专利名称：基于微生物活性的过程控制的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境条件的确定。特别地，本发明涉及采用微生物确定环境条件，以用于过程控制的目的。
许多工业与自然过程，例如食品的制备与包装，由于主导过程条件不容易确定因而不能较好的控制。对有关主导过程条件知识的缺乏，其结果是使过程控制变得非常困难并且大多数是无效的。
许多情况下，该过程决定于希望或不希望存在的微生物，或者很大程度上受其影响。这种过程的实例是食品制备过程、食品包装、生物膜形成过程、发酵过程和生物转化过程。
在这些过程中起作用的微生物活性的控制，例如杀灭不希望的微生物，或者相反刺激所希望的微生物的活性，通常是有问题的。例如，对杀灭不希望微生物过程的效力评价通常是通过确定其后仍然存活的微生物数量进行的。
在上述示例过程和许多其他过程中，对目标生物体的特异生物学反应并不直接进行分析。这使得对以上过程的有效和实际控制通常不是太有可能。
对环境条件的控制或监测是非常希望的，这些环境条件例如(气压)压力、温度、化学物质浓度、含湿量和/或大气湿度、酸度、光照制度、周围环境或特定工作室中的噪音和辐射，例如设备清洗房，手术室，分析检测室，化学物质存储室等等。从安全的角度上讲，对我们周围环境中威胁健康的化学物质或生物物质的控制或监测是希望的，包括周围空气，水团，地面和食品。由于毒性成分自身未知或者由于不希望只有特殊结合物这一事实，因而对这些物质的检测如果并非不可能的话，则在很多情况下是有问题的。由此，若可利用对环境条件的改良控制或监测，则也是希望的。
在本文中，术语“环境条件”其义涉及广义上的环境物理和/或化学条件。更特殊的，在本文中，它与环境中特殊化学物质的存在有关。
现今，利用专为环境目的开发的仪器，可容易地检测各种环境条件。同样，也有用于检测许多化学类化合物的特殊生物传感器。然而，许多化学类化合物不容易被检测或者根本不能被检测。
例如，文献中已有一些用于检测特殊化学物质的微生物传感器。Tauriainen等(Wat.Res.2000，Vol.34，pp.2661-2666)描述了一种用于检测诸如镉、汞、铅及砷金属的微生物传感器。这种微生物传感器由大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞生成，在细胞中插入的萤光素酶基因的表达在一个金属敏感性调控单位控制之下。例如，Belkin等(Wat.Res.1997，Vol.31，pp.3009-3016)描述了一种用于检测(毒性)物质和环境应力的微生物传感器。这些方法包含重组细菌细胞中生物发光的检测，其中生物体与特殊环境条件反应的诱导途径或方式是已知的。
国际专利申请WO99/09202描述了一种检测环境中毒性物质的方法，其中环境中毒性物质的存在通过网柄菌(Dictyostelium)细胞中的β-半乳糖苷酶蛋白的检测进行确定，该蛋白是作为报告基因的表达结果。这种情况中，生物体内改变受作用的方式也是已知的。
然而，许多情况下诱导途径是完全未知的，因而采用本领域现有技术的方法，只能确定少量的不同环境条件。
如今已惊异地发现微生物可用作检测仪器，这是因为，由于生物化学组成的改变，它们可与环境以特定形式发生反应，从而大致可由此推断出许多环境条件，而原则上不必知道导致这种改变的诱导途径。
本发明通过检测置于所述环境条件中的一种或多种微生物的生物化学组成，从而提供了一种检测环境条件的方法。优选地，对天然生物化学组成进行检测以与重组生物化学组成进行对照。
本发明也通过检测置于所述环境条件中的一种或多种微生物的生物化学组成的改变，从而提供了一种确定环境条件的变化的方法。
本发明进一步地提供了一种确定环境条件的方法，包括对置于所述环境条件的一种或多种微生物的生物化学组成的检测，将该生物化学组成与预先确定的一种或多种微生物的多种生物化学组成校准线进行比对，所述校准线通过将所述一种或多种微生物置于多种环境条件下而得到，由此在该生物化学组成于校准线所处位置的基础上确定环境条件。
改良的方法在微生物内在改变的基础上得以监测和控制过程，而不论该微生物是否已存在于过程或(过程)环境中，或者利用根据本发明的方法于其中引入微生物，以用于确定环境条件的目的。
改良的方法提供了检测环境中以前无法检测的极微小改变的可能性。
