专利名称：头花蓼及其提取物和制品微生物活性测定方法
技术领域：
本发明涉及中药领域中的中药生物活性定性定量测定方法，具体而言，本发明涉及一种用微生物检定法测定头花蓼及其提取物生物和制品活性的方法。
微生物检定法是利用药物对微生物体的作用以测定其效价或生物活性的方法，它以药物的药理作用为基础，以微生物统计为工具，运用特定的实验设计、通过供试品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂量关系，来测得供试品的效价。在一定范围内，药物的剂量和药理作用间存在着量效关系，即剂量增大，药理作用会随着增强。将剂量和反应经过适当转换之后，量效关系可以转化成以反应或其函数为纵坐标、剂量或其函数为横坐标的直线关系。
头花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham.ex D.Don)，又名四季红，蓼科蓼属植物，多年生草本，为苗族常用药材。在中国的贵州、云南、广西、四川、西藏、湖北、湖南、江西均有分布，主要生长在山坡、山谷及富含煤层的砂页岩地带。头花蓼主要具有清热解毒，利尿通淋等功效。始载于1963年《广西中药志》第二册，主要用于风湿痛。1977年《中药大辞典》上册收载，民间将其用于治疗痢疾、肾炎、膀胱炎、尿路结石等。《贵州省中药材质量标准》1988年版及《贵州苗族医药研究与开发》均有收载，以其为原料的热淋清颗粒剂于2002年进入中国基本用药目录。头花蓼具有抗炎和抗菌等多种活性，其含有的有效成分也非常复杂，已经发现头花蓼中含有黄酮类和没食子酸等有效成分，但是，由于含有的成分复杂或者是协同作用因素，头花蓼及其提取物的活性与其中的黄酮类或没食子酸类有效成分没有明确的量效关系，因而，通过测定头花蓼及其提取物中的某个有效成分含量的结果很难反映被测定物的生物活性，因此，人们客观上需要一种直接、快速地测定头花蓼及其提取物的生物活性的方法，本发明正是为解决该问题而提出的。
因此，本发明的目的是提供一种测定头花蓼及其提取物生物活性的方法。
本发明中所述的头花蓼及其提取物和制品，包括头花蓼原药和用水、75％乙醇和95％乙醇和二氧化碳超临界条件分别对头花蓼全草、地上部分、叶、种子、茎和根部分别进行了提取得到的提取物及其制品，本发明的目的是提供一种方法对头花蓼及其提取物和制品进行微生物活性测定，以便对它们的效价进行评价。
本发明涉及的头花蓼及其提取物和制品可以通过下列方法得到的实施例1制备头花蓼地上部分水提取物(编号w-2-1)取头花蓼地上部分220kg，洗净，加入7倍量水，加热煮沸1.5小时，过滤，药渣中加入6倍量水，煮沸1.0小时，过滤。合并滤液，浓缩至相对密度为1.2(20℃)得到浸膏，喷雾干燥得到浸膏粉23kg，收率是10.45％。
采用分光光度计法测定w-2-1中的总黄酮含量，将本发明的方法制备得到的w-2-1提取物和辅料均匀混和，制粒，干燥，即得到新方法制备的热淋清颗粒。
实施例2制备头花蓼全草水提取物(喷雾干燥)(编号w-1-2)根据与实施例1相同的方法，用头花蓼全草代替头花蓼地上部分进行提取。
取w-1-2浸膏粉按实施例1相同的方法，制得样品(w-1-12)。
实施例3制备头花蓼全草水提取物(减压干燥)(编号w-1-3)根据与实施例2相同的方法，将干燥方法改为减压干燥。
实施例4制备头花蓼根95％乙醇提取物(编号w-1-4)取头花蓼根10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7.5倍量的95％乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入7.5倍量95％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物0.215kg。
实施例5制备头花蓼茎95％乙醇提取物(编号w-1-5)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼茎进行提取。
实施例6制备头花蓼叶95％乙醇提取物(编号w-1-6)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼叶进行提取。
实施例7制备头花蓼种子95％乙醇提取物(编号w-1-7)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼种子进行提取。
