专利名称：游动放线菌阿卡布糖生物合成基因及其分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自放线菌，主要是游动放线菌属SE 50/110及其突变株的阿卡布糖(acarbose)生物合成基因；涉及放线菌属阿卡布糖生物合成基因的分离方法，即利用来源于已知的dTDP-葡萄糖脱水酶高度保守的蛋白区域的基因探针，寻找基因acbA(编码dTDP-葡萄糖合酶)、acbB(编码dTDP-葡萄糖脱水酶)和acbC(编码一种环化酶，此环化酶与AroB即细菌3-脱氢奎尼酸合酶部分相同)，或者一个或多个来自游动放线菌属的阿卡布糖生物合成基因。本发明还涉及阿卡布糖生物合成基因的应用。
早期的专利申请(例如DE 2 064 092、DE 2 209 8334)涉及到以下发现，即许多放线菌，特别是游动放线菌科，产生糖苷水解酶(优选消化道的碳水化合物水解酶)的寡糖样抑制剂。所描述的此组抑制剂中，效力最强的抑制剂是化合物阿卡布糖，即O-4，6-二脱氧-4-[[1S-(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羟基-3-(羟甲基)-2-环己烯-1-基]-氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-吡喃葡萄糖(DE2347782)。
在人类医学上，阿卡布糖用于糖尿病的控制。游动放线菌属SE50(CBS No.961.70)及该菌株的天然变异株SE 50/110(CBS614.71)[DE22 09 834]，以及它们的选择株和突变株，产生次级代谢物阿卡布糖。原始分离物来自肯尼亚的Ruiru附近。在上述专利申请，例如上述德国专利申请的实施例1-4中，描述了此类型蔗糖酶抑制剂的分离。从阿卡布糖的结构上预计，阿卡布糖分子的脱氧葡萄糖部分的生成与各种抗生素的6-脱氧糖残基的生物合成相一致。所述抗生素的例子有氨基糖苷类，如链霉素、春日霉素；大环内酯类，如红霉素、泰乐霉素；多烯类，如两性霉素A和B、制霉菌素；蒽环型药，如道诺霉素；糖肽类，如万古霉素。
有可能利用基因工程，如利用与所需DNA序列特异结合的基因探针，直接从基因组中分离某些基因。这样，有可能从大量未知序列中“钓”出要分离的基因。
在放线菌，特别是链霉菌中，进而得知在迄今所研究的次级代谢物生产菌中，生物合成基因并排地、成簇地排列在染色体上，而较少在质粒上[Martin，J.F.，J.Ind.Microbiol.9，73-90(1992)；Chater，K.F.，Ciba Found.Symp.，171(Secondary MetabolitesTheir Function andEvolution)144-62(1992)]。因此有可能通过用基因探针来“钓”，分离相邻的、至今未知的生物合成基因，从而能够阐明这些未知的生物合成基因在所需的生物合成过程中的重要性。
分子生物学技术相应的应用迄今还未能在游动放线菌科获得成功，也未期望能在这种遗传学上未鉴定的微生物中获得成功。
今人惊讶的是，现已发现一来源于已知dTDP-葡萄糖脱水酶的高度保守蛋白质区域的基因探针，适用于在游动放线菌属中寻找acbA基因(编码dTDP-葡萄糖合酶)和acbB基因(编码dTDP-葡萄糖脱水酶)。更今人惊讶的是，发现了以acbC形式存在的另一基因，此基因与acbB基因相邻，编码一种环化酶(与AroB即细菌3-脱氢奎尼酸合酶部分相同)，因此与不饱和环多醇(Valienamines)的生物合成有关。
本发明涉及acbB的完整DNA序列和acbA及acbC的部分DNA序列。
acbB的完整氨基酸序列和acbA及acbC的部分氨基酸序列。
从放线菌，特别是从游动放线菌属中分离次级代谢产物生物合成基因的方法，其特征是将来源于已知dTDP-葡萄糖脱水酶的高度保守蛋白质区域的基因探针用于寻找acbA基因(编码dTDP-葡萄糖合酶)、acbB基因(编码dTDP-葡萄糖脱水酶)和acbC基因(编码一种环化酶，此环化酶与AroB即细菌3-脱氢奎尼酸合酶部分相同)，或者来源于游动放线菌属的一个或更多个阿卡布糖生物合成基因。
放线菌中与阿卡布糖相关的天然物质(如有效霉素、Oligostatins(trestatins)、脂解素)的生物合成基因的分离方法。
通过以下途径提高游动放线菌属的阿卡布糖合成产量，即增加基因剂量或使用更有效的启动子，或者通过基因操作(如调节基因蛋白表达或调节基因识别位点的基因操作)来改变调节控制。
在一些限制阿卡布糖合成的生物合成步骤(瓶颈酶)中进行蛋白质工程，或通过蛋白质工程防止额外组份的生成，从而增加阿卡布糖合成产量。通过消除不需要的额外组份的生物合成途径或不需要的酶降解反应，将游动放线菌属的产物范围限制在所需的主要产物。