本发明采用的原理是微生物可对外部影响产生强烈反应。应用外部刺激后，微生物的内在改变在于生物分子数量和性质的改变，例如RNA，蛋白质和代谢物。现今已发现，这些改变的总和具有微生物所受外部刺激性质的特性。进一步地，通过检测和比较不同条件下微生物内这些生物分子的浓度，可选择出特殊改变的几组生物分子，这些改变是作为微生物在特殊刺激或环境条件影响下的反应结果。
微生物可以这种方式作为特殊传感器以确定环境条件，确定这些环境条件的改变程度，确定刺激的性质和水平，并使不同刺激对各种过程效应的检测成为可能，由此控制这些过程。
这种方法的实例包括-确定温度或基于温度的保存方法对微生物生长和/或死亡的影响；-深入研究过程特性改变的性质对微生物生产率的影响；-微生物分解不希望的毒性物质(生物降解)；-测试抗微生物物质，例如抗生素和杀虫剂，对不希望的微生物生长及对抵抗细菌进行控制的效力；-测试不同材料对表面上不希望的微生物生长进行预防的作用。
根据本发明的方法尤其提供了确定抗生素对微生物影响的可能性，从而使用于抗生素的筛选分析的建立，或评价特殊处理过程对诸如生物膜的形成的影响及需要时对其进行改善成为可能。这种生物膜形成的分析和控制与诸如军团菌感染的预防有关。同样，可以这种方式对发酵过程和生物转化过程进行控制和改进。而且，有可能开发一种用于定制的过程控制的集成系统，以用于食品制备，或用于诸如具有长保存寿命的安全食品的新的温和的保存方法。
同样，依靠根据本发明的方法，通过确定一种或多种微生物组成中特殊刺激诱导的改变，可得以确定环境条件，例如环境中化学物质的出现。
可用于本发明方法的微生物有细菌、古细菌(archaea)、真菌、酵母菌、原生动物和藻类等等。优选地，本发明方法中采用细菌、酵母和/或真菌。
在本发明实施方案中，微生物的使用形式可以为单个微生物的纯培养物或单一培养物，但也适合采用微生物的混合物，包括天然混合种群和人工组成的混合种群。也可采用天然出现的或在完全不同环境条件下某一环境条件过程中的单一培养物或混合种群。
在本发明方法中，在特殊微生物起作用的过程控制中，优选地采用这些过程的特殊微生物。
如果某一过程中没有微生物，可将微生物与该过程条件接触或短或长的一段时间，例如优选地从过程开始之时即将微生物引入处理室，或者将(部分)加工物件(process matter)与处理室外的微生物相接触。
如果需要，微生物可预先培育。在特定实施方案中，优选地采用均一或标准化或确定生理学条件下的微生物。这些情况可以是，例如将微生物置于处理室外的过程条件下，例如将其置于(部分)加工物件中，诸如潜在的抗生素或水、空气、食品的样品，或者将微生物置于特定过程条件下或短或长的一段时间以达到确定微生物改变的目的。将微生物培育成均一或标准化或确定的生理学条件可适用于此处提及的情形中。
在本文中，均一或标准化或确定生理学条件是指可提供已知生物化学组成的微生物条件。如果这种生物化学组成可重复得到，则可视为标准。
然而，并不需要微生物以均一或标准化或确定生理学条件下被使用。实际上，对本发明方法中采用的微生物生物化学组成变化进行检测足以确定环境条件或其中的改变，只要这种微生物生物化学组成的改变可与特异环境条件相联系。
在优选实施方案中，根据本发明的一种方法包含至少两种环境条件的比较，即标准条件和实验条件，作为比较的结果，微生物生物化学组成的观测变化在性质上基本相关。
在本文中，微生物生物化学组成是指测试结果的集合，所述测试结果是采用本发明方法进行的微生物生物分子检测的结果。特别地，微生物生物化学组成是指多个不同的微生物生物分子。
优选地，对所提及的生物分子的检测是定性的，但也可采用(半)定量检测。
对检测结果的合适集合由微生物的转录表达图谱而形成，所述图谱可通过检测细胞中存在的不同信使RNA分子(转录组(transcriptome))得到。在此情况下，检测用以推断环境条件的多个不同生物分子包括多个不同的RNA分子。可替代的检测结果集合由微生物蛋白表达图谱形成，所述图谱通过检测细胞中存在的不同蛋白质分子(蛋白质组(proteome))而得到。另一可替代方法是检测代谢物的集合(代谢物组(metabolome))。
反映细胞生物学条件或状态的微生物生物化学组成，由此可非常合适地在转录状态基础上进行检测，包括RNA量的确定，在翻译状态基础上进行检测，包括蛋白质量的确定，在活性状态基础上进行检测，包括酶活的确定，或在代谢途径状态基础上进行检测，包括代谢物量的确定，或通过上述组合进行确定。实际上，对许多不同生物分子的检测可提供本发明实施方案中所用的微生物的生物化学组成。