实施例8制备头花蓼鲜品95％乙醇提粉(编号w-1-8)根据与实施例4相同的方法，用头花蓼鲜品进行提取。
实施例9制备头花蓼鲜品水提粉(编号W-1-9)根据与实施例3相同的方法，用头花蓼鲜品进行提取。
实施例10制备头花蓼全草75％乙醇提取物(编号W-1-10)取头花蓼全草10kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入7-8倍量75％乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入5倍量75％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。合并两次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物0.694kg。
实施例11制备头花蓼全草水煎醇沉溶液粉(W-1-14a)和头花蓼全草水煎醇沉沉淀粉(W-1-14b)取头花蓼全草10.60kg，洗净，加入350kg水，加热煮沸1.5小时，转移上清液，残渣中加入150kg水，煮沸1.0小时。合并煎煮液，过滤浓缩至相对密度为1.04(24℃)得浸膏16.1kg。加入95％乙醇调至含醇量为60％，静至24小时，分取溶液。向沉淀加入95％乙醇调至含醇量为60％，静至24小时，分取溶液，合并两次溶液，挥去乙醇，80℃减压干燥得头花蓼全草水煎醇沉溶液粉(W-1-14a)0.755kg；沉淀于80℃减压干燥得头花蓼全草水煎醇沉沉淀粉(W-1-14b)0.465kg。
实施例12制备头花蓼原药粉二氧化碳超临界萃取提取物(编号W-1-15a)取头花蓼原药粉10kg，洗净，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开CO2气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏0.135kg。
实施例13制备头花蓼药渣二氧化碳超临界萃取提取物(编号W-1-15b)取头花蓼药渣10kg，洗净，投入超临界萃取釜中，对萃取釜和两个解析釜加热，对贮罐进行冷却，当温度达到预定的温度时，打开CO2气瓶送气，当压力达到预定压力时，开始循环萃取，调节流量，并加入夹带剂，恒温恒压萃取2小时。将得到的液体减压浓缩得到浸膏0.119kg。
实施例14制备头花蓼地上部分70％乙醇提取物(编号W-2-2)
取头花蓼地上部分30kg，洗净，置不锈钢浓缩罐内，加入8-9倍量70％乙醇，回流提取1.5小时，过滤。药渣加入4-5倍量70％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。药渣再加入4-5倍量70％乙醇，回流提取1.0小时，过滤。合并三次滤液，浓缩得浸膏，减压干燥得到提取物3.75kg。
具体而言，本发明利用微生物检定方法测定头花蓼提取物的生物活性。
附图1头花蓼浸膏粉(浓度1.0、6.25、12.5mg生药/ml)对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。(相应的抑菌圈分别为8、17、21.0mm)图2 头花蓼浸膏粉浓度(mg生药/ml)与抑菌圈直径(mm)对枯草芽孢杆菌的线性关系图实施例1寻找适合定量检测头花蓼提取物的生物活性的微生物检定菌利用平皿扩散法测定头花蓼提取物的生物效价设计6个浓度剂量，分别为1.725、3.5、5、7、10、12.5mg生药/ml，分别加入含有一定菌量的平皿培养基表面上的牛津小杯内，经适当温度培养一定时间后，观察牛津小杯周围出现的抑菌圈的清晰度及抑菌圈大小，同时设立已知标准品(与待检测品属同一类性质)，在一定条件下比较标准品与被检品两者对接种细菌的抑菌圈的大小，求得被检品的效价含量(或其生药含量)。
步骤如下样品配制精确称取一定量的编号为W-1-2头花蓼提取物粉未，用灭菌水溶解，配制成20mg生药/ml的溶液，3000转/分钟离心10分钟，取上清液用pH7.8磷酸缓冲液稀释至1.725、3.5、5、7、10、12.5mg生药/ml备用。
检定菌包括金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]或ATCC25923短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]藤黄微球菌[CMCC(B)28001]大肠埃希菌[CMCC(B)44103]枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]菌悬液的制备参阅中华人民共和国药典2000版附录XIA。
