初级或次级体液或细胞免疫反应，则可称具有生理学意义。
所提供的“保护”不一定是绝对的，也就是说如果与对照人群或一组患者相比，获得了令人满意的改善，则流感感染不一定是完全预防或根除了。保护可能仅限于缓解流感病毒感染症状的严重程度或发生速度。
药学施用本发明的组合物通过被动免疫或主动免疫提供了对一种或多种病原体的抗性，如对一株或多株流感病毒株的抗性。主动免疫时，灭活或减毒活疫苗组合物预防性的施用于宿主(如哺乳动物)，而宿主对所施用疫苗的免疫反应保护宿主免受感染及/或发病。对于被动免疫来说，所激发的抗血清可以复原并施用于可能带有由至少一种流感病毒株导致的感染的接受者。
在第二个实施方案中，疫苗施用于哺乳动物的雌性(妊娠或分娩之时或之前施用)，施用时间和剂量足以产生可同时保护雌性及其胎儿或婴儿(通过抗体被动穿过胎盘或进入母亲的奶中起作用)的免疫反应。
因此，本发明包括预防或改善病症或疾病，例如由至少一株病原体所致的感染的方法。正如本文所述，如果疫苗的施用可获得疾病病情或症状的完全或部分改善(即抑制)，或个体对该病的完全或部分免疫力，则说该疫苗可预防或缓解该疾病。
本发明的灭活或减毒流感病毒或其组合物至少有一种可利用前述药用组合物通过可达到所需目的任意方法施用。
例如，可以通过各种非肠道途径来施用这样的组合物，如皮下、静脉内、腹腹腔、肌内、腹膜内、鼻内、口腔或透皮途径。非肠道施用可以是以一起注射或随时间逐步推注。使用本发明药用组合物的优选模式之一是在肌内或皮下应用。参见Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
预防、抑制或治疗流感病毒相关病状的典型方案包括施用有效量的本文前述疫苗组合物，可单次施用治疗，或在包括1周到约24个月或其中任意范围或数值的一段时期内以增强或追加剂量重复施用。
按据本发明，“有效量”疫苗组合物是能获得所需生物学效应的量。可以理解的是有效剂量依赖于年龄、性别、接受者的健康状况和体重，如果有合并治疗则也依赖于合并治疗的种类及治疗的频率，还依赖于所需效应的本性。下面提供的有效剂量范围不是想限制本发明，而是代表了优选的剂量范围。但是，最优选的剂量依个体受试者而定，并为本领域内的熟练技术人员所清楚和可由其决定。参见Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；以及Katzung，1992。
哺乳类(如人)或禽类成年生物体的减毒病毒疫苗用量可以是约103～107噬斑形成单位(PFU)/kg，或是其中任意范围或数值的量。灭活疫苗的剂量可以是约0.1～200μg血凝素蛋白，如50μg。但是用已有疫苗作为起点，常规方法测定所用量应当是安全和有效的量。
具免疫反应性的HA在复制病毒疫苗各剂量中的用量可以标准化为含有适当的含量，如1～50μg或其中任意范围或数值，或是美国公共卫生部所推荐的用量，通常是不小于3岁的儿童每组分15μg，小于3岁的儿童每组分7.5μg。NA的量也可标准化，但是该糖蛋白在纯化过程及储存时不稳定(Kendal等，1980；kerr等，1975)。优选每0.5-ml量的疫苗包含约1-50亿个病毒颗粒，更优选10亿个颗粒。
本发明将在下面的非限限制性实施例作进一步的说明。
实施例1材料与方法病毒和细胞。从单个患者分离、位于含胚鸡蛋(A/Tottori/AT1/AM2AL3/94；AM1AL3)或madin-darby犬肾内的人H3N2病毒，从T.ito(Tottori大学，Tottori，日本)获得。病毒原种在10天龄含胚鸡蛋(AMZAL3病毒)中培养，或在补充有0.3％牛血清白蛋白及0.5mg胰蛋白酶/ml的最小基本培养基(MEM)中的MDCK细胞(K4病毒)上培养。MDCK细胞在补充有5％新生牛血清(Sigma，St.Louis，MO)的MEM中培养。
凝集素抗性细胞系的产生。长至75％融合的MDCK细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，与朝鲜槐(MMA)凝集素(100mg/ml，BoehringerMannheim)或西洋接骨木(SNA)凝集素(100mg/ml，BoehringerMannheim)一起在含0.3％牛血清白蛋白的MEM中孵育。孵育48小时后，培养基用生长培养基(MEM-5％胎牛血清)取代。凝集素选择如上所述另外重复两次。存活下来的细胞集落加以克隆，SNA及MAA选择的细胞系分别指定为MDCK-Sn10和MDCK-Ma。
用荧光计HPLC方法测定唾液酸含量。按Suzuki等(1997)所述，用高效液相色谱以荧光计测定两种细胞系和纯化病毒中的唾液酸(N-乙酰神经氨酸[NeuAc]和N-糖基神经氨酸[NeuGc])含量。各样品置于5-ml顶部磨砂玻璃瓶中，与100μl(25mM)硫酸混合。然后将瓶于60℃加热12小时水解唾液-糖链。冷却后，50μl水解物中加入50μl 1，2-二氨-4，5-亚甲二氧基苯，混合物避光于60℃加热2.5小时以使唾液酸的荧光显影。所得溶液取10μl等分液注入装有样品注射阀(模型7125，Reodyne)和荧光分光光度计(650-105，Hirachi，东京，日本)的880-PU高效液相色谱(JASCO，东京，日本)，该荧光分光光度计带有20-μl流动池和记录仪(Chromatopac C-RSA，Shionadzu，东京，日本)。荧光分光光度计设置成激发波长为373nm、发射波长为448nm。NeuAc(Sigma)和NeuGc(Sigma)的标准混合物(200pmol/μl)用于建立校正曲线。
使用荧光计的唾液酸酶活性测定。病毒唾液酸酶活性(5×105PFU)按Hara等(1987)所述，以2’-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸(Sigma)为底物进行测定。简单地说，荧光底物用0.5M醋酸钠(pH4.6)以1∶2稀释后，加到等量样品中，于37℃孵育30分钟。用200ml 0.5M的Na2CO2(pH10.7)终止反应，于激发波长360nm和发射波长460nm孵化荧光。所有反应一式两份实施。
NA及HA基因的序列分析。使用Qiappin vRNA纯化试剂盒，按厂商(Qiagen，Inc.，Valencia，Calif.)说明从病毒样品获得总病毒RNA(vRNA)。生产cDNA时，使用与A型病毒基因片段3’端12个保守vRNA核苷酸互补的寡核苷酸Uni-12作为莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(Promega，Madison，WI)反应的引物。NA基因cDNA用NA基因特异性引物 JN2-43 (5′cRNA 正义序列5’-TGGCTCGTTTCTCTCACTATTGCC-3’；SEQ ID NO1)、JN2-1410r(3′cRNA反义序列5’-TTATATAGGCATGAGATTGATGTTCCG-3’；SEQ ID NO2)和10U Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)进行30轮循环扩增。所得PCR产物亚克隆入载体pCR21(Inbitrogen，Carlsbad，Calif.)，在自动化荧光测序中使用。HA基因用HA基因特异性引物JH3-Up(5′cRNA正义引物序列AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTATTAACCATGAAGAC-3’；SEQ ID NO3)和JH3-Down(3′cRNA反义引物序列5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATTAATGCACTC-3’；SEQ ID NO4)以与NA基因类似的方式进行克隆。对于每一个分离体，检验三个克隆以获得NA和HA的共有序列。
结果凝集素抗性细胞系的产生。为了产生细胞表面唾液酸表达水平下降的细胞系，使用了唾液酸结合特异性不同的凝集素SNA和MAA。与MAA结合的唾液酸通过α(2，3)键与半乳糖(Wang等，1988)，而与SNA结合的唾液酸通过α(2-6)键与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺连接(Shibuya等，1987)。使用支持流感病毒生长的MDCK细胞作为凝集素选择的亲代细胞。当在其中任意一种凝集素存在的条件下导入时，大部分细胞在一周内死亡。然后让抗性细胞克隆长出来作为原种培养物。MAA及SNA凝集素选择所得到的细胞系分别指定为MDCK-Ma和MDCK-Sn10。
用洋地黄毒甙标记的MAA和SNA凝集素进行的荧光激活细胞分选(图1A)证明正如以前所报道的那样(Ito等，1997)，MDCK细胞与两种凝集素的结合水平都很高。用α(2，6)键特异性凝集素选择的MDCK-Sn10细胞，仍保持与α(2，3)特异性MAA凝集素的强烈结合，但对SNA凝集素的结合与亲代MDCK亲代相比变弱了。相比之下，用α(2，3)键特异性凝集素选择的MDCK-Ma细胞，对两种凝集素的结合均比MDCK细胞弱得多。
病毒在MDCK-Sn10和MDCK-Ma细胞系中的生长。为了获悉流感病毒如何适应受体表达减少的细胞，使用两种唾液酸受体键特异性已知的流感病毒变体(AM2AL3及K4)(Ito等，1997)。K4病毒特异性地识别通过α(2，6)键与半乳糖连接的NeuAc[NeuAcα(2，6)Gal]，而AM2AL3病毒特异性识别NeuAcα(2，3)Gal。两种病毒在MDCK-Sn10细胞中的复制与在MDCK细胞中的复制一样好(表1)。但是，两种细胞在MDCK-Ma细胞中的滴度均比MDCK细胞中的滴度低1个log。同样，其中任意一种病毒感染后，即使感染复数达到10也仅有一小部分MDCK-Ma细胞继续长至融合且不发生细胞病变效应。当培养基用含可促进病毒生长的胰蛋白酶的培养基替换时，血细胞凝集测定不能检测到这些存活细胞中的病毒生成。这些细胞的HA和NP蛋白免疫化学染色也呈阴性(数据未列出)，因而证明细胞未持续感染。存活的细胞指定为MaKS。