为了在游动放线菌属中提高阿卡布糖生产能力，改变调控，因此改变营养需要。
在异源宿主菌株(如变铅青链霉菌和其它链霉菌、快速生长细菌如大肠杆菌、枯草杆菌或谷氨酸棒杆菌、或酵母)中表达，以便通过改进空间-时间产率来增加产量；建立简化的纯化方法；达到产物范围的特殊限制。
利用阿卡布糖生物合成基因，由合成的或微生物生产的前体开始，进行阿卡布糖或此类物质的体外合成。
下面详细描述本发明。
所有的基因工程方法，除非另有说明，一律按照J.Sambrook et al.图2是用作为用于分离阿卡布糖生物合成基因的基因探针(acb探针)的、含有已知的dTDP-葡萄糖脱水酶序列的质粒pAS1的示意图。
图3是含有与acb探针杂交的游动放线菌属DNA的2.2kb BamHI片段的质粒pAS2的示意图。
图4是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的1.3kb Pst I/Bam HI片段的质粒pAS 2/1的示意图。
图5是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的1.6kb Sph I/Bam HI片段的质粒pAS 2/2的示意图。
图6是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的0.9kb Pst I片段的质粒pAS 2/3的示意图。
图7是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的0.6kb SphI片段的质粒pAS 2/4的示意图。
图8是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的0.8kb Hinc II/Hind III片段的质粒pAS 2/5的示意图。
图9是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的0.65kb Xho I/Sal I片段的质粒pAS 2/6的示意图。
图10是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的0.5kb Xho I/Sal I片段的质粒pAS 2/7的示意图。
图11是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2/3的0.28kb Hinc II片段的质粒pAS 2/8的示意图。
图12是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2/1的0.7kb Xho I/Bcl I片段的质粒pAS 2/9的示意图。
图13是为2.2kb Bam HI片段的DNA序列分析所构建的、含有来自pAS2的0.3kb Sst I/Bcl I片段的质粒pAS 2/10的示意图。
图14是2.2kb Bam HI片段的DNA序列以及基因acbA、B、C的氨基酸序列的示意图。
下面详细描述本发明。
所有的基因工程方法，除非另有说明，一律按照J.Sambrook et al.(Molecular CloningA Laboratory manual；2nd edition，1989；Cold SpringHarbor Laboratory Press，N.Y.，U.S A.)进行操作。
使用寡核苷酸引物(见表1)，用PCR(聚合酶链反应)技术从游动放线菌属SE 50/110中获得筛选用的基因探针，寡核苷酸引物来源于已知dTDP-葡萄糖脱水酶的高度保守蛋白质区域。将扩增后的游动放线菌属SE 50/110 DNA片段克隆于pUC18中，转化到大肠杆菌DH5α(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)中。产生的质粒(pAS1，见图2)用煮沸法或碱溶解法从大肠杆菌中分离(Sambrook et al.，1989)。
来自大肠杆菌DH5α的质粒pAS1用限制酶EcoR I和HindIII水解。分离0.3lkb的EcoR I/Hind III片段，并通过所谓的缺口翻译法用32P标记的脱氧核苷酸标记。这个放谢性标记的片段作为基因探针用于分离阿卡布糖生物合成基因，该片段在下文中称为acb探针。