这些生物分子可包括诸如核酸的多核苷酸、(多)肽或蛋白质、多糖、脂、脂多糖及其他细胞大分子。在本文中，也可检测代谢中间物，例如糖、有机酸、醇、脂肪酸、氨基酸、核苷酸等。在根据本发明的实施方案中，核酸非常适合用于检测，例如RNA，包括信使、转移和核糖体RNA或其组合。
在本发明中，非常优选地，微生物的生物化学组成可通过检测细胞转录状态而进行确定，即以信使RNA的形式进行检测。
微生物生物分子可用于形成检测结果集合，所述检测结果一起提供了可用于本发明实施方案的生物化学组成，为了从中推断环境条件，对微生物生物分子的检测优选采用平行生物化学分析方法的形式。
例如，这种检测可实施如下通过分离本发明采用的微生物的细胞生物分子，对其进行整体或单独标记，并对生物分子进行定性或定量检测。在本文中，分离生物分子是指在特异生物化学属性的基础上对成组的相同分子的空间分离，目的为能够检测并且，如果需要的话，对由此分离的相同生物分子进行定量。然而并不总是需要对不同组的相同生物分子进行空间分离。在本文中，标记生物分子是指用特异性标记物对生物分子进行特异或非特异性的标记，目的为检测并且，如果需要的话，对由此标记的生物分子进行定量。
为此目的，可采用一种或多种技术，例如-原位检测技术，例如核酸探针技术和/或免疫学检测技术；这里，通过采用特异或非特异性检测技术，可对不同细胞成分进行各自检测，而不需要这些成分的实际分离，其适用性依赖于待检测的成分；-电泳和/或色谱检测技术；这里，细胞成分可在尺寸、重量、电荷、变性易感性等等的基础上进行分离，分离后可采用特异或非特异性检测技术进行检测，其适用性依赖于待检测的成分；-微阵列和/或生物芯片技术；这里，生物化学成分可在对固定于载体上的结合配体亲和性的基础上进行分离，然后采用特异或非特异检测技术进行检测，其适用性依赖于待检测的成分；与上述技术有关的可采用的合适检测技术有放射自显影检测技术，基于荧光、冷光或磷光的检测技术，及显色检测技术等等。这些技术在生物分子检测领域是众所周知的。
优选地，在本发明中，对微生物转录状态的检测采用的方法包括核酸探针阵列杂交或模仿核酸的探针阵列杂交。
为了确定微生物的转录状态，可从一种或多种微生物细胞中分离RNA，既包括总RNA也包括mRNA。任何不会选择性排斥mRNA分离的RNA分离方法均可用于此RNA的分离(例如，见Ausubel等，1987-1993，Current protocols in Molecular Biology，John & Sons.Inc.New York)。而且，通过采用本领域人员已知方法，例如Chomczynski单步分离方法(1989，美国专利号4,843,155)，可对大量样品进行处理。
转录本(DNA的RNA转录物)代表了差异表达基因的RNA，通过采用本领域人员已知的各种方法可于不同RNA样品中进行鉴定。为此目的，可采用差异筛选(Tedder等，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85208-212)，消减杂交(Hedrick等，1984，Nature，308149-153；Lee等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882825)，差异显示(Liang &Pardee，1992，Science 257967-971；美国专利号5,262,311)，表达序列标志(EST)(Adams等，1991，Science 521656)，基因表达系列分析(SAGE)(Kinzler等，美国专利号5,695,937)或cDNA AFLP(Vos等，1995，Nucleic Acids Res.，23，4407-14)等技术。
这些差异表达基因的鉴定可进一步地用于设计特异性标记物，使对微生物的特异环境条件的确定得以加快。