表1.流感病毒在凝集素抗性细胞系中的复制*
*用AM2AL3或K4和病毒一起感染细胞，并测定感染50％组织培养细胞所需要的剂量(TCID50)，以此测定各细胞系的敏感性。
SNA和MAA凝集素的FACS分析证明，MaKS细胞象其衍生来源的MDCK-Ma细胞一样，与α(2，6)特异性SNA的结合比MDCK细胞弱得多(图1B)。另外，MaKS细胞的MAA凝集素结合峰比MDCK-Ma细胞系的结合峰窄得多，并且缺失了代表更高MAA结合群的小肩峰(图1)。
为了测定唾液酸含量减少是MaKS细胞凝集素结合减少的原因，用液相色谱分析对MaKS细胞中存在的唾液酸进行定量。尽管NeuGc的水平低得多，MaKS细胞的NeuAC和NeuGc水平(分别为8.2和0.4pmol/μg蛋白)比MDCK细胞中的水平(分别为216.0和2.5pmol/μg蛋白)低得多。这些数据说明MaKS细胞中唾液酸受体决定簇大量减少。
病毒在MaKS细胞中的适应。为测定AM2AL3及K4病毒如何在病毒表达水平非常低的细胞中繁殖并适应生长，两种病毒先后在液体培养中的MaKS细胞内传代。由于两种病毒在MaKs细胞中的复制均比在MDCK细胞中的复制弱得多(表2)，第1至3代不稀释，第4至13代按1∶1,000稀释。第8代后，任意一种变体所产生的噬斑直径由大(超过3mm)变小(约1mm)。到了10代或更高的代数，用MDCK细胞测定的病毒只呈现更小的噬斑(数据未列出)。经过连续的13代后，两种病毒均能在MaKS细胞中生长得与在MDCK细胞中一样或长得更好(表2)。13代后由任一变种产生的病毒原种进行扩增，并分别指定为AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13。
表2.适应于在凝集素选择细胞中生长的病毒的复制*
*用AM2AL3(在卵中生长)、K4(在MDCK细胞中生长)、AL3(MaKS)-13或K4(MaKS)-13原种病毒感染的细胞，测定感染50％组织培养细胞所需要的剂量(TCID50)，以此测定各细胞系的敏感性。注意适应于MaKS细胞中生长的两种病毒在这些细胞中生长情况与MDCK细胞中一样良好(AL3(MaKS)-13)或更好(K4(MaKS)-13)，而起始病毒在MDCK中生长得更好一些。
AL3(MaKS)-13如K4(MaKS)-13病毒HA及NA基因的突变分析。为测定病毒适应以受体浓度降低为特征的细胞环境，将AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒的HA基因逆转录，用PCR扩增cDNA，对所得产物测序。与两亲代病毒的相应HA基因相比，两种病毒的基因均不含突变。
由于NA唾液酸酶活性很可能影响HA受体结合活性，因而测定了AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒的NA序列。两种变体的NA基因序列分析均表明内部有一大片缺失(图2)。AL3(MaKS)-13内，缺失从第220个核苷酸延伸到第1253个核苷酸，使一个阅读框发生移支，从而在紧接该缺失后产生了一个终止密码子。此NA的编码容量为66个氨基酸，与NA的胞浆尾端、跨膜区、茎及头部的一部分对应。类似地，K4(MaKS)-13分离体在NA基因中从第130个碱基到1193个碱基发生，在第39个密码子处引入了一个终止密码子。和AL3(MaKS)-13一样，该基因不再编码完整的催化头部区。因而，在受体表达水平下降的细胞中传代的病毒已丧失其NA催化活性。
为了确认此结果，用荧光唾液酸酶底物[2’-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸]分析了AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13变体的唾液酸酶活性。与亲代病毒不同，两个NA缺失突变体均未检测到唾液酸酶活性(图3)。
病毒糖蛋白的唾液酸化程度。正常感染时，唾液酸酶活性下降的病毒不能在细胞表达有效生长和聚集(Palese等，1974；Shibata等，1993)。那么，为什么缺乏唾液酸酶活性的AL3(MaKS)-13和K4(MaKS)-13病毒可以在MaKS细胞中生长呢？一种可能的解释是由于这些细胞的唾液酸含量低，HA及NA寡糖的唾液酸化程度也低，阻止了病毒在感染细胞表面上的聚集，即使无病毒唾液酸酶活性时也如此。为了检验此假设，对在MDCK细胞中生长的AM2AL3及K4病毒和MaKS细胞中生长的AL3(MaKS)-13病毒作了纯化病毒制品的唾液酸含量比较。虽然AM2AL3病毒的唾液酸含量(0.9pmol NeuAc/g蛋白)比其它两种的含量(A/Tottori/872/K4/94，3.8pmol NeuAc/g蛋白；AL3(MaKS)-13，2.6pmol NeuAc/g蛋白)要低，三种病毒样品中的NeuAc含量类似。
因此，缺乏唾液酸酶活性的病毒可在唾液酸水平下降的细胞中高效生长，因为与正常细胞系相比，病毒蛋白并没有广泛地唾液酸化及与HA结合，而这些会阻止病毒的聚集。
讨论以前的研究里，A型流感病毒在有外源细茵唾液酸酶活性及病毒NA抗体存在的条件下传代导致病毒NA基因缺失(Liu等，1993；Liu等，1995；Yang等，1997)。而且，作为该分子对唾液酸残基亲和力下降的HA蛋白的补偿性突变结果，如此传代所得NA突变体可在缺乏外源唾液酸酶活性的细胞培养物、及卵和小鼠中生长(Hughes等，2000)。正如本文所述，A型流感病毒可适应于在因NA基因大量缺失受体表达极度下降的细胞中生长，其中NA基因大量缺失使其唾液酸酶活性丧失。尽管病毒受体的减少理论上会影响结合受体的HA蛋白，只有NA基因发生了改变。
该结果的分子基础是什么呢？在正常的细胞环境中，唾液酸受体丰度很高，NA活性的缺失可以通过减少唾液酸对病毒HA的亲和力来补偿，可以使子代有效地从宿主细胞释放出来，防止病毒颗粒聚集(Hughes等，2000)。当病毒受体不够高时，如我们的MaKS细胞，HA亲和力下降并不为病毒子代释放及NA缺失突变体生长所必需。实际上，对于在病毒受表达水平下降细胞中的病毒复制来说，必须维持HA蛋白的高亲和力结合。但是唾液酸酶活性对于在此类环境中病毒颗粒的释放和防止病毒颗粒聚集来说不是必需的，因为细胞表面分子的唾液酸含量非常低，NA缺失的病毒颗粒其唾液酸含量与野生型病毒颗粒类似。实际上，对于病毒生长来说唾液酸酶活性很可能是有害的，因为它进一步从细胞表面去除了受体决定簇唾液酸。最近，发现缺失NA茎从而不能在卵中生长的A型流感病毒通过非同源RNA-RNA重组获得了多至22个氨基酸的茎插入(Mitnau等，2000)。概括起来，这些结果表明流感病毒可通过进行包括大量插入及缺失在内的根本遗传学改变来适应于新的宿主环境。
本研究及以前的研究(Hughes等，2000；Liu等，1993)均发现病毒通过NA基因片段中的缺失而丧失其唾液酸酶活性，其中剩下的片段编码胞浆尾和跨膜区。因此，这些突变体中的NA基因保守区域可能对于诸如病毒形态形成和稳定来说是必须的。
MaKS细胞的唾液酸含量比其亲代(MDCK)细胞低。尽管也从CHO细胞生成了类似的细胞系(Ray等，1991)，但不能证明可在流感病毒研究中使用，因为它们不能有效的支持流感病毒。相反，MaKS细胞来源于流感病毒研究中的标准细胞系MDCK细胞，应该可以在基于病毒受体的分析中使用。例如，由于外源性添加的神经节苷酯可以合到宿主细胞膜中(Cafroll等，1985)，因而可以将一种已知的神经节苷酯与MaKS一起孵育，并检验其作为病毒受体的能力。
在上个世纪，当新兴病毒的HA或HA及NA基因两者引入人类时，三种A型流感病毒流行开来。不同宿主动物来源的病毒对照研究表明，这些流行的病毒株中NA基因引入了突变(Bean等，1992)。病毒突破宿主种属障碍是否需要NA中发生类似的突变尚不清楚，但是来源于一种禽类病毒的人类病毒N2 NA其底物特异性在人类的复制过程中逐渐发生改变(Baum等，1991)。上述结果说明NA突变确实能有助于A型流感病毒适应于新的环境。例如，人类病毒NA和鸭病毒其余基因的重排体病毒不能在鸭子中复制(Hinshaw等，1983)，即使人类病毒的NA来源于禽类病毒也是如此(Scholtissek等，1978)。说明NA基因在适应人类的过程中很可能发生了突变。不同动物来源的病毒NA对照研究，和最近发展出来的基于质粒的反向遗传学(Fodor等，1999；Neumann等，1999)一起，可能且助于深入理解这些表面糖蛋白有助于流感病毒适应自然中的变化。
实施例2材料与方法细胞。293T人胚肾细胞于补充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s培养基中培养，Madindarby犬肾(MDCK)细胞于补充有5％新生牛血清的Eagle’s培养基中培养。
基于质粒的反向遗传学。按Neumann等(1999)所述，用含受RNA聚合酶I启动子和终止子控制的A/WSN/33(H1N1)病毒基因cNDA的质粒(称为Pol1质粒)和表达流感病毒蛋白的pCAGGS/MCS质粒生成A型流感病毒(图4)。简单地说，Pol1质粒及蛋白表达质粒和感染试剂Trans ITLT-1(Panvera，Madison，WI)混合后，于室温孵育10分钟，加到Opti-MEM(GIBCO/BRL)培养的1×106个293T细胞中。转染48小时后，培养基中加入0.5μg/ml胰蛋白酶的以激活HA蛋白，于37℃孵育1小时。收集上清。