阿卡布糖生物合成基因按以下步骤分离。来自游动放线菌属的染色体DNA用不同的限制酶(SstI、Bgl II和BamH I)切割，经过凝胶层析，用acb探针通过Southern杂交研究同源基因。与基因探针杂交的DNA限制片段的大小如下10kb(Sst I)、9-10kb(Bgl II)和2.2kb(BamH I)。将与acb探针杂交的不同的DNA片段从凝胶上洗脱下来，连接到载体pUC18上，克隆于大肠杆菌DH5α中。
优选对2.2kb BamH I DNA片段进行克隆及序列分析。通过并集物杂交(pool hybridization)识别含有与acb探针杂交的游动放线菌属DNA的大肠杆菌DH5α克隆(见实施例7)。从阳性克隆中分离质粒DNA，用Southem杂交证实并集物杂交的结果。所得的质粒(见图3)用不同的限制性核酸内切酶进行切割。产生的DNA片段亚克隆到大肠杆菌DH5α的pUC18中，进行再连接和序列分析。
为了确定游动放线菌属的2.2kb BamH I片段的DNA序列，构建下列质粒(实施例7)，分析插入DNA的序列(见图1、14)pAS 2/1＝来自pAS2的1.3kb Pst I/BamH I片段(图4)pAS 2/2＝来自pAS2的1.6kb Sph I/BamH I片段(图5)pAS 2/3＝来自pAS2的0.9kb Pst I/片段(图6)pAS 2/4＝来自pAS2的0.6kb Sph I/片段(图7)pAS2/5＝来自pAS2/1的0.8kb Hinc II/Hind III片段(图8)pAS 2/6＝来自pAS2的0.65kb Xho I/Sal I片段(图9)pAS 2/7＝来自pAS2的0.5kb Xho I/Sal I片段(图1 0)pAS 2/8＝来自pAS2/3的0.28kb Hinc II片段(图11)pAS 2/9＝来自pAS2/1的0.7kbXho I/Bcl I片段(图12)pAS 2/10＝来自pAS2的0.3kbSst I/Bcl I片段(图13)用F.Sanger等人(1977)的方法或由其衍生出的方法进行DNA序列分析。将自读序列分析试剂盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)连同自动激光荧光(ALF)DNA序列分析仪(Pharmacia，Freiburg，Germany)一起使用。购买合适的荧光素标记的pUC反向序列分析引物及序列分析引物(Pharmacia，Freiburg，Germany，见表1)。PCR引物引物名称 序列AS2 5’GCCGCCGAATCCCATGTGGAC3’AS5 5’CCCGTAGTTGTTGGAGCAGCGGGT3’序列分析反应引物引物名称序列通用引物5’GTAAAACGACGGCCAGT3’反向引物5’GAAACAGCTATGACCATG3’
实施例实施例1大肠杆菌菌株的培养，质粒DNA的制备和分离将大肠杆菌DH5α在LB培养基中在37℃下培养。在选择压(氨苄青霉素，100μg/ml)下保持携有质粒的细菌。培养在回旋式摇床上以270转/分进行。至少培养16小时的混合物称为过夜培养物(OC)。
1.5ml在选择压下培养的过夜培养物细胞用于制备质粒DNA。用碱性SDS溶解法分离质粒(Birnboim & Doly，1979)。
按照制造商的说明(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)，用专一性限制性核酸内切酶对载体DNA进行特异性水解。用5U特定的限制性核酸内切酶来限制10μg质粒DNA，37℃下保温2小时。为了确保完全水解，再次加入等量的限制性核酸内切酶，再保温至少1小时。
切割后的DNA，根据DNA片段的大小，在0.5-1.2％水平琼脂糖凝胶上电泳。为进行洗脱，用无菌解剖刀切下含有DNA片段的凝胶块并称重。用JETsorb试剂盒按说明(Genomed，BadOeynhausen，Germany)从琼脂糖上洗脱出DNA片段。
实施例2游动放线菌属的培养，染色体DNA的制备、切割和凝胶电泳将游动放线菌属SE 50/110在TSB培养基中，在回旋式摇床上，于30℃下培养3天。预培养(5ml)在培养管内于240转/分下进行。在500ml带隔板培养瓶中以100转/分进行主培养(50ml)。培养后，离心沉降细胞，用TE缓冲液洗涤两次。
用1.5-2mg细胞(鲜重)以苯酚/氯仿抽提法制备完整的DNA(D.A.Hopwood et al.，1985)。
20μg染色体DNA用10U适当的限制酶(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)在相应的缓冲液中于37℃水解2小时。为了确保完全水解，再加入等量的限制性核酸内切酶，重新保温至少1小时。
切割后的DNA在0.7％水平琼脂糖凝胶上电泳。