为了检测微生物内不同的mRNA分子，优选地先将mRNA转化成互补DNA(cDNA)，为此目的可采用一些本领域人员已知的技术，例如采用逆转录酶将mRNA逆转录成cDNA。任选地，通过采用PCR方法(Mullis 1987，美国专利号4,683,195，4,683,202和4,800,159)，任选地以所谓的“嵌套”PCR、“多重”PCR、“不对称”PCR设计，可将RNA到cDNA的转化与cDNA的扩增相结合，或采用连接酶链反应(Barany 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193；欧洲专利申请号320,308)自主序列复制系统(3SR)(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，链置换扩增系统(SDA)(美国专利号5,270,184和5,455,166)，转录扩增系统(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，Qβ复制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology61197)，环形扩增(RCA)或其他用于核酸扩增的方法。在一可替换方法中，RNA也可直接使用或先通过可用于此目的的RNA扩增方法进行扩增，例如“基于核酸序列的扩增(NASBA)”(L.Malek等，1994，Meth.Molec.Biol.28，Ch.36，Isaac PG主编，Humana Press，Inc.，Totowa，N.J.)或使用TMA方法。
采用核酸阵列得到遗传信息的方法是本领域人员已知的(见Chee等，1996，Science 274(5287)610-614等)。
在根据本发明的方法中，优选地采用DNA阵列。这种寡核苷酸阵列含有对遗传标记物具有特异性的序列，这也是本发明的一部分。
根据本发明的寡核苷酸阵列的制作可采用本领域人员已知方法进行实施。用于特异核酸序列检测的固相载体核酸阵列的制造和用途已被频繁描述(美国专利5,571,639；Sapolsky等，1999，Genet.Anal.Biomolecular Eng.14，187-192；Shena等，1995，Science 270，467-470；Sheldon等，1993，Clinical Chem.39，718-719；Fodor等，1991，Science251，767-773)。
本领域技术人员通过自己设计以及来自专业供货商(例如Affymetrix Corp.，Santa Clara，CA，USA用于DNA阵列，及CiphergenBiosystems，Fremont，CA，USA用于蛋白质芯片阵列)的相应的阵列读取设备能够获得阵列。
通过检测一种或多种置于环境条件下的微生物生物化学成分而对此环境条件进行的确定，可作为单一检测得以实施。同样，也可将微生物置于多个环境条件下而对微生物生物化学成分进行检测，在这些条件中某一特异的、确定的环境参数以不同数值进行设置。以这种方式，作为环境参数改变的结果，这些微生物生物化学成分的特异性改变可得以确定。
当检测置于多个已知环境条件下的微生物生物化学成分时，在所述条件中某一特异的、确定的环境参数以不同数值进行设置，有可能获得校准检测，由此可拟合出校准线，其中变量之一由环境参数设置点上的不同数值生成，而另一变量则由微生物变化的生物化学组成生成。
这种检测可采用不同分析技术进行分析，诸如统计学分析，如多变量分析，或其他分析技术，例如现存的技术或可发展用于本发明实施方案的技术。在根据本发明的方法中，优选采用的分析方法有，例如自组织模型，分级群聚，多维缩放，主成分分析，监督式学习法，k最临近算法，支持向量机法，判别分析和偏最小二乘法。作为变化的、限定环境条件结果的微生物生物化学组成的变化，一起描述了此种变化的检测结果的集合分析可产生一个用于环境参数的数值，并由此用于环境条件。
在根据本发明方法进行的未知环境条件的确定中，优选地在未知环境条件确定之前进行前述的校准检测。然后在生物化学成分于校准线所处位置的基础上，置于未知环境条件下的一种或多种微生物的被检测的生物化学组成可给出一个对应那个环境条件的数值。
根据本发明，应用于实施方案的校准线不必一定要视为绝对校准线。虚拟校准线也适合应用于本发明。例如，不同基因表达水平的组合可简单作为结果贮存于数据库中，从而使检测结果与以前的检测结果进行比较。这种虚拟校准线或数据库由此在规模和内容上得以增长，使得结果在越来越多新结果的基础上事实根据逐渐得以增强。