质粒。NAFLAG基因含NA cRNA的5’非编码区；与胞浆尾(6个氨基酸)、跨膜区(29个氨基酸)和茎区(16个氨基酸)对应的51个NA密码子(图4A)；FLAG表位(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；SEQ ID5)；两个相连的终止密码子(TAA TAG；SEQ ID NO6)；以及NA cRNA 3’端序列的185个碱基。该长度的3’端序列是截短NA片段中发现的最短片段(Yang等，1997)。用PCR将pT7Blue-NA中WSN基因的第173至1070(正义链中)个核苷酸缺失、并插入FLAG序列、两个终止密码子和一个StuI位点，生成可产生反义NAFLAG RNA的pPol1-NAFLAGWT。用StuI消化此片段，使之自我连接。用BsmBI将NAFLAG切下来，插到pHH21的BsmBI位点内。
用于NAFLAGM(-)生产的pPOl1-NAFLAGM(-)缺乏NA蛋白的起始密码子。用体外定点突变系统(GeneEditor，Promega)将截短NAFLAG蛋白的ATG起始密码子变成GCG，来实现此目标。
通过反向PCR将pT7Blue-NA中WSN基因的第203至1109(正义链中)个核苷酸用BglII位点取代，生成pPOl1-(183)GFP(157)，它生成的RNA含NA vRNA 3’末端非编码区及编码带61个NA N-端密码子的融合蛋白的互补序列，以及NA vRNA 5’末端的185个碱基，其中融合蛋白为增强荧光蛋白(eGFP，Clontech)。eGFP基因克隆入此BglII位点和位于NA蛋白框中1226位处(野生型NA基因中)的StuI位点。然后将NA-(183)GFP(157)基因插入pHH21的BsmBI位点。
用含BbsI位点的寡核苷酸引物通过PCR生成NA(0)GFP(0)基因，它含NA vRNA 3’末端非编码区、eGFP的互补编码序列及NA vRNA 5’非编码区。此PCR片段用BbsI消化并插入这HH21的BsmBI位点中以便将质粒引入细胞时，可以合成负链方向中含旁侧有5’及3’NA vRNA区非编码区的eGFP编码序列的RNA。
通过PCR突变生成一系列缺失突变体。NA-eGFP融合蛋白的缺失突变体从pT7Blue载体中的NA-(183)GFP(157)基因制备。通过PCR突变生成NA-(183)GFP(0)基因，它缺失了NA-(183)GFP(157)的NA编码区的整个3’端(正义)。该突变体含5’非编码区(正义)、NA序列的61个氨基酸、eGFP基因、两个终止密码子及3’非编码区。NA-(90)GFP(0)、NA-(45)GFP(0)、NA-(21)GFP(0)和NA-(18)GFP(0)等PCR突变体分别包含NA-(180)GFP(0)NA编码区的30、15、7或6个N-末端氨基酸缺失。
用与NA(61)GFP基因相同的方式制备NA0G185基因，它含NA基因(正义)的5’非编码区、eGFP基因、两个终止密码子及3’非编码区的185个核苷酸。此突变体具有NA vRNA的5’非编码区(28个苷酸)和NA vRNA 5’编码区的157个核苷酸。NA-(183)GFP(78)和NA-(183)GFP(39)突变体是NA0G185的缺失突变体，分别象NA0G185那样具有NA 5’编码区的一半或四分之一。
免疫染色。为了检测粘附到截短NA蛋白上的FLAG表位，用含该表位的病毒感染MDCK细胞，并用含0.5μg胰蛋白酶/ml及100μU/ml霍乱弧茵唾液酸酶(GIBCO/BRL)的0.6％琼脂糖覆盖。感染的细胞用3％甲醛溶液固定。然后以抗-FLAG单克隆抗体M2(Sigma)为第一抗体并以生物素化的抗小鼠IgG为第二抗体，用Vectastain ABC试剂盒(Vector，Burlingame，CA)检测FLAG表位。为了鉴定WSN病毒感染的细胞，用兔抗WSN血清作为第一抗体。
原位杂交。用洋地黄毒甙(DIG)标记的探针与感染细胞杂交，并根据制造商的说明用DIG核酸检测试剂盒(Roche)染色。与编码FLAG表位核苷酸序列互补的寡核苷酸(100pmol)(GAC TAC AAG GAC GAC GATGAC AAG；SEQ ID NO7)用DIG寡核苷酸加尾试剂盒(Roche)于37℃标记6小时。病毒感染的细胞用3％甲醛溶液固定，用溶于3％甲醛中的0.1％Triton-X100穿透，在预杂交缓冲液(5X SSC，检测试剂盒中的1％封闭试剂，1％N-十二烷基肌氨酸，含0.1mg/ml检测试剂盒的多聚(A)-DNA的0.02％十二烷基硫酸钠[SDS])中于65℃预杂交30分钟。预杂交缓冲液中加入寡核苷酸探针(10pmol)，于55℃杂交1小时。杂交的细胞用洗涤液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，0.3％吐温20，pH7.5)洗涤5分钟，用1％封闭试剂于室温封闭30分钟，与偶联有碱性磷酸酶的抗-DIG抗体(1∶5000)于室温孵育30分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞，与检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)的氯化氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)中于室温避光孵育3小时。
竞争传代。NAFLAGWT或NAFLAGM(-)病毒(300噬斑形成单位[PFU])与3×104PFU NA(-)病毒混合，用于感染亚融合的MDCK细胞(感染复数为0.01)，并在含0.5μg胰蛋白酶/ml及100μU/ml霍乱弧茵唾液酸酶的培养基中孵育72小时。用收获的病毒感染MDCK细胞。此过程重复5次。
结果。
缺乏NA基因片段的A型流感病毒可以存活。反复传代后截短NA基因得以保留下来说明其对于病毒复制的重要性。为了生成没有NA RNA片段的突变A型流感病毒，用生产除NA vRNA外vRNA和表达九种结构蛋白的质粒转染293T细胞。当293T细胞培养上清与MDCK细胞在霍乱病毒唾液酸酶存在的条件下一起孵育时，观测到了噬斑(直径为189±15.6μm)。在液体培养物中，该病毒(指定为NA(-))长到了105PFU/ml。因而，只有7个vRNA片段的A型流感病毒可以存活。
截短NA片段对于病毒高效生长是必需的。为了理解反复传代后NA基因稳定维持的分子基础，将含截短NA基因的病毒生长情况与缺乏NA基因起始密码子、编码NA(-病毒)的病毒生长情况作对比。用反向遗传学生成NAFLAGWT突变病毒。NAFLAGWT所含的NA基因内部有缺失及与截短NA融合的FLAG表位序列。NAFLAGWT生长至105PFU/ml，并在细菌唾液酸酶存在的条件下生成了噬斑。噬斑用抗-FLAG单克隆抗体或抗-WSN多克隆抗体进行免疫染色(图4C)。NA(-)或NAFLAGWT病毒生成的噬斑用抗-WSN抗体染色，仅对后者产生的噬斑用抗-FLAG抗体染色。
为了测定复制能力的差别，NA(-)和NAFLAGWT病毒以100∶1的比例混合，将此混合物与MDCK细胞一起孵育(图5)。感染48小时后，取上清用于生成噬斑，噬斑用抗-FLAG单克隆抗体免疫染色。计算总噬斑中FLAG-阳性噬斑的百分比，以此测定含截短NA片段的病毒的发生率。该过程重复4次以上。如图7B所示，群体中FLAG阳性噬斑在传代的过程中逐渐增加，到第5代时几乎达到90％。此结果说明，含8个片段的病毒(即使该截短的NA基因不编码功能性唾液酸酶)比含7个片段的病毒生长得更好。
病毒RNA对于病毒高效生长来说是重要的。为了测定截短的NA蛋白或病毒RNA对于病毒高效复制是否重要，构建了缺乏NA起始密码子及框中另一ATG密码(第15个密码子)的NAFLAGM(-)基因(图6A)。用抗-FLAG抗体未能检测到NAFLAGM(-)病毒生成的噬斑(图6B)，表明蛋白未翻译出来。为了确保NAFLAGM(-)病毒具有NAFLAGM(-)基因，对该病毒生成的噬斑用FLAG特异性探针进行原位杂交。这些噬斑与探针发生反应，确认此病毒中NAFLAGM(-)基因的存在。然后将此病毒的复制能力与上述7片段病毒相比。用FLAG序列特异性探针标记的噬斑百分率逐步上升(图7B)，到第5代时接近80％的噬斑变成FLAG序列阳性(图7A)。如缺乏抗-FLAG抗体免疫染色的噬斑所证明，传代过程中未发现表达截短NA蛋白的回复突变体。因此，尽管由于混合感染物中NAFLAGM(-)变得占统治地位时病毒复制速率低于NAFLGWT的复制速率，因而NA蛋白可能在高效病毒有效复制中起一定作用，但是病毒RNA本身可能在高效病毒复制中起重要作用。
病毒NA vRNA包装信号延伸入编码区。CK2-29及E17E病毒即使在广泛的传代后，截短NA基因仍得以保留下来，表明NA RNA片段的编码区中有vRNA导入到病毒中的信号(即包装信号)存在。为了检验此假设，将编码eGFP的序列插入截短NA基因阅读框内NA序列缺失的位置。将此重组基因指定为NA-(183)GFP(157)，它具有NA vRNA的3’非编码区和NA编码区的N-末端61个密码子、eGFP编码区及NA vRNA5’末端的185个核苷酸。制备用NA-(183)GFP(157)基因取代相应野生型NA基因的病毒，进行噬斑测定(图8A)。超过90％的噬斑表达eGFP，表明NA-(183)GFP(157)基因导入了病毒颗粒并在病毒的复制过程中得以保留下来(图8B)。考虑到旁侧有NS非编码区序列CAT基因未能保持留到超过5代以上(Luytjes等，1989)，该结果是引人注目的。