再次用JETsorb试剂盒洗脱出DNA片段(见实施例1)。
实施例3acb基因探针的制备按实施例1由pAS1制备的片段按制造商的说明，用GibcoBRL，Eggenstein，Germanv生产的缺口翻译系统进行放射性标记。用0.5-1.0μg的DNA片段和[α-32P]dCTP(3000 Ci/mmol；Amersham，Braunschweig，Germany)。然后将混合物煮沸10分钟(变性)，立即加入杂交溶液中(见实施例4)。
实施例4将DNA转移至膜上，DNA杂交(Southem杂交)及放射自显影用Southern转移法将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜上(Southern，E.M.，1975)。按实施例2获得的琼脂糖凝胶在0.25M HCl中摇动20分钟。将凝胶置于3层Whatman 3MM吸水纸(Whatman，maidstone，England)上，将一张HybondTM-N+膜(Amersham，Braunshweig，Germany)放在凝胶上，去掉气泡。将几层吸水纸置于其上。将一个重约1kg的重物置于这叠滤纸上。通过将DNA吸入0.4M NaOH中转移DNA。转移至少12小时后，尼龙滤膜用2xSSC冲洗5分钟并风干。
将尼龙滤膜置于50-100ml预杂交溶液中，于68℃下在水浴中摇动至少2小时。在此期间，至少换两次溶液。杂交在杂交盒中进行至少12小时。使用15ml含acb探针(见实施例3)的杂交溶液。
然后，尼龙滤膜用6×后洗液和1×后洗液各洗15分钟。当尼龙滤膜还潮湿时，用胶纸盖住尼龙滤膜。在带有增感屏的暗盒中，用Hyperfilm MP(Amersham，Braunshweig，Germany)于-80℃下进行放射自显影至少16小时。
实施例5从游动放线菌属完整的DNA中分离和克隆BamH I片段来自游动放线菌属SE50/110的染色体DNA用BamH I完全水解，经琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖上洗脱出长度为1.5-3kb的DNA片段。载体质粒pUC18由大肠杆菌DH5α制备，载体质粒用BamH I水解，并按制造商说明用碱性磷酸酶(Boehringer，Mannheim，Germany)处理。取0.01-0.1μg DNA，按片段与载体之比为3∶1，混合物体积为20μl进行连接。使用1U T4 DNA连接酶及合适的缓冲液(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。用完全连接混合物转化大肠杆菌DH5α转化感受态细胞(如Hanahan 1983所述)。将氨苄青霉素抗性转化株转移到LB-Amp选择平板上(100μg/ml)。
实施例6鉴别含有dTDP-D-葡萄糖合酶基因的克隆研究青霉素抗性转化株中是否含有dTDP-D-葡萄糖合酶基因。每种情况下都是从这些克隆中取10个克隆在选择平板上划线，将它们培养过夜，用3ml LB培养基从平板上洗下。从20个这样的10克隆并集物中分离质粒DNA(如Bimboim & Doly，1979所述)。用限制性核酸内切酶EcoR I和Hind III水解这20个不同的质粒制备物，以从多聚接头上去掉克隆的BamH I片段。然后将限制混合物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。用Southem转移法将DNA从琼脂糖凝胶上转移至尼龙滤膜上(见实施例4)。再次与acb探针杂交(见实施例4)。这些并集物中的一个与acb探针有阳性反应，将这个并集物分成10个单独的克隆。同样分离出这些克隆的质粒，并进行上述操作。杂交质粒被称为pAS2，它含有一个2.2kb的BamHI片段。
实施例7质粒pAS2的亚克隆由质粒pAS2开始，产生几个亚克隆，以便阐明双链DNA的序列(图1；图4-13)。pAS2/1和pAS2/3质粒pAS2用Pst 1水解，在1％琼脂糖凝胶上分离限制混合物。从琼脂糖凝胶上洗脱出水解产生的0.9kb Pst I片段和带有余下的1.3kb Pst I/BamH I片段的质粒条带(JETsorb试剂盒；Genomed，Bad Oeynhausen，Germany)。
重新连接带有1.3kb Pst I/BamH I片段的质粒，得到亚克隆pAS 2/1。将0.9kb Pst I片段克隆到载体pUC18(用Pst I水解)中，产生亚克隆pAS 2/3。pAS 2/2和pAS 2/4质粒pAS2用Sph I水解。重新连接带有1.6kb Sph I/BamH I片段的质粒，得到亚克隆pAS 2/2。将0.6kb Sph I片段克隆到pUC18(用Sph I水解)中，产生亚克隆pAS 2/4。pAS 2/5