实施例实施例1.通过检测恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)RNA表达确定环境温度在本发明试验方案中，将恶臭假单胞菌S12菌株在不同温度(35℃，39℃和41℃)下进行温度休克。将细胞固定，然后从细胞中分离RNA。被分离的RNA在包被有恶臭假单胞菌S12基因组DNA片段的阵列上进行杂交。数据分析包括归一化和根据主成分分析(PCA)进行的分析。试验按一式二份进行实施，并重复一次。
细菌菌株和生长条件恶臭假单胞菌是影响食品质量的一种重要腐败微生物。从这个观点出发选择了该微生物。为了模拟液体食物的组成，研究在富含有蛋白胨大豆肉汤(TSB，Oxoid)营养物的纯培养基上进行。将恶臭假单胞菌S12涂铺于蛋白胨大豆琼脂(TSA，Oxoid)上，30℃下培养20小时，由此得到纯培养物。然后，菌株30℃下在TSB上生长1天以达到预累积。
温度休克将过夜累积的恶臭假单胞菌S12(35℃)于含50ml新鲜TSB培养基的锥形瓶中稀释20倍，由此得到作为温度休克结果的具有特殊生理状态的恶臭假单胞菌S12培养物。以这种方式，使其在35℃下生长约7小时至OD660大约0.5，产生4个同批的50ml培养物。这通过每30分钟检测其中一个培养物的OD660可得以确认。当OD660为0.5时，其他两个培养物培养温度分别转为39℃和41℃。另外一个培养物仍在35℃下培养。10分钟后，将三个培养物中的细胞进行猝灭，并收获用于RNA分离。
RNA分离将10ml培养物喷雾于-40℃下保存的60％冷冻甲醇水溶液(基本如W.de Koning & K.van Dam 1992.Anal.Bioehem.204118-123所描述)的搅拌溶液中，即可达到培养物中代谢活性的猝灭。然后细胞在-20℃及4500×g下离心10分钟沉积成粒。颗粒进一步在-45℃下处理或-80℃下贮存。RNA基本上按Chin-Yi & Wilkins(1994.Anal.Biochem.2237-12)所述进行分离。0℃下将0.4g锆珠和500μl Trizol(Invitrogen，Gibco BRL)盛入2ml带有螺旋盖的Eppendorf管中。37℃下将细胞颗粒(-45℃)重悬于450μl硼酸盐缓冲液(Chin-Yi & Wilkins，1994)中，然后加入盛有颗粒和Trizol的Eppendorf管中，手摇混合并置于冰块上。在Beadheater(Biospec Products)上加热60秒进行细胞破碎。悬浮物置于冰块上，加入100μl氯仿，室温下进行涡旋然后在12,000×g下离心。用500μl苯酚/氯仿(l/l)萃取水相，然后采用氯仿并进行过渡离心(interim centrifugation)以得到纯水相。于水相中加入0.4个体积的异丙醇和0.4个体积的0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl，混合并于冰块上冷却10分钟。然后，4℃及20,000g下离心以使RNA沉积成粒。颗粒用-20℃的70％乙醇进行洗涤，离心(20,000g，4℃)后真空干燥。颗粒溶于100μl水中。
微阵列构建为使恶臭假单胞菌S12中基因组范围的基因表达分析成为可能，制作了该微生物的基因组库。为此目的，将50μg基因组DNA掺入含20％甘油的TE缓冲液中，于喷雾器中1bar下剪切30秒。通过凝胶电泳评测平均片段尺寸为2-3kb。沉淀后，在T4 DNA聚合酶、Klenow聚合酶和dNTPs存在下，使末端成平端。加热使酶失活，然后用T4多核苷酸激酶对末端进行磷酰化。加热失活，然后将混合物于琼脂糖凝胶上再次进行分离，将2-3kb之间的片段从凝胶上切下，并采用Qiagen凝胶提取试剂盒进行纯化。以此方式得到的片段根据“CloneSmart Blunt cloning kit”方案(Lucigen Corp.)连接入pSMART载体。部分连接混合物转化入大肠杆菌ElectroMax DH10B细胞(Invitrogen)中，并涂铺于氨苄青霉素平板中。采用菌落选择器选择这些菌落，并转入96孔微滴定板中。37℃下过夜生长，加入甘油至最终浓度15％，将甘油菌于-80℃下贮存。