既然NA-(183)GFP(157)和CAT构建体之间的差异表现在病毒编码序列，构建了与CAT构建体类似的基因NA(0)GFP(0)，它包含旁侧有3’及5’NA非编码区的eGFP编码序列。此构建体缺失NA编码区。尽管用此基因生成的病毒可以生成噬斑，只有一小部分(0.1％)噬斑有一两个表达eGFP的细胞，表明NA(0)GFP(0)基因未能在病毒复制过程中得以保留下来。用质粒感染的293T细胞，包括一个表达生产病毒所用NA(0)GFP(0)基因的质粒所感染的293T细胞，其eGFP的表达程度低于表达NA(61)GFP的质粒所感染病毒的表达水平。用于NA(0)GFP(0)的PolI质粒量增加了10倍，结果使表达eGFP的293T细胞数与用NA(0)GFP(0)的polI质粒所转染的细胞数类似。即使用于NA(61)GFP的PolI质粒用量高出10倍，NA(0)GFP(0)病毒生成的噬斑仅有1％包含eGFP阳性细胞，而且这些噬斑中的细胞只有少量表达eGFP。这些结果表明，病毒NA RNA的包装信号延伸到了NA编码区内。
RNA片段在高效病毒生产中的作用。为了理解为什么8片段RNA病毒比7片段RNA病毒长得好，对具有6、7或8个病毒RNA片段的病毒作了感染性病毒颗粒生产的比较(图9)。为了生成8片段病毒，用正常病毒生产的所有9个片段结构蛋白的蛋白表达质粒和8种PolI质粒转染293T细胞。同时也使用具有两突变使NS2不能生成的NS PolI质粒，这样从293T细胞生成的病毒不会进行多次复制循环。另外，分别使用具有使HA及NA蛋白不能生成的突变的HA和NA PolI质粒，以便基因片段的消除仅限于RNA片段，而不是基因产物。对于7片段病毒的生产，不包括NA基因的PolI基因，但包括一个表达NA蛋白的质粒。为制备6片段病毒，不用HA及NA RNA的质粒，但包括HA及NA蛋白表达质粒。
为了比较三种病毒的病毒颗粒产量，用这些病毒感染MDCK细胞，在感染后48小时用抗WSN抗体对感染的细胞进行免疫染色，从而滴定从质粒转染细胞生成的感染性病毒颗粒数量。如图9所示，感染性病毒颗粒生产的效率与病毒RNA片段的数量成正相关病毒RNA片段越多，病毒颗粒的生产越好。这些结果表明病毒RNA片段在高效病毒颗粒生产中起一定作用。
Na vRNA的3’末端对于其包装入病毒颗粒内很重要。缩小NA vRNA中包装信号的范围，制备了截短NA基因的3’或5’(vRNA正义)编码区中有进一步缺失的病毒(图8A)。由缺乏NA编码区5’末端的NA-(183)GFP(0)病毒生成的噬斑约有40％表达eGFP，而由缺乏NA编码区3’末端的NA0G185病毒生成的噬斑仅有1.8％表达eGFP。这些数据表明NA vRNA的3’末端对于其包装入病毒颗粒内很重要(图8)。
讨论通过制备缺失构建体，测定了使NA片段导入病毒颗粒的NA编码区。发现编码区的两端均很重要，但与NA编码区5’末端相对应的vRNA3’末端比另一端更为重要。对于NS片段来说，与NS编码区5’末端相对应的vRNA 3’末端看起来比另一端更为重要(图22)。相比之下，对于HA、M及NP片段来说，两端均很重要，而对于PB2来说，与PB2编码区3’末端相对应的vRNA 5’末端更重要。这些结果说明，对于vRNA片段导入来说重要的序列位于编码区内，并且对于每一片段来说是唯一的。那些区域有可能通过碱基配对与其它病毒RNA相互作用，导致一组8个vRNA片段重新进入病毒颗粒。由于vRNA和病毒组分之间的相互作用是病毒特异性的，这样的相互作用可以成为抗病毒化合物研发的靶点。
实施例3为了获得病毒内含物的真实形象，进行了电子显微镜断层摄影(图11A)。采集了厚度为50nm的病毒颗粒的图象。然后，对这些病毒颗粒中的一个进行分析，重构病毒颗粒内含物的3D图象。颗粒内的结构(杆)进行着色，以区分各结构(图11B～F，显示顶视图、侧视图及仰视图)。杆的大部分视图为横截面，但是在杆从中间横截的视图中，显示了整个分子。不过，所有视图均显示了杆之间的相互作用。
基于上述概要结果，以及支持每一病毒片段包含一段对于导入病毒颗粒内来说很重要的唯一序列的数据，该序列可能有助于病毒内含物独特形态学特性的形成，vRNA片段很可能选择性地导入流感病毒颗粒中。此信息不仅对鉴定研发抗病毒化合物有用，而且对制备减毒活疫苗也很有用，因为破坏病毒特异性相互作用可以抑制病毒复制并使之减毒。
实施例4材料与方法细胞。293T人胚肾细胞和COS-7细胞于补充有10％胎牛血清(FCS)和抗生素的Dulbecco’s改良Eagle’s最基本培养基(DMEM)中培养。Madindarby犬肾(MDCK)细胞于补充有5％新生牛血清和抗生素的MEM中培养。细胞在5％CO2中于37℃培养。
质粒的构建。Neumann等(1999)描述了如何生成含野生型A/WSN/33(H1N1)HA基因(命名为pPolI-WSN-HA)和野生型B/Lee/40HA基因(pPolI-B-HA)、用于病毒RNA生产的质粒构建体，其中两者的HA基因旁侧有人RNA聚合酶I启动子及小鼠RNA聚合酶I终止子。使用引物及ProofStart聚合酶(QiaGEN)经过PCR扩增生成一系列的A/B嵌合HA pPolI构建体，然后用野生型HA构建体进行连接(图13)。所有构建体均进行测序，确保未包含不需要的突变。
细胞培养中所表达HA的生物测定。用Trans IT试剂(Mirus)将各A/B嵌合HA pPolI构建体(1μg)和其它四种基于pCAGGS的质粒(各1μg)一起转染入COS-7细胞，其中基于pCAGGS的质粒表达三种聚合酶亚基(PA、PB1和PB2)和A/WSN病毒的核蛋白(NP)(Neumann等，1991)。转染后48小时，细胞用霍乱弧茵唾液酸酶(10U/ml)和TPCK-胰蛋白酶(2.5μg/ml)于37℃处理30分钟。然后细胞用4％多聚甲醛固定，并用抗-B/HA抗体和商用ABC检测试剂盒(Vector实验室)进行免疫染色。同样，进行血细胞吸附测定来评估各HA的受体结合性质。简单地说，转染细胞在磷酸盐缓液中的1％鸡红细胞悬液内于室温孵育30分钟，观察前洗涤5次。另外，进行融合测定。简单地说，转染细胞在HEPES缓冲液(pH5.0)中于37℃孵育5分钟，然后在培养基中孵育7小时。用冰甲醇固定后，融合细胞如上所述进行免疫染色。
反向遗传学。按Neumann等(1999)所述用基于质粒的A/WSN或Blee反向遗传系统生成病毒。带来自于质粒的野生型基因型的病毒分别指定为A/WSN-R或B/Lee-R，用作对比的对照。为了生成A/B嵌合病毒，用嵌合HA PolI构建体取代了pPolI-WSN-HA。从293T细胞生成的病毒进行一次有限稀释，实施生物克隆，在MDCK细胞中生成原种病毒。
实验性感染。为了测定病毒的病原性，四周龄的雌性BALB/c小鼠经七氟烷麻醉后，用A/B嵌合病毒或野生型病毒(105TCID50/50μl)进行鼻内感染。监测感染后14天的死亡率及体重。感染三天后，一些感染的小鼠处以无痛处死，测定器官中的病毒滴度。
为了评价各嵌合病毒对野生型病毒攻击的疫苗效力，小鼠用嵌合病毒或野生型病毒(103TCID50/50μl)进行鼻内感染。三周后，一组小鼠处以无痛处死，获取血清及气管-鼻洗液，检测病毒特异性的IgA或IgG抗体。感染4周后，乘余的小鼠在麻醉状态下用50倍LD50的野生型病毒(B/Lee-R)攻击，监测14天内的死亡率及体重。
病毒特异性抗体的检测。用Kida等(1982)所述酶联免疫吸附测定法(ELISA)检验血清及气管-鼻洗液中的IgA或IgG抗体。血清样品用受体破坏酶(REDIIDenka Seken)处理后也检验了HI抗体。
结果A/B嵌合HA基因的构建。为了测定B型HA与A型病毒组分的兼容性，在A/WSN和B/Lee HA基因之间构建了一系列嵌合基因(图14)。由于RNA片段两个末端的非编码区很可能可以在A型病毒和B型病毒之间互相交换，以进行RNA转录和复制(Crescenzo-Chaigne等，1999；Desselberger等，1980；Mster等，1981)，制备了含A型病毒非编码区及B型病毒完整编码区的嵌合HA基因(图14A，ANBH)。此构建体将产生完整的B型HA蛋白。然后制备B型病毒HA编码区及非编码区换成A型病毒相应部分的嵌合基因(ANSBH)。此构建体经细胞信号肽酶除去A型信号肽后也会产生完整的B型HA。类似的，制备编码B型HA跨膜区及胞浆区的序列换成A型的嵌合基因(ANTBH)，从而编码A/B嵌合HA蛋白。制备编码B型HA信号、跨膜区及胞浆区的序列均换成A型的嵌合基因(ANSTBH)。此构建体在切去信号肽后也会产生与ANTBH相同的嵌合HA蛋白。另外，制备HA编码区切割位点上游所有相应序列来自于B型病毒、下游序列来自A型病毒的嵌合体(ANBW)。此构建体将会产生包含B型病毒HA1区和A型病毒HA2区的嵌合HA蛋白。最后制备ANBW构建体中信号序列从B型换成A型的嵌合基因，也可以产生与ANBW一样的嵌合HA蛋白。
细胞培养中所表达A/B嵌合Ha的生物学性质。为了评价嵌合HA的功能性，将每一pPolI构建体与表达野生型PA、PB1、PB2及NP的质粒一起转染入COS-7细胞中。这些嵌合HA构建体均可在细胞表面表达。为了检验这些HA的受体结合活性，进行血细胞吸附测定。测定前，转染的细胞用细菌唾液酸酶处理以除去HA寡糖侧链中的末端唾液酸，因为这些唾液酸会干扰受体结合活性(Luo等，1999)。表达ANBH、ANSBH、ANTBH及ANSTBH的细胞发生了血细胞吸附，而表达另外两种(ANBW和ANSBW)的细胞未发生血细胞吸附(表3)。类似的，前面的HA诱导细胞融合，而后者不会。这些结果表明，前面的HA嵌合体具有生物学功能，而后面两相没有，可能是结构改变所致。与以前报道所预期的一样，A型聚合酶复合物和NP从完整的野生型B型HA片段生成了功能性B型HA(表3)，确证了B型启动子结构与A型聚合酶复合物之间的兼容性。
表3.A/B嵌合HA在所表达细胞及包含它们的病毒中的性质
a)每一HA构建体与表达A型聚合酶及表达NA的质粒一起转染入COS-7细胞。转染48小时后测定各HA的生物学性质。