质粒pAS 2/1用Hinc II/Hind III水解。将产生的0.8kb片段克隆到pUC18(用Hind III/Hinc II水解)中，产生亚克隆pAS 2/5。pAS 2/6质粒pAS2用Xho I/Sal I水解。将产生的0.65kb片段克隆到pUC18(用Sal I水解)中，产生亚克隆pAS 2/6。pAS 2/7质粒pAS2用Xho I/Sal I水解。将产生的0.5kb片段克隆到pUC18(用Sal I水解)中，产生亚克隆pAS 2/7。pAS 2/8质粒pAS 2/3用Hinc II水解。将产生的0.3kb片段克隆到pUC18(用Hinc II水解)中，产生亚克隆pAS 2/8。pAS 2/9质粒pAS 2/1用Xho I/Bcl I水解。将产生的0.7kb片段克隆到pUC18(用Sal I/BamH I水解)中，产生亚克隆pAS 2/9。PAS 2/10质粒pAS2用Sst I/Bcl I水解。将产生的0.3kb片段克隆到pUC18(用Sst I/BamH I水解)中，产生亚克隆pAS 2/10。
实施例8游动放线菌属2.2kb BamH I片段的DNA序列分析对实施例7描述的质粒进行序列分析。来自一个制备物(见实施例1)的6-8μg质粒DNA用于序列分析反应。用自读序列分析试剂盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)进行序列分析反应。在这里使用对双链DNA进行序列分析的标准操作程序。为能使用A.L.F.(自动激光荧光(DNA)序列分析仪)来分析核苷酸序列，将荧光素标记的通用序列引物和反向序列引物用作序列分析反应的起始分子(见表1)。为制备凝胶，将8ml Hydro Link Long Ranger(Serva，Heidelberg，Germany)，33.6g尿素、8ml10×TBE缓冲液，加水至80ml混合，过滤灭菌，抽气1分钟。加入350μl 10％(W/V)过硫酸铵和40μl N，N，N’，N’-四甲基乙二胺引发聚合反应。将溶液倒入凝胶模(50×50×0.05cm)中。在38w，45℃恒温下电泳。用1×TBE缓冲液作电泳缓冲液。在一台联机计算机(Compaq 386/20e)上将所测得的荧光信号转化成DNA序列。这台联机计算机也用来控制电泳仪(Program A.L.F.Manger 2.5；Pharmacia)。缓冲液与溶液培养细菌用的培养基LB培养基胰蛋白胨10gNaCl10g酵母抽提物 5g水 加至1000ml用4M NaOH调pH至7.5TSB培养基胰蛋白胨大豆肉汤(Oxoid) 30g水 加至1000mlTE缓冲液(pH8.0)Tris-HCl10mMNa2EDTA1mM质粒DNA的标准制备(Birnboim & Doly 1979方法的修改方法)混合物I50mM葡萄糖50mM Tris-HCl(pH8.0)
10mM EDTA(pH 8.0)5mg/ml溶菌酶混合物II200mM NaOH1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)混合物III3M醋酸钾1.8M甲酸盐DNA-DNA杂交20XSSC3M NaCl0.3M柠檬酸钠pH7.2预杂交溶液6XSSC0.01M磷酸钠缓冲液pH6.81mM EDTA0.5％SDS0.1％脱脂奶粉杂交溶液在标记反应后，将acb探针加入到15ml预杂交溶液中。6X后洗液6XSSC0.5％SDSDNA序列分析TBE缓冲液(pH8.0)
1M Tris碱0.83M硼酸10mM EDTA参考文献1.Bimboim H.C.&Doly J.(1979)A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinantplasmid DNANucleic Acids Res.，7，1513-15232.Hanahan D.(1983)Studies on transformation of Escherichia coli with plasmidsJ.Mol.Biol.166，557-5803.HopWood DA.et al.，(1985)Genetic manipulation of Streptomyces；A laboratory manual；The John Innes Foundation，Norwich，England4.Sanger F.；Nicklen S.；Coulson A.R.(1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitorsProc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-54675.Southem E.M.，(1975)Detection of specific sequences among DNA Fragmentsseparated by gel electrophoresisJ.Mol.Biol.，98，503-521