将该库的基因组插入片段于96孔PCR板中用PCR扩增法进行复制。为此目的，将如下组分进行混合5μl 10×SuperTaq缓冲液；5μl 2mM dNTP(Roche Diagnostics)；1μl引物L1；1μl引物R1；37μl MQ水；1μl甘油菌；1.5U SuperTaq聚合酶。引物L1具有如下碱基序列5’-CAG TCC AGT TAC GCT GGA GTC-3’。引物R1具有如下碱基序列5’-CTT TCT GCT ATG GAG GTC AGG TAT G-3’。两种引物5’末端均含有游离NH2基团并后连一个C6接头。扩增采用如下的PCR程序94℃下4分钟；30×(94℃下30秒；50℃下30秒；72℃下3分钟)；72℃下10分钟；4℃。
反应后，将产物转入圆底96孔板并用异丙醇进行沉淀。以此方式纯化的PCR产物转入384孔板中，在该板中，将DNA蒸发至干燥，然后掺入10μl 3×SSC。这些点滴板用以将总量为5500的PCR产物转至微阵列玻片，在玻片中PCR产物以规则有序的模式进行点样。点样后，将这些微阵列进行封闭，然后准备用于进一步的杂交实验。
RNA标记采用12.5μgRNA进行总RNA的荧光标记。于此RNA中加入0.5μlRNA酶抑制剂(RNAsin)，1.25μg随机引物(p(dN)6；Roche Diagnostics)和水至最终体积5μl。混合物于70℃下培养10分钟，20℃下培养10分钟，然后置于冰块上。此后加入下述组分0.5μl RNA酶抑制剂，3μl 5×第一条链缓冲液(SuperScript II；Life Technologies)，1.5μl0.1M DTT，3μl核苷酸混合物(2.5mM的dATP，dCTP，dGTP，1mMdTTP)，1μl Cy5-dUTP或Cy3-dUTP(Amersham Biosciences)和1μlSuperScript II酶(Life Technologies)。混合后，将反应组分于42℃下培养2小时。然后将样品于95℃下加热2分钟，轻微旋转使沉降，加入1.5μl新鲜的2.5M NaOH并在56℃下培养10分钟，即可使RNA降解。加入1.46μl 2.5M醋酸，使反应混合物中和。将反应混合物通过Autoseq G50柱(Amersham Biosciences)根据所附说明书进行纯化。纯化后，将1/10的标记材料另外贮存用于分光光度分析。
预杂交/杂交/洗涤将玻片置于20ml预杂交溶液(1％BSA，5×SSC，0.1％SDS，0.45μm滤膜过滤)的Petri氏培养皿中，42℃下旋转45分钟，以准备用于杂交。将玻片浸入5x的滤菌后milliQ水中。玻片用milliQ纯水再洗涤，然后将玻片浸入5x异丙醇中。最后将玻片用N2枪进行干燥以准备用于杂交。
将一次杂交中进行比较的Cy5-dUTP和Cy3-dUTP标记的样品并入一个杯中。于此杯中加入4μl酵母tRNA(25μg/μl)，然后将混合物蒸发至干燥。干燥后，将颗粒掺入30μl EasyHyb(Roche Diagnostics)中，轻微旋转沉降后进行变性(95℃，1.5min)。使混合物移液至预杂交玻片上，用盖玻片覆盖，置于Coming杂交室中，42℃下过夜培养。
杂交后，将玻片从杂交室中移开，直接置于37℃的20ml 1×SSC/0.2％SDS溶液中。然后将玻片转入新鲜的37℃的20ml 1×SSC/0.2％SDS溶液，而盖玻片仍置于第一洗涤溶液中。激烈搅拌后，将玻片转入37℃的0.5×SSC洗涤溶液，再次充分搅拌。然后将玻片转入0.2×SSC洗涤缓冲液，20℃下于300rpm的旋转平台上混合10分钟。替换洗涤缓冲液后，重复该步骤。然后用N2枪吹走残留液体，使玻片干燥。
扫描与图象分析洗涤后，将玻片贮存于阴暗处或直接用于扫描。分辨率30μm的快速扫描可达到最佳扫描设置选择(ScanArray4000，Perkin Elmer)。Cy5和Cy3信号的最佳扫描产生于10μm分辨率，所得到图象可进行电子保存。对应于玻片的图象用软件包ImaGene(4.2版，BioDiscoveryInc.)打开。对代表玻片上DNA样品点样模式的网格进行安置后点样识别，然后计算每一点样上的信号和背景。得到的数据储存于电子文件中，用于进一步的数据处理。
数据预处理计算M和A值(Roberts等，2000，Science，287，873-880；Dudoit等，2000，Statistics，UC Berkeley，Technical reports #578)后，采用Loess归一法(Cleveland等，1991，Statistics and computing，volume 1(1)pp.47-62)对原始数据进行归一化，对以下点不作计算1)过载点(单通道或双通道信号强度大于64000)；2)背景强于信号的点；3)参考点；4)被图象分析包赋值不同于0的标记的点。