b)含有野生型或嵌合HA基因和其它A型流感病毒基因的病毒用基于质粒的反向遗传学系统生成。转染48小时后收集294T细胞上清，进行感染性滴定。
c)用MDCK细胞制备病毒原种。发生细胞病变效应时收获病毒。
d)NA不能测得。
含嵌合HA的病毒生成。为了测定A型流感病毒感染时嵌合HA基因是否起作用，制备了HA基因为A/B HA嵌合基因所取代的突变WSN病毒。基于质粒的反向遗传学可以产生滴度约为107TCID50/ml的野生型病毒(表3)。当用pPolI-B-HA替换掉pPolI-WSN-HA时，未产生感染性病毒。虽然由质粒所转染细胞的上清病毒滴度判定的效率不同，这四种具有生物学功能的嵌合HA构建体(表3)均成功地在感染性A型病毒中保留下来了。含ANBH HA的病毒仅有微弱的复制，而含ANSTBHHA的病毒效率最高，长到了超过106TCID50/ml。另外两种不表达具有生物功能的蛋白的HA基因不能支持病毒生长。这些A/B嵌合病毒指定为ANBH病毒、ANSBH病毒、ANTBH病毒和ANSTBH病毒。
为了确认哪一种产生的病毒确实包含B型HA外功能域，用这些病毒感染MDCK细胞，并检验它们与A型病毒或B型病毒HA抗体的反应性(图14)。用含嵌合HA构建体的病毒感染的细胞与抗-B/HA抗体及抗-A/NP抗体反应，但不与抗-A/HA抗体反应，确证了这些病毒包含B型HA外功能域。
A/B嵌合病毒在细胞培养中的生长特征。为了测定A/B HA嵌合病毒的复制性质，用这此病毒以0.01的MOI感染细胞，对所得病毒检验其生长动学(图15)。尽管这些带嵌合HA的病毒没有一种长得比野生型A型病毒更好，ANSTBH和ANTBH嵌合病毒几乎长到了106TCID50/ml。与A型及B型病毒均不一样，这些病毒均形成极小的噬斑，只有用免疫染色才能检测到(数据未列出)。
A/B嵌合病毒在小鼠中的复制。A/B嵌合病毒在细胞培养中的限制性复制提示这些病毒可在体外减毒。因此，小鼠用A/B HA嵌合病毒(105TCID50/50μl)进行鼻内接种。ANBH病毒未做检验，因为其原种滴度太低(约103TCID50/ml)。其它三种检验的嵌合病毒没有一种可致小鼠死亡，而同样剂量的A型病毒杀死了所有感染的小鼠，同样剂量的B型病毒则杀死了8只受感染小鼠中的7只(表4)。接种后第3天从肺和鼻甲复原出了嵌合病毒，表明这些病毒在小鼠中得以复制。有趣的是，嵌合病毒的复制在肺部更受限，而在鼻甲的复制受到的限制要少一些。说明肺中的病毒复制与致死性之间可能存在联系。与野生型A型病毒感染的小鼠相比，ANTBH及ANSTBH嵌合病毒感染的小鼠其体重下降的程度要小一些。总而言之，这些数据表明A/B HA嵌合病毒在小鼠中减毒了。
表4.小鼠中A/B嵌合病毒的病原性
a)小鼠用病毒(106TCID50)在鼻内接种，监测14天。体重变化用均值±标准差(SD，n＝3)表示。
b)接种后第3天测定器官中的病毒滴度，以Log10TCID50/g的均值±SD(n＝3)表示。
c)NA不能测得d)对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行模拟接种。
当野生型病毒感染时，A/B HA嵌合病毒免疫对小鼠的保护作用。由于A/BHA嵌合病毒表达来源于B型病毒的HA外功能域，可以预测的是这些病毒能提供对野生型B型病毒感染的保护性免疫反应。在攻击实验之前测定小鼠经嵌合病毒感染后是否诱导出了抗-B型抗体。接种三周后，用ELISA检验在来自于嵌合病毒所感染小鼠的鼻/气管洗液内检测到了B型病毒特异性IgA，在血清中则检测到了IgG抗体(图16A)。来自于A/B HA嵌合病毒所感染小鼠的血清样品中也检测到了HI抗体(图16B)。因此，尽管ANSBH诱导的免疫反应效率低一些，在所有用嵌合病毒感染的小鼠中均证明产生了特异性的抗体反应。
这些嵌合病毒免疫的小鼠于免疫后4周用50倍LD50的B型病毒攻击(表5)。攻击后，这些小鼠均存活下来，而所有对照模拟免疫的小鼠均死了，用亚致死量(103TCID50)WSN病毒免疫的8只小鼠在野生型B型病毒攻击后仅有2只存活下采，表明嵌合病毒的免疫反应对野生型B型病毒感染具有特异性保护作用。另外，除一只攻击3天后接受ANSBH病毒的小鼠外，从嵌合病毒预免疫的小鼠鼻甲或肺未复原出B型病毒(数据未列出)。
表5.A/B嵌合病毒免疫小鼠对野生型B型病毒攻击的保护作用
a)小鼠用所列病毒进行鼻内感染b)免疫4周后，小鼠用野生型B/Lee-R病毒(50倍LD50)在鼻内进行攻击，攻击后监测14天。体重的变化用均值±SD(n＝3)。
c)NA不能测得d)对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行模拟接种和攻击。
讨论正如本文所述，首次在A型病毒背景下生成了具有B型而不是A型HA的流感病毒，从而同时包含A型和B型病毒蛋白。生成A/B HA嵌合病毒所必需的是什么呢？嵌合基因必须转录和复制以便在病毒颗粒中维持下来。尽管在相同病毒类型中是保守的，A型和B型RNA片段之间的非编码区(含RNA转录和复制所需启动子序列(Luyt jes等，1989)两端的末端序列不同(Crescenzo-Chaigne等，1999；Desselberger等，1980)。但是，以前的研究显示A型聚合酶使旁侧有B型病毒NS片段非编码区的报道基因得以转录(Muster等，1991)。而且，生成了包含嵌合基因的嵌合A/B流感病毒(NA/B-NS)，其中嵌合基因包含A型病毒NA的编码序列和B型病毒NS的非编码区(Muster等，1991)。这些数据表明虽然程度低于A型病毒基因的同源启动子，A型聚合酶复合物还是识别出了B型NS基因的启动子序列。
各RNA片段的非编码区包括两个结构性区域所有8个RNA片段中保守的终止序列和内部片段特异性的序列。由于启动子活性主要由前面区域决定(Portela等，1999)，所有B型基因片段均有可能被A型聚合酶复合物转录和复制。实际上，用含B型非编码区的pPolI-B-HA质粒和表达A型聚合酶及NP的质粒感染细胞后，细胞中有B型HA表达(表3)，这一数据支持上述观念。因此，未生成含完整B型HA片段的病毒即HA类型间重排体，不能解释为缺乏RNA的转录和复制。
嵌合病毒生成的限制性可能起始于RNA片段导入病毒颗粒的水平；对于病毒生成来说，嵌合片段必须包装入病毒颗粒。尽管有报道认为A型NS片段的非编区包含RNA包装信号(Luyt jes等，1989)，流感病毒RNA片段的包装机制尚未完全阐明。病毒颗粒导入所需RNA片段的序列或结构特性大半仍是未知的，但是，最近发现A型NA RNA片段在编码区的两端均有其自身的病毒颗粒导入信号(Fujii等，2002，实施例2)。在此研究中，ANSBH病毒的复制效率比ANBH病毒的复制效率更高(图14和表3)。因为这两种病毒中表达的HA蛋白应该是一样的，那么复制效率的差异可能是RNA包装效率不同的结果。也就是说，编码HA信号序列的区域内可能存在高效RNA包装所需的结构性特性。类似地，这也可解释ANTBH和ANSTBH病毒之间复制效率的差异，它们也表达相同的HA蛋白。事实上，A型HA片段的包装信号位于编码区的两端(数据未公开)。有趣的是，含A型病毒NA非编码序列及B型病毒NA编码区序列的嵌合NA基因不能进入A型病毒中(Ghate等，1999)。这可以解释为缺乏含RNA包装信号的A型病毒NA编码区所致，与前面提及的最近发现(Fujii等，2002)一致。
就A/B HA嵌合病毒的生成来说可能也存在蛋白质水平上的关键相互作用嵌合蛋白必须包装入病毒颗粒中，而且必须对病毒复制发挥作用。反式方式供应的B型NA蛋折可以替代A型NA的功能并导入A型病毒颗粒中，支持NA缺失的A型病毒在细胞培养中完成多个复制循环(Ghate等，1999)。但是，正如前面所讨论的，并没有产生含B型NA的A型病毒。尽管产生了嵌合A/B HA病毒，与野生型病毒相比它们还是弱化了。这种弱化可能起始于B型HA受体结合活性和A型NA唾液酸酶活性之间的次最佳平衡。另外，HA中信号肽及/或跨膜区/胞浆域的替换可能已经使结构发生了改变。例如，HA中的跨膜区/胞浆域可以与其它病毒组分如引导高效病毒装配的M1相互作用(Ali等，2000；Cenami等，1996；Jin等，1997；Zhang等，2000)。因此，不能产生含完整B型RNA片段的A型病毒或含完整A型RNA片段的B型病毒，其原因可能为RNA片段导入水平或蛋白功能性相互作用水平上受到限制，或者二者兼而有之。
A/B HA嵌合病毒在小鼠中因肺部受限制的复制得以减毒，并为小鼠提供了对野生型B型病毒感染的保护性免疫，提出了一种研发流感疫苗的新方法。目前，皮下施用三价灭活流感疫苗是全世界的标准，但是它们的效率不是最优的。这主要是因为在流感病毒起始入侵的上呼吸道外未能诱导出令人满意的体液免疫(Wavening等，2001)。因而，虽然这些疫苗可以减轻疾病的严重程度，但不能预防病毒感染。与灭活疫苗不同，活疫苗同时诱导体液免疫反应和细胞毒性T细胞免疫反应。此处所述的研究表明HA基因的嵌合操纵可以控制病毒减毒到不同的程度。这样，此方法可允许生产在减毒和免疫原性间达成适当平衡的活疫苗株。此外，A/B嵌合HA可以导入减毒突变已得到良好鉴定的耐寒A型流感病毒中(Maassab等，1999)。目前耐寒疫苗是A型病毒和B型病毒的混合物。两种病毒之间的相互作用可能影响疫苗的效力，虽然此问题已通过调整病毒的剂量比而得以解决。含A/B嵌合HA的A型病毒将允许生产基于单个而不是两个减毒病毒的活疫苗，从而消除A型病毒和B型病毒之间潜在的干扰。
因此，与对B型疫苗株减毒突变所知甚少、含A型病毒及B型病毒混合物的活减毒疫苗不同，可以生成含A型病毒背景下B型HA及NA的病毒。此方法允许生产基于主疫苗株的活疫苗，其中主疫苗株用于表达A型及B型HA和NA的减毒突变已得到良好界定。而且，病毒片段包装信号的知识也促进了改良活减毒流感疫苗的研发。