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称BayerAG(B)街道B ayerwerk(C)城市Leverkusen(E)国家德国(F)邮政编码51368(G)电话0214-3061455(H)传真021 4-303482(ii)发明名称阿卡布糖基因(iii)序列数；1(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30B(EPA)(2)1号序列信息(i)序列特征(A)长度2219个碱基对(B)类型核苷酸(C)股数双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型基因组DNA(iii)假设无(iv)反义无(vi)原始来源(A)生物体游动放线菌属SE 50/110(xi)序列描述1号序列GGATCCGGGA GTACTTCACC CATCACGGCA TCGATCATTC GATCCTGGTG ATGCGGGTGG 60GCGAGACGGT CAAGGACTTC GACACGGCGG GCCGCATCGT CGCCGCGATG GACGCCTTCG 120GACTGGCCCG CCGCCGGGAG CCGATGATCG TCGTCGGTGG TGGGGTGCTG ATGGACGTGG 180CCGGTCTGGT GGCCAGCCTC TACCGGGCGC GGCACGCCGT TCTGCGGGTG CCGACGACAC 240TGGTCGGACT GATCGACGCG GTGTCGCGCG AAGACCGGGT CAACTTCAAC GGCCACAAGG 300AACCGGCTGG GTACGTACGC CCGGCTGATC TGACCCTGCT GGACCGCCGC TTCCTGGCCA 360CCCTGGACCG GCGCCACCTC AGCAACGGGC TCGCCGAGAT GCTCAAGATC GCGCTGATCA 420AGGATGCCGA GCTGTTCCAG CTGCTGGAGC GGCACGGGCG GGTCCTGATC GAGGAACGGT 480TCCAGGGCGT ACCGGAACCG GTGACCGGGC CGCCGTCCGG GCCCTGCGCG CGCCACCCAT 540GGCATGCTGG AGGAACTCGG CCCAATCTGT GGGAGAGCCG GCTGGAACGC AGTGTCGACT 600ACGGGCACAC GTTCAGCCCG ACCATCGAGA TGCGCGCGCT GCCGGCTCTG CTGCACGGCG 660AGGCCGTGTG TGTGGACATG GCGCTGACCA CGGTGCTGGC GTACCGGCGG GGTCTGCTCG 720ACGTCGCGCA GCGGGACCGG ATCTTCGCGG TGATGACCGC CCTGGGCCTG CCGACCGGCA 780TCCGCCTGCT CACGCCGGAG GTGCTGGAGG CGGCGTTGCA GGACACCGTC CGGCACCGGG 840ACGGGTGGCA GCGGCTGCCA CTGCCGGTGG GGATCGGGGG TGTCACGTTC GTCAACGACG 900TGACGGCCGC CGAGCTGCAG CCGCCGCGCT GATGCAGCAC CGGCTCGCCG AGGACGCCCT 960GCTGCTGCGC GCCCTAGCTC GGGCCGCGGA CGCCGATCGC CGGAAGCGAC CGGCGTCCGT 1020CCGCCCACCG GTTGCCGTCA GTCCACCAGG AACGGTTGGC GCGATACCAC GCGACCGTTT 1080CCGCGATGCC GTCGGTGAAA TCGACCCGCG GCCGGTAACC GAGTTCCCCG GCGATTTTCG 1140AATAGTCGAG AGAATAGCGC CGGTCGTGAC CTTTGCGATC