药液配制精确称取头花蓼浸膏粉(编号W-1-2)(按生药计算)用灭菌水溶解，配制成20mg生药/ml的溶液，3000转/分钟离心10分钟，取上清液用pH7.8磷酸缓冲液稀释至所需浓度(即，倍比稀释至12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，……0.003mg/ml)。
试验方法1、制备双碟取直径90mm，高16-17mm的平底双碟，分别加入已融化的培养基(按表1)20ml，使在碟底均匀分布，放置平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48-50℃(芽孢杆菌可至60℃)，加入试验菌悬液适量(0.5％)，使能得到清晰的抑菌圈，摇匀，吸取5ml加入上述底层的双碟内均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每个双碟中以等距离均匀安置无菌不锈钢牛津小管(内径6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外径7.8mm±0.1mm)4个，用陶瓦园盖复盖备用。
2、检定法于上述牛津小杯内分别加入不同浓度的待检测药液，置37℃培养18-20小时，牛津小杯周围产生清晰，边缘清楚的抑菌圈的细菌可用于做为头花蓼浸膏的检测菌。
试验结果头花蓼浸膏粉(编号W-1-2)及没食子酸对检定菌的抑菌作用见表1和图1。
表1头花蓼浸膏粉(编号W-1-2)对所检定菌的抑制圈(mm) 由表1可知，头花蓼浸膏粉及没食子酸仅对枯草芽孢杆菌敏感，当头花蓼浸膏粉浓度为12.5、6.25和1.0mg生药/ml时，抑菌圈清晰，抑菌圈直径分别为21.0、17、8.0mm；没食子酸在浓度为5、1.0、0.1mg/ml时，其抑菌圈分别是25、17、0mm。在该浓度下，二者对所试藤黄微球菌、大肠埃希菌无抑菌圈，对短小芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌仅呈现8mm的抑菌圈，且抑菌圈周边模糊不清。表明枯草芽孢杆菌(标准菌株〔CMCC(B)63501〕或ATCC提供菌株)可用作头花蓼活性测定的生物检定菌。(见表2，图1)实施例2用枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501作检定菌，考察头花蓼浸膏粉对枯草芽孢杆菌的线性关系以及日内、日间的精密度。
样品配制方法精密称取头花蓼浸膏粉(编号W-1-2)适量，用灭菌注射用水溶解后，离心，3000转/分钟，10分钟。再用pH7.8磷酸缓冲液稀释成1.725、3.5、5、7、10、12.5mg生药/ml的溶液，按中国药典2000版二部附录XI A抗生素微生物检定法分别测定其抑菌圈的大小，求出头花蓼浸膏粉浓度与抑菌圈直径的回归方程以及相应的系数，并绘制其直角坐标图。
按下列回归方程进行线性回归，绘制浓度与抑菌圈直径的线性关系图。
Y(抑菌圈)＝a+bx(浓度)(a为回归直线在Y轴上的截距，b是回归直线的斜率)试验结果试验结果见表2和图2。
由表2可见头花蓼浸膏粉在1.725～12.5mg生药/ml浓度范围内，浓度与其抑菌圈具有较好的线性关系，回归方程为Y(抑菌圈)＝11.8273+0.8875X(浓度)，相关系数r＝0.9945。
根据回归方程即可在直角坐标系中，绘制出标准曲线(见图2)。有了标准曲线后，可用于检测未知生物效价(或含量)的头花蓼提取物和不同工艺、不同药用部位提取物的较确切的生物效价(或含量)。即在测得头花蓼提取物的抑菌圈后，可在标准曲线中查找到相应的药物含量。
没食子酸浓度为0.1、1和5.0mg/ml时对于枯草芽孢杆菌也呈现抑菌圈，抑菌圈直径分别为0、17、25mm。在无头花蓼标准品时，表明没食子酸可用于头花蓼提取物的检测参照物。
表2头花蓼浸膏粉(编号W-1-2)对枯草芽孢杆菌的线性关系
以上试验表明本发明用抗生素微生物检测方法，可定性定量地测定出头花蓼及其不同药用部位和不同提取工艺得到的提取物和制品的生物活性效价含量。
实施例3用枯草芽孢杆菌作为检定菌，考察头花蓼浸膏粉在一定浓度范围内抑菌作用的精密度。