实施例5材料与方法细胞和病毒。293T人胚肾细胞(293细胞系中插入了猿病毒40T抗原基因的衍生系)在补充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改良Eagle培养基中培养。Baby仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵细胞(CHO)和Madindarby犬肾细胞(MDCK)分别用含5％FCS的DMEM、含10％新生牛血清的MEM和含5％新生牛血清的MEM培养。所有细胞在5％CO2中于37℃培养。A/WSN/33(H1N1)(WSN)病毒经Neumann等(1999)所述反向遗传学生成，并在MDCK细胞中繁殖。VSV印第安那株由反向遗传学生成并在BHK细胞中繁殖。
反向遗传学。为生成流感病毒样的颗粒(VLP)及突变A型流病毒，使用了含WSN病毒基因cDNA的质粒(称为PolI质粒)和真核蛋白表达载体pCAGGS/MCS(受鸡β-肌动蛋白启动子控制)，其中WSN病毒基因受人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子控制。简单地说，PolI质粒和蛋白表达载体与转染试剂Trans IT LT-1(Panver，MadisCon，WI)混合，于室温孵育15分钟，加到Opti-MEM(GIBCO/BRL)培养的1×106个293T细胞中。6小时后，DNA转染试剂换成含0.3％BSA和0.01％FCS的Opti-MEMI(GIBCO/BRL)。48小时后，收获上清中的VLP或突变A型流感病毒。此研究中生成的转染体均包含突变的HA vRNA片段和WSN病毒的其它vRNA片段，并按突变HA vRNA片段命名(例如，含HA(0)GFP(0)RNA片段的VLP指定为HA(0)GFP(0)VLP)。
质粒的构建。pPolI HA(0)GFP(0)用于生成含HA vRNA3’非编码区、增强荧光蛋白互补编码序列及HA vRNA 5’非编码区的反义RNA。简单地说，GFP基因用含BsmBI位点和HA 5’或3’非编码序列的引物经PCR扩增，用BsmBI消化，并克隆入PolI质粒的BsmBI位点。此质粒导入细胞可以生成反义方向上含编码GFP的序列的RNA，其中所该序列旁侧有HA vRNA的5’及3’非编码区。
pPol IHA(468)GFP(513)这样制备先用紧接引物Bam500R(5′-GCGGAT CCT CCC CTA TGG GAG CAT GAT AC-3’；SEQ ID NO6)和Xba1218F(5′-GCT CTA GAA ACT CTG TTA TCG AGA AAA TG-3’；SEQ ID NO7)经反向PCR扩增用于生成WSN vRNA的pPolIHA。PCR产物用BamHI和XbaI消化，然后将GFP基因克隆入BamHI位点和XbaI位点。所得质粒pPol IHA(468)GFP(513)用于生产含HA vRNA 3’非编码区和3’编码区468个碱基、GFP编码序列、HA vRNA 5’编码区513个碱基和5’非编码区的反义RNA。以同样的方式经反向PCR生成一系列HA缺失突变体。这些突变体根据来源于HA编码区的核苷酸数命名，例如HA(9)GFP(80)RNA片段包含HA 3’非编码区，与N-末端区对应、来自于HA编码区的9个核苷酸，GFP阅读框，与C-末端区对应、来自于HA编码区的80个核苷酸，以及HA 5’非编码序列。这些质粒构建体均进行测序，确保PCR未引入不需要的突变。
用PCR生成pPol IHA(0)VSVG(0)，它用于生成含HA vRNA 3’非编码区、V SVG互补编码序列及HA vRNA 5’非编码区的反义RNA。简单地说，用含BsmBI位点和HA 5’或3’非编码序列的引物，以pCAGGS-VSVG为模板经PCR扩增VSV G基因。PCR产物用BsmBI消化，并克隆入pHH21载体的BsmBI位点。将VSV G的编码序列克隆入HA(9)GFP(80)的BamHI位点和XbaI位点，从而制备pPol IHA(9)VSVG(80)。pPol INA(183)GFP(157)包含NA vRNA 3’非编码区和编码融合蛋白的互补序列，其中编码融合蛋白的序列含61个NA的N-末端密码子、两个连续的终止密码子(TAA-TAG)及NA vRNA 5’末端的185个碱基。它的制备方法如下pT7Blue-NA内WSN NA基因中与第203个至1099个核苷酸(正义)对应的区域先经PCR用BglII位点取代，然后将GFP基因克隆入此BglII位点和1226位的StuI位点。然后将NA(183)GFP(157)基因插入PolI质粒pHH21的BsmBI位点。
用于生产反义INA(183)GFP(157)Met(-)RNA的pPol INA(183)GFP(157)Met(-)缺少NA蛋白的起始密码。它的制备方法如下通过体外定点突变(GeneEditor，Promega)将pPol INA(183)GFP(157)中pPol INA(183)GFP(157)基因的ATG起始密码子和位于第15个密码子的另一个ATG换成GCG。所得构建体pPol INA(183)GFP(157)Met(-)包含NA 3’非编码区(19个核苷酸)、与NA编码区N端对应的183个核苷酸、GFP开放阅读框、两个连续的终止密码子(TAA-TAG)、与NA编码区C端对应的157个核苷酸及NA 5’非编码区(28个核苷酸)，它受人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子控制。
免疫染色测定。在流感VLP感染16小时后，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，用3.7％甲醛(在PBS中)于室温固定20分钟，然后用0.1％TritonX-100处理。为了检验VLP的生成效率，取106个细胞与0.1ml质粒转染的293T细胞培养上清一起孵育，记录感染16小时后免疫染色测定NP为阳性的细胞数。
Western印迹。VLP或突变病毒于4℃以50,000×g的离心力离心下来。浓缩后的VLP或病毒重悬于裂解缓冲液(0.6M KCl，50mM TrisHCl，pH7.5，0.5％TritonX-100)中。裂解液置于15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，电转移到聚偏乙烯二氟(PVDF)膜上，用PBS中的5％脱脂奶于4℃封闭过夜，然后与抗-WSN病毒多克隆抗体、抗-HA单克隆抗体或抗-VSVG单克隆抗体于室温孵育1小时。膜用含0.05％吐温-20的PBS洗涤三次。结合的抗体用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector)及Konica免疫染色试剂盒(Konica)检测。
Northern杂交。存在于PolI质粒所感染293T细胞中的vRNA用Isogen RNA提取试剂盒(Nippon Gene，东京，日本)于转染24小后提取出来。RNA在乙二醛/DMSO/磷酸缓冲液中于50℃乙二醛化Glyoxalate化，在10mM磷酸缓冲液(pH7.0)中的1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。RNA点样到尼龙膜上，并与寡核苷酸探针杂交，该探针与GFP序列(ATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGG；SEQ ID NO8)(10pmol)互补，并用DI G寡核苷酸加尾试剂盒(Roche)于37℃标记30分钟。利用该GFP探针于Easy Hyb(Roche)中于42℃过夜完成杂交。RNA条带用DIG核酸检测试剂盒(Roche)检测。简单地说，杂交膜用洗液(0.1M马来酸、0.15M NaCl、0.3％吐温-20，pH7.5)洗涤，用1％封闭试剂于室温封闭30分钟，与偶联有碱性磷酸酶的抗-DIG抗体(1∶5000)一起于室温孵育30分钟。然后膜用洗涤缓冲液洗涤，与检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)的氯化氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)中于室温避光孵育。RNA条带用DIG核酸检测试剂盒(Roche)检测。对照RNA从模拟转染的293T细胞中提取。
转染体病毒的复制性质。24孔板中的双孔RHK、CHO或MDCK细胞用病毒感染，用含0.01％FCS的MEM培养基覆盖，于37℃孵育。于不同时间取上清测定MDCK细胞噬斑测定中的感染性病毒。
结果。
HA vRNA的编码区是HA片段导入病毒颗粒中所必需的。为了测定HA vRNA的编码区是否象NA vRNA那样为导入病毒颗粒所必需，构建了两个质粒仅含HA vRNA 5’及3’非编码区和GFP编码序列的pPol IHA(0)GFP(0)，和HA序列于500～1218位(正义方向)核苷酸缺失后GFP编码序列插入HA基因框内的pPol IHA(468)GFP(513)(图17)。后面一个构建体含HA 3’非编码区(33个核苷酸)、与编码区N-端对应的468个核苷酸、带一个终止密码子的GFP开放阅读框以及HA 5’非编码区(45个核苷酸)。所得融合蛋白包含HA N-端的156个氨基酸和完整的GFP序列。