在本实验中，只有对所有实验都具有良好信号的点样才用于计算。Loess归一化后，对单个阵列结果归一化至统一(平方和等于1)。
数据分析为了验证目的，将全部数据组分成训练组(training set)和试验组。然后以平均中心(mean centering)作为选择的比例法，将数据组用主成分分析法(PCA)进行分析。采用其他比例法或采用其他多变量方法，可得到可比较的结果，而不论是否采用簇中存在不同样品的信息。
结果发现恶臭假单胞菌S12在TSB中生长的好坏依赖于培养温度。
图1表示温度对生长曲线的影响。35℃时观察到最佳生长。41℃时，则几乎没有任何生长。为了检测温度应力下的细胞应答，选择了35℃与39℃和41℃下微阵列上基因表达模式的比较。为此目的，温度休克后10分钟将细胞猝灭，收获并进一步处理用于微阵列分析。
图1表示的是记分图，其中数据sPP01-33至sPP01-39代表训练组实验，数据sPp01-03至(包括)sPp01-08代表试验组实验。图中35℃、39℃和41℃三种不同温度下进行的实验显示出明显不同。两个坐标轴代表了主成分，所述主成分一起描述了数据组中总变量的72％。训练组中的实验Train-1至(包括)Train-6用于计算PCA模型。将实验Test-1至(包括)Test-6用于模型中，从图1显示试验数据组如何与已述的采用训练数据组的多变量空间吻合。此处明显看出，试验组的点与训练组的点非常接近。两组中重复实验的差别均小于以其他实验条件(温度差别)处理的样品之间的差别。培养基的加热温度可通过培养基中存在的恶臭假单胞菌RNA表达(生物化学组成)的检测得以确定。
权利要求
1.一种确定环境条件的方法，所述方法通过置于所述环境条件的一种或多种微生物生物化学组成的检测进行确定。
2.一种确定环境条件改变的方法，所述方法通过置于所述环境条件变化中的一种或多种微生物生物化学组成改变的检测进行确定。
3.一种确定环境条件的方法，包含下列步骤检测置于所述环境条件的一种或多种微生物的生物化学组成，将所述生物化学组成与预先确定的所述一种或多种微生物的多个生物化学组成的校准线进行比较，所述校准线通过将一种或多种微生物置于多个环境条件下而得到，以及通过所述生物化学组成在所述校准线上的位置确定所述环境条件。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述一种或多种微生物包含细菌、真菌和/或酵母菌。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物化学组成包含微生物的转录组、蛋白质组和/或代谢物组。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物化学组成是转录组。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述生物化学组成采用微阵列进行确定。
8.一种环境条件的控制或监测方法，包含根据权利要求1-7任一项的方法。
9.一种过程控制方法，包含根据权利要求8的方法。
10.根据权利要求1-9任一项方法的用途，其中食品制备过程、生物膜生成过程、发酵过程和/或生物转化过程的环境条件被确定。
11.根据权利要求1-9任一项方法的用途，用于空气和/或水环境中化学和/或生物物质的确定。
全文摘要
本发明涉及采用微生物确定环境条件，以用于过程控制的目的。本发明采用的原理是，应用外部刺激后，微生物的内在改变都具有其所受外来刺激性质的特性。通过检测这些内在改变，可将微生物用作为特异传感器，以确定环境条件，确定这些环境条件改变的程度，确定刺激的性质和力度，并能检测不同刺激对各种过程的作用，由此控制这些过程。
文档编号C12Q1/68GK1646697SQ03808156
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月8日 优先权日2002年4月17日
发明者罗伊·克里斯蒂安·蒙泰因, 弗兰克·亨利·约翰·许伦 申请人:荷兰应用科学研究组织