样品配制精密称取头花蓼浸膏粉(编号W-1-2)，配制成1.56、3.12、6.25、12.5(mg生药/ml)四个浓度(配制方法同实施例1和2)。测定方法测定方法同实施例1和2。每个浓度平行测3次(即每个浓度测三个双碟中的抑菌圈大小，计算其平均值)。分别于日内不同时间(上、下午)；日间不同时间(不同天)测定其抑菌圈大小，并进行统计学分析日内、日间有无显著性差异。以考察方法的精密度。
试验结果试验结果见表3。
表3 头花蓼浸膏粉微生物检测方法精密度考察结果日内 日内头花蓼浓度(mg生检定菌抑菌1圈(mm)P值 抑菌圈(mm)P值药/ml)上午 下午 第1次 第2次 第3次枯草芽孢杆菌 12.521.51 22.30 22.51 22.63 23.1022.28 21.50523.28 23.23 23.6221.60 21.20 22.80 22.20 22.7021.80±0.42 21.52±0.68 ＞0.05 22.86±0.39 22.68±0.52 23.14±0.46＞0.056.2519.76 18.92 19.76 19.33 20.0418.88 19.02 19.20 18.60 19.3519.25 19.12 20.00 19.56 18.6019.30±0.44 19.02±0.10 ＞0.05 19.65±0.41 19.16±0.50 19.33±0.72＞0.0053.1215.65 16.01 15.98 15.92 16.4016.20 15.98 15.20 15.55 16.0315.21 16.12 16.24 15.85 15.7015.69±0.50 16.04±0.07 ＞0.05 15.81±0.54 15.77±0.20 16.04±0.35＞0.051.5613.0 12.40 12.23 12.92 13.0012.85 12.30 11.95 13.02 12.9812.15 11.90 12.60 12.60 13.1012.67±0.45 12.20±0.26 ＞0.05 12.26±0.33 12.85±0.22 13.03±0.06＞0.05
由表3可见，本方法检测头花蓼浸膏粉对枯草芽孢杆菌日内、日间的抑菌作用均无显著性差异(P＞0.05)，说明本检测方法基本可靠。
试验表明本发明使用枯草芽孢杆菌作检定菌，根据微生物检定法，检测头花蓼及其不同药用部位和不同提取工艺得到的提取物和制品的生物活性(有效成分含量)是可行的。在确定其生物活性成分含量后，可采用抗菌药物体内外抗菌试验方法，对不同提取工艺样品的药用质量和药效作出评判。
实施例4以头花蓼浸膏粉(W-1-2)作为标准品，以枯草芽孢杆菌作为检测菌，制备W-1-2的标准曲线。
检测菌枯草芽孢杆菌(Bactillus Stilis)63501培养基蛋白胨5g，磷酸二氢甲3g，磷酸氢二甲7g，牛肉浸出粉3g，枸橼酸钠10g，水1000ml，加热溶解后调pH至6.5-6.6，加1.4％的琼脂粉，115℃灭菌30分钟。
磷酸缓冲液pH7.8，磷酸氢二钾5.59g，磷酸二氢钾0.41g，蒸馏水1000ml样品(W-1-2)制备精密称取适量，用pH7.8缓冲液稀释成10mg/ml溶液，用超声波振荡15分钟，然后用离心机3000转/秒离心10分钟，取其上清夜放置于冰箱备用，使用时用pH7.8缓冲液稀释至所需浓度。
采用1∶0.7的剂量比值，将头花蓼浸膏粉(W-1-2)精密配置成以下浓度100000，70000，49000，34300，24010，16807mg/ml。
实验结果结果见表4。
表4头花蓼浸膏粉(W-1-2)对枯草芽孢杆菌的抑菌作用结果
将以上实验结果带入回归方程，得截距a＝-0.4844，n＝6(即共测6个浓度剂量)。直线斜率b＝12.55，相关系数r＝0.9969表明头花蓼浸膏粉(W-1-2)在100mg/ml-16.807mg/ml(剂间距比为1∶0.7)范围内呈直线相关关系。结果表明采用微生物法检测头花蓼不同工艺及制剂的生药含量是可行的。
实施例5头花蓼浸膏粉(W-1-2)作标准品，采用二剂量法测定有糖型头花蓼浸膏粉生药含量。
样品配制分别精密称取头花蓼浸膏粉(W-1-2)和有糖型头花蓼浸膏粉，配制成100mg生药/ml和50mg生药/ml浓度。
中心浓度100mg/50mg。
实验操作1、倾倒平板下层10ml，上层5ml2、标准的称量生药含量为8.72mg/mg