为了产生含这些突变HA vRNA的VLP，用pPol IHA(0)GFP(0)或pPol IHA(468)GFP(513)、7 RNA PolI质粒和蛋白表达质粒转染293T细胞，其中7 RNA PolI质粒用于生成剩余的病毒RNA片段，蛋白表达载体用于表达9种病毒蛋白(即PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M1、M2和NS2)。转染48小时后，收获293T细胞培养上清中的VLP，用它们感染MDCK细胞。由于所得VLP含突变HA，它们表达GFP及除HA之外的所有病毒蛋白。因此未产生无感染性的子代病毒(数据未列出)。感染16小时后，将表达GFP的细胞数(即含编码GFP基因的片段的VLP数)除以表达NP的细胞数(即所有感染性VLP的数目)，以此测定突变HA vRNA的病毒颗粒导入效率。所有感染性VLP在pPol IHA(468)GFP(513)所感染293T细胞(即所有NP阳性的细胞数)培养上清中的滴度是7.4×105感染性VLP/ml，而含pPol IHA(468)GFP(513)RNA的VLP(即GFP阳性的细胞数)滴度是3.2×105VLP/ml。这些结果表明，所有感染性VLP中有42.8％产生了隐匿的突变HA vRNA(图18)。相板只有3.9％的VLP含pPol IHA(0)GFP(0)RNA片段(图18)。这些结果提示，HA vRNA的编码区对于HA片段导入流感病毒颗粒内是必需的。
HA vRNA编码区的3’和5’端对于HA片段导入病毒颗粒内均很重要。以前人们发现NA vRNA编码区的3’端在病毒颗粒导入时发挥着比5’端更为关键的作用。因此，测定了3’端、5’端或是两端对于HA vRNA片段的病毒颗粒导入是否重要。为了解决这一问题，制备了缺乏HA vRNA编码区3’端的HA(0)GFP(1011)基因和缺乏HA vRNA编码区5’端的HA(966)GFP(0)基因(图17)，并如上所述检验了HA vRNA的病毒颗粒导入。尽管质粒感染细胞中两种vRNA的量均与HA(468)GFP(513)vRNA量相当(数据未列出)，HA(0)GFP(1011)和HA(966)GFP(0)的片段导入效率分别只有6.8％和8.4％(图17)，表明HA vRNA编码区的3’和5’端对于HA片段导入病毒颗粒内均很重要。
为了进一步确定HA vRNA中对于其自身导入病毒颗粒的关键区域，生成了一系列所含截短HA vRNA还进一步在3’及/或5’编码区中发生缺失的VLPs(图17)。然后测定突变HA vRNA导入VLPs的导入效率。由于使3’端只剩下15个核苷酸和5’端剩下268个核苷酸的进一步缺失不影响HA vRNA导入效率(HA(468)GFP(513)与HA(15)GFP(268)比较)，用含HA编码区3’端15个核苷酸和5’端268个核苷酸的HA(15)GFP(268)另外构建了缺失构建体。虽然随着缺失的程度增加vRNA导入程度逐渐下降，HA编码区5’端的80个核苷酸是HA vRNA高效导入病毒颗粒所至少必需的(HA(15)GFP(80)与HA(15)GFP(75)比较)。进一步的缺失分析证明，虽然转染细胞中的HA(9)GFP(80)水平与HA(0)GFP(0)RNA水平没有一点差别，HA编码区3’端剩下9个核苷酸残基的HA(9)GFP(80)可以使HA vRNA高效导入病毒颗粒(超过65％)(图17和18)。这些结果表明HA编码区中3’端的9个核苷酸和5’端的80个核苷酸对于HA vRNA有效地导入病毒颗粒中是必需的。
HA及NA基因含外源基因编码序列的新的A型流感病毒的生成。由于HA片段导入病毒颗粒所需序 已测定，又检验了旁侧有这些序列的外源基因是否可以导入A型流感病毒并在反复传代时可以保留下来。作为外源基因模型的VSV G编码区序列插入pPol IHA(9)GFP(80)的BamHI和XbaI位点取代GFP序列。所得构建体指定为pPolIHA(9)VSVG(80)，它包含HA 3’非编码区(33个核苷酸)、与HA编码式N端对应的9个核苷酸、带一个终止密码子VSVG开放阅读框(1552个核苷酸)、与HA编码区C端对应的80个核苷酸以及HA 5’非编码区(45个核苷酸)。构建只含3’及5’非编码区但不含HA vRNA编码区的载体pPol IHA(0)VSVG(0)作为对照。由于VSV G蛋白应该替换HA和NA蛋白，NA编码区可以用外源基因替换。因此，构建pPol INA(183)GFP(157)Met(-)用于生产含GFP编码序列和NA片段高效导入病毒颗粒所需NA编码序列的重组NA RNA片段。此构建体中，将ATG替换成GCG使NA开放阅读框的起始密码子破坏掉。这样，GFP开放阅读框将会从其自身的起始密码子开始翻译。
用生产HA(9)VSVG(80)、NA(183)GFP(157)Met(-)和剩余6种病毒RNA片段的质粒以及表达流感病毒聚合酶蛋白NP、M1、M2、NS2和VSVG的质粒转染293T细胞。转染72小时后，收集293T细胞上清用MDCK细胞进行噬斑测定。含 HA(9)VSVG(80)RNA片段和NA(183)GFP(157)Met(-)RNA片段的转染体病毒(指定为VSVG(HA)GFP(NA)病毒)可以存活并在无胰蛋白酶的条件下生成了表达GFP的噬茵体(图19)。免疫染色确认了含VSV G但不是HA的噬斑的表达(图19)。VSVG(HA)GFP(NA)病毒但不是对照WSN病毒感染的细胞也表达GFP。相反，当用pPol IHA(0)VSVG(0)质粒取代pPol IHA(9)VSVG(80)时，虽然可在MDCK细胞中检测表达GFP及/或NP蛋白的单个细胞，但未能观测到噬斑(数据未列出)。而且，在5次连续传代后还观测到VSVG及GFP均在VSVG(HA)GFP(NA)感染的MDCK细胞中持续表达(数据未列出)。5次传代后在VSVG(HA)GFP(NA)病毒中HA(9)VSVG(80)RNA片段的剩余HA区域未检测到突变。但是，VSVG氨基酸序列中发现了三个突变57位的Ile变成Leu、95位的Gln变成His以及499位的Gln变成终止子。虽然野生型VSV G蛋白含有胞浆域的29个残基，但499位的Gln变成终止子突变使该结构域的最后13个残基缺失了。
VSVG(HA)GFP(NA)病毒的生物学性质。为了测定VSV G蛋白是否确实导入了含其它流感病毒蛋白的病毒颗粒中，对浓缩VSVG(HA)GFP(NA)病毒和WSN(对照)病毒进行western印迹分析。如图20所示，VSVG(HA)GFP(NA)病毒颗粒中检测到了VSV G蛋白而未检测到HA，确认了VSV G蛋白导入了病毒颗粒。
接下来，检验了VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK、CHO或MDCK细胞中的生长性质。以0.001的MOI感染细胞，在感染后的不同时间于37℃用MDCK细胞上的噬斑测定来测定培养上清中的病毒产率。尽管低于WSN病毒的滴度，VSVG(HA)GFP(NA)病毒在BHK和MDCK细胞中的最大滴度至少达到了106PFU/ml(图21)。与WSN病毒在CHO细胞中生长不良相比，VSVG(HA)GFP(NA)病毒在这些细胞中与在另外两种受试细胞系中长得一样好(图21)。另外，在各细胞系中复制时，VSVG(HA)GFP(NA)病毒感染的细胞表达GFP。
这些结果表明，HA(9)VSVG(80)和NA(183)GFP(157)Met(-)片段均高效导入了流感病毒颗粒中，而且反复传代时这两种外源基因在A型流感病毒中得以稳定地保留下来。
讨论测定基因组包装机制对理解流感病毒生活周期及研发基于流感病毒的载体用于表达外源蛋白很关键。本研究证明了HA vRNA编码区3，及5’末端的序列均是此片段高效导入病毒颗粒所必需的。另外，利用此知识生成了一种基于流感病毒的新病毒，证明了两种外源基因的稳定表达；该新病毒包含两种含VSV G和GFP编码序列的重组RNA片段，它们旁侧分别有HA vRNA和NA vRNA导入病毒颗粒所需的序列。
已报道有数种方法用于研发基于A型流感病毒的疫苗载体，这些载体用于表达来源于不相关感染性试剂的基因或其一部分。短多肽插入了HA的抗原位点，造成了对所插入肽段的阳性免疫反应。对于更长的多肽及蛋白质来说，外源基因插入流感病毒基因的一个基因中，在这里外源蛋白利用内部核糖体入口位点(IRES)或口蹄疫病毒2A蛋白酶表达。这里，建立了一种利用NA及HA vRNA中顺式作用病毒颗粒导入信号的新系统用于表达外源蛋白。此系统可以使基于流感的病毒导入超过1.5kb的外源基因(如VSV G)，证明了此载体系统的潜能。由于不可复制型流感VLP在中小鼠中的疫苗效率已知，所带重组RNA片段含来源于不相关病原体的基因、基于不可复制型流感(病毒)的VLP可用作很有希望的疫苗。此潜能对于针对HIV、口蹄疫、及其它感染的疫苗尤基有吸引力，这些情况下活疫苗病毒向野生型病毒的任意回复均不可接受，或是由于体液免疫及细胞毒T淋巴细胞反应而造成灭活疫苗的效率很有限。因此，使用此方法可以将流感病毒用作疫苗载体。例如，可以制备一种HIV gp160编码区取代HA、gag编码区取代NA的病毒(图24和25)。另外，如果VSV G取代了HA，M2就不再需要了，因而就有三种基因可以用异源基因替代。例如，HA可以用HIV gp160取代，NA可以用gag取代，而M2可用nef取代。所得重组流感病毒可用作疫苗或作为另一种HIV疫苗如HIV DNA疫苗的增强剂。此外，疫苗也可以是基于重组流感病毒的多价体疫苗，其中该重组病毒中的NA编码片段用另一种病原体如疱疹病毒D糖蛋白的编码片段，这样该疫苗可以对流感病毒和疱疹病毒感染产生保护性免疫反应。
来源于腺病毒、逆转录病毒和痘病毒的病毒载体可有效地将外源基因导入靶细胞中。由于这些病毒包含可以整合入宿主染色体的DNA或DNA复制中间体，无法消除发生不良后果的危险。相反，由于在受感染细胞中缺乏DNA期，这样的整合在流感病毒中是不会发生的。另外，由于VSVG(HA)GFP(NA)病毒不象其它典型流感病毒那样需要HA切割所需的胰蛋白酶，它可以有更广泛的用途。另外，可以通过改变病毒颗粒表面上的糖蛋白而生成具有所需细胞向性的重组病毒。这样，利用vRNA片段中病毒颗粒导入顺式作用信号的系统可以设计基于流感的重组病毒载体，这些载体可以将多个外源基因输送入靶细胞。
来源于上皮细胞的病毒其装配和释放在一些病毒中是极化的，选择性地发生在顶点或基侧的表面。据认为极化病毒芽殖在测定病毒感染病原性时起一定作用。A型流感病毒从受感染上皮细胞的顶部芽殖，个别表达的HA、NA及M2蛋白也靶向到细胞的顶部表面。另一方面，VSV从受感染细胞基侧表面释放，VSV G蛋白也转运到基侧表面。本研究中，成功地生成了用VSV G取代HA及NA蛋白的重组病毒VSVG(HA)GFP(NA)病毒。但是，由于点突变此重组病毒的VSV G蛋白缺乏胞浆结构域的最后13个残基。已知胞浆结构域中这13个残基缺失而生成的蛋白转运到顶部表面的效率比转运到基侧表面的效率高。因此，VSVG(HA)GFP(NA)病毒中VSV G蛋白内引入的突变很可能促进它高效转运到顶部表面，造成了VSVG(HA)GFP(NA)病毒的高效芽殖。
流感的流行常常在流感病毒RNA片段发生重排使病毒的HA及/或NA与以前传播的病毒株有着免疫学不同时发生。HA、NA、M及NS vRNA内编码区3’和5’的序列对于它们高效导入病毒颗粒是必需的。vRNA片段的包装(很可能是病毒核蛋白复合物的形式)由病毒RNA片段间反式发生的RNA-RNA相互作用介导。如果是这样，各片段内的特异性导入信号可能限制RNA片段的重排。从经验上来说，已知流感病毒RNA片段不会发生随机重排。据认为蛋白间的功能性相互作用(如聚合酶复合物的形成、HA-NA及或切割HA-M2功能性连接)限制了随机重排。除了蛋白质水平上的这些重排限制外，RNA水平上可能也存在类似的限制。在此背景下，1957及1968年流行时，除HA及/或NA基因外PB1基因也导入了来源于禽病毒的人病毒，提示HA和PB1 RNA片段间可能存在关联。进一步鉴定对于其它RNA片段导入病毒颗粒的关键区域可提供理解RNA片段重排的线索，从而预测新型A型流感病毒流行株的出现。
总之，有了vRNA包装信号的信息，就可以研发新的流感疫苗和基于流感的疫苗载体。
实施例6如图26所示，可以制备组成性表达编码蛋白如NS2的流感病毒样RNA的细胞系，即使此RNA缺乏导入信号。也可制备缺乏NS2编码序列(NS2 KO)的病毒(Neumann等，2000；Watanabe等，2002)。因为病毒缺乏NS2，当NS2 KO病毒感染正常细胞时将不会产生子代病毒。相反，当NS2 KO病毒感染表达编码NS但缺乏导入信号的流感病毒样RNA的细胞时，病毒感染后NS2得以表达从而产生了子代NS2 KO病毒。但是，编码NS2的流感病毒样RNA不会导入NS2 KO病毒中，因为它缺乏病毒颗粒导入信号。因此，NS2 KO在正常细胞中仍然是不可复制型。此系统可用于生产不可复制型病毒的生产细胞。利用此系统，可以制备表达病毒蛋白的生产细胞，其对细胞的毒性通常会阻止组成性表达它们的细胞系产生。因此，在本申请中，病毒颗粒导入信号的知识可以用于设计不允许特定片段导入病毒颗粒的系统。
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所有出版物、专利及专利申请在此引入作为参考。尽管在前述说明书中本发明已说明了相关的其中一些优选实施方案，出于阐述目的也列出的许多细节；对于本领域内的熟练技术人员来说，本发明容许另外的实施方案及本文所述某些细节可以作出很大改变而不背离本发明的基本原则是非常直观的。
权利要求
1.包含流感病毒导入序列的流感病毒载体，该载体包含a)与流感病毒NA vRNA3’非编码区对应的序列，3’NA导入序列，异源核酸片段和NA vRNA5’非编码区；b)与流感病毒HA vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’HA导入序列和HA vRNA5’非编码区；c)与流感病毒M vRNA3’非编码区对应的序列，3’M导入序列，异源核酸片段，5’M导入序列和M vRNA5’非编码区；d)与流感病毒NS vRNA3’非编码区对应的序列，3’NS导入序列，异源核酸片段和NS vRNA5’非编码区；e)与流感病毒PB2 vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PB2导入序列和PB2 vRNA5’非编码区；f)与流感病毒PB1 vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PB1导入序列和PB1 vRNA5’非编码区；或g)与流感病毒PA vRNA3’非编码区对应的序列，异源核酸片段，5’PA导入序列和PA vRNA5’非编码区；其中当与该载体对应的vRNA存在于表达流感病毒蛋白并包含除与该载体对应的vRNA之外的vRNA的细胞中时，与该载体对应的vRNA包装入病毒颗粒中。
2.权利要求1a)的载体，其中3’NA导入序列包括至少19个与NA起始19个编码核苷酸对应的核苷酸。
3.权利要求2的载体，其中所述载体还包含5’NA导入序列。
4.权利要求3的载体，其中所述5’NA导入序列包括至少39个与NA3’39个编码核苷酸对应的核苷酸。
5.权利要求1a)的载体，其中3’NA导入序列包括至少90个与NA起始90个编码核苷酸对应的核苷酸。
6.权利要求1b)的载体，其中5’HA导入序列包括至少80个与HA3’80个编码核苷酸对应的核苷酸。
7.权利要求1b)的载体，其中5’HA导入序列包括至少291个与HA3’291个编码核苷酸对应的核苷酸。
8.权利要求1b)的载体，其中所述载体还包含3’HA导入序列。
9.权利要求8的载体，其中3’HA导入序列包括至少3个与HA起始3个编码核苷酸对应的核苷酸。
10.权利要求8的载体，其中3’HA导入序列包括至少9个与HA起始9个编码核苷酸对应的核苷酸。
11.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段包含与内部核糖体入口序列对应的序列。
12.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段包含与标记基因开放阅读框对应的序列。
13.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段包含与病原体免疫原性蛋白或肽或治疗性蛋白的开放阅读框对应的序列。
14.权利要求1的载体，其中所述导入序列来自于A型流感病毒。
15.权利要求1的载体，其中所述导入序列来自于B型流感病毒。
16.权利要求1的载体，其中所述异源核酸片段与另一核酸片段融合以编码融合蛋白。
17.包含与权利要求1的载体对应的vRNA的重组流感病毒。
18.权利要求17的重组病毒，其中所述异源核酸片段包含与标记基因开放阅读框对应的序列。
19.权利要求17的重组病毒，其中所述异源核酸片段包含与病原体免疫原性蛋白或肽的开放阅读框对应的序列。
20.权利要求19的重组病毒，其中所述开放阅读框编码HA蛋白。
21.权利要求19的重组病毒，其中所述开放阅读框编码NA蛋白。
22.权利要求17的重组病毒，其中所述异源核酸片段包含与跨膜蛋白开放阅读框对应的序列。
23.权利要求17的重组病毒，其中所述异源核酸片段包含与蛋白开放阅读框对应的序列，该蛋白具有膜融合活性。
24.权利要求17的重组病毒，其中所述异源核酸片段包含与病毒衣壳蛋白开放阅读框对应的序列。
25.权利要求17的重组病毒，其中所述异源核酸片段包含与水泡性口炎病毒G蛋白开放阅读框对应的序列。
26.权利要求17的重组病毒，其中所述异源核酸片段包含与治疗性蛋白开放阅读框对应的序列。
27.权利要求20的重组病毒，其中所述HA蛋白为B型HA蛋白。
28.在细胞中表达异源核酸片段的方法，该方法包括让细胞与权利要求17的重组病毒接触，检测或测定细胞中是否有所述异源核酸片段编码的产物表达。
29.包含与NA5’编码区对应的流感病毒NA导入序列和异源核酸片段的分离核酸分子。
30.包含与NS5’编码区对应的流感病毒NS导入序列和异源核酸片段的分离核酸分子。
31.包含与HA3’编码区对应的流感病毒HA导入序列和异源核酸片段的分离核酸分子。
32.包含与PB23’编码区对应的流感病毒PB2导入序列和异源核酸片段的分离核酸分子。
33.包含与M3’编码区及M5’编码区对应的流感病毒M导入序列和异源核酸片段的分离核酸分子。
34.权利要求1的载体，其中与所述载体对应的vRNA当在细胞中存在时以是相应野生型vRNA的至少10％的效率包装入病毒颗粒中。
35.权利要求1的载体，其中与所述载体对应的vRNA当在细胞中存在时以是相应野生型vRNA的至少30％的效率包装入病毒颗粒中。
36.权利要求1的载体，其中与所述载体对应的vRNA当在细胞中存在时以是相应野生型vRNA的至少60％的效率包装入病毒颗粒中。
37.制备不可复制型流感样病毒的方法，该方法包括a)让重组宿主细胞与缺乏含野生型NS编码序列的vRNA及包含重组酶序列的重组流感病毒接触，其中重组宿主细胞包含重组核酸分子，该重组核酸分子包含与两位点特异性重组序列操纵性连接的NS2开放阅读框而不是导入序列，所述重组序列与NS2开放阅读框的5’端连接，并且所述重组序列由重组酶识别；而且在无重组酶存在时NS2不表达；和b)将不可复制型流感样病毒与重组宿主细胞分离开来。
38.权利要求37的方法，其中所述重组酶为Cre，位点特异性重组序列为loxP序列。
39.权利要求37的方法，其中所述重组酶为FLP，位点特异性重组序列为frt序列。
全文摘要
本发明提供了流感病毒载体的一种包装(导入)信号，以及使用该信号在病毒及细胞中传递和维持流感病毒及外源核酸的方法。
文档编号C12N15/09GK1997734SQ03808356
公开日2007年7月11日 申请日期2003年2月12日 优先权日2002年2月13日
发明者河冈义裕 申请人:威斯康星旧生研究基金会