将50ml容量瓶中放入30ml PH7.8磷酸缓冲液。在超声波中振荡15-30分钟，然后再用PH7.8磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，在离心机中3000转/分，10分钟，取出上清液，稀释至100mg/ml和50mg/ml备用。
3、检测样品(有糖型头花蓼浸膏粉颗粒剂)配制精密称取颗粒剂适量(1981.2mg生药/mg)。放入50ml容量瓶中，先加30ml PH7.8磷酸缓冲液。在超声波中振荡15-30分钟，然后再用PH7.8磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，在离心机中3000转/分，10分钟，取出上清液，稀释至100mg/ml和50mg/ml备用。
实验结果结果见表5。
表5有糖型头花蓼浸膏粉(W-1-2)对枯草芽孢杆菌CMCC63501的抑菌作用 根据下列公式计算其生药含量生药含量＝V/n×100％×估计含量[V＝(样品高剂量抑菌圈-标准品高剂量抑菌圈)+(样品低剂量抑菌圈-标准品低剂量抑菌圈)]。
得V＝-7+(-5)＝-12[W＝(标准品高剂量抑菌圈-标准品低剂量抑菌圈)+(样品高剂量抑菌圈-样品低剂量抑菌圈)]W＝24+22＝46效价含量＝V/W×100％×估计含量有糖型头花蓼效价83.46％×1981.2＝1654ug/mg即有糖型头花蓼浸膏生药含量为1654ug/mg实施例6采用剂量法用W-1-2做标准品检测无糖型头花蓼浸膏的生药含量。
样品配制分别精密称取头花蓼浸膏粉(W-1-2)和无糖型头花蓼浸膏粉，配制成100mg生药/ml和50mg生药/ml浓度，测定方法同实施例4和5。
中心浓度100mg/50mg。
实验操作
1、倾倒平板下层10ml，上层5ml2、标准的称量生药含量为8.72mg/mg 将50ml容量瓶中放入30ml PH7.8磷酸缓冲液。在超声波中振荡15-30分钟，然后再用PH7.8磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，在离心机中3000转/分，10分钟，取出上清液，稀释至100mg/ml和50mg/ml备用。
3、检测样品(无糖型头花蓼浸膏粉颗粒剂)配制精密称取颗粒剂适量(1981.2mg生药/mg)。放入50ml容量瓶中，先加30ml PH7.8磷酸缓冲液。在超声波中振荡15-30分钟，然后再用PH7.8磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀，在离心机中3000转/分，10分钟，取出上清液，稀释至100mg/ml和50mg/ml备用。
实验结果结果见表6。
表6有糖型头花蓼浸膏对枯草芽孢杆菌CMCC63501的抑菌作用 无糖型头花蓼浸膏粉生药含量计算公式同实施例5得V＝5+8.5＝-13.5
W＝25+22.5＝47.5121.8％×2001.3＝2437u/mg即无糖型头花蓼浸膏生药含量为2437ug/mg
权利要求
1.一种测定头花蓼及其提取物和制品生物活性的方法，包括如下步骤a.样品配制精确称取一定量的头花蓼或其提取物和其制品，用灭菌水溶解，配制成20mg/ml的溶液，离心3000转/分钟，10分钟，取上清液用pH7.8磷酸缓冲液稀释至1.725、3.5、5、7、10、12.5mg/ml备用；b.测定枯草芽孢杆菌，制备含适当菌量的双碟，测出不同浓度头花蓼样品在检定菌中的抑菌圈直径，根据以下回归方程进行线性回归，由测量得到的抑菌圈直径Y计算出检测样品中的头花蓼生药含量Y(抑菌圈)＝11.8273+0.8875X(浓度)
2.根据权利要求1的方法，其中受试枯草芽孢杆菌是标准菌株CMCC(B)63501或ATCC提供菌株。
全文摘要
本发明涉及一种测定头花蓼及其提取物和制品生物活性的方法，包括步骤a.样品配制精确称取一定量的头花蓼或其提取物和其制品，用灭菌水溶解，配制成一定浓度的溶液，离心，取上清液用pH7.8磷酸缓冲液稀释至所需浓度备用；b.测定制备含枯草芽孢杆菌适当菌量的双碟，测出不同浓度头花蓼样品在检定菌中的抑菌圈直径，根据回归方程进行线性回归，由测量得到的抑菌圈直径Y计算出检测样品中的头花蓼生药含量。
文档编号C12Q1/18GK1570134SQ0314638
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月11日 优先权日2003年7月11日
发明者梁斌, 王子厚, 李孟林, 张丽艳, 庄镇华, 荣祖元, 张淑华, 叶晓鸣 申请人:贵州威门药业股份有限公司