GGTCACGAAA GATATGCGCG 1200AACGCCGGGC GCCGCACGCC TCGAGGAGGA TCTCGGTCAA TTCGAGATTC GTCGCCTCCC 1260ACCCACCGCC GATGTGATAG ACCTCGCCTG CCCGGCCGGC ACCCAGGGCC AGGGCGAGAC 1320CGCGGCAATG GTCGCTGACG TGGAGCCAGT CGCGGATGTT GCGGCCGTCG CCGTAGACCG 1380GTACGTCGAG CCCGTCGAGC AGCCTGGTGA CGAACAGCGG AATCATTTTC TCCGGGAATT 1440GCCGGGGCCC GTAGTTGTTG GAGCAGCGGG TCACCACGAC GTCCATCCCG TGCGTCTGGT 1500GGTAGGCCAG AGCGAGGAGG TCGGACCCGG CTTTGCTCGC GGCGTACGGC GAGTTGGGCG 1560CCAGCGGATG GCCCTCGGCC CACGAGCCGG TGTCGATCGA CCCGTACACC TCGTCGGTGG 1620AAACATGCAG GAAGCGGCCG ATATGGTGGC GTAGCGCGGC GTCCAGTAGC ACCTGAGTGC 1680CGACCAGGTT GCTGGCCACG AAGGGGCCGG AGGCGACCAC CGAGCGGTCG ACGTGGGTCT 1740CGGCGGCGAA GTGCGCCACG GTGTCGTGCC GCGCCATCAG CCCCTCGATT AGACCTTCGT 1800CACAGATGTC GCCCCGAACG AAGCTGAAAC GAGGGTCCGC CGACGCTTCG GCGAGATTTC 1860TGAGATTGCC TCCGTAACCC AGTTTGTCGA CGACCGTAAC CTGCGTCACG GGTTGTGGTG 1920TGGCAATGTC GCCACTGATC AGGGAAGTTA CAAAATGGGA CCCGATAAAG CCGGCTCCGC 1980CGGTGACCAA GATTTTCATC GCCGGGATTG TAGCAATGCC GCCAATGGGT GCCCGATGTT 2040CGGCCGAGCC ATTTACGGGG CTTGCTGATA TGGTCGGTCA CGTGCGCGGA ATATTGCTGG 2100CCGGGGGAAC CGGCTCACGG CTTCGACCGG TGACCTGGGC GGTTTCCAAA CAACTGATGC 2160CGGTCTATGA CAAACCGATG ATCTACTATC CGCTGGCCAC GCTCGTCAGC TGCGGATCC 2219
权利要求
1.具有1号序列的DNA序列。
2.权利要求1的DNA，其特征在于它含有编码dTDP-葡萄糖合酶的完整acbA DNA序列和acbB(编码dTDP-葡萄糖脱水酶)和acbC(编码一种环化酶)的部分DNA序列。
3.权利要求2的DNA的功能变异体。
4.含有权利要求1-3的DNA的载体。
5.用权利要求4的载体转化的微生物。
6.具有1号序列的氨基酸序列。
7.权利要求6的氨基酸序列的功能变异体和突变体。
8.含有权利要求6和7的氨基酸序列或其部分的蛋白质。
9.分离一个或多个来自放线菌的阿卡布糖生物合成基因的方法，其特征在于用来源于已知dTDP-葡萄糖脱水酶的高度保守蛋白质区域的寡核苷酸引物作为基因探针，与阿卡布糖生物合成基因杂交。
10.制备阿卡布糖的方法，其特征在于培养权利要求5的微生物，从液体培养基中分离阿卡布糖。
11.按照权利要求2获得的基因在鉴定其他阿卡布糖结构基因和调节基因中的应用。
12.按照权利要求2和11获得的基因在通过增加基因剂量，或使用更有效的启动子或通过基因操作(如对调节基因蛋白表达或调节基因识别位点的基因操作)改变调控作用来提高阿卡布糖合成产量的应用。
13.按权利要求2和11获得的基因在分离与阿卡布糖相关的天然物质的生物合成基因中的应用。
14.按权利要求2和11获得的基因在通过蛋白质工程修饰生物合成酶中的应用。
15.按权利要求2和11获得的基因在消除不需要的阿卡布糖额外组份生物合成途径中的应用。
16.按权利要求2和11获得的基因在消除不需要的阿卡布糖酶降解反应中的应用。
17.按权利要求2和11获得的基因在获得生物合成酶中的应用及在由合成的或由微生物制备的前体合成阿卡布糖或此类化合物中的应用。
全文摘要
本发明涉及放线菌，主要是游动放线菌属SE50/110及其突变株的阿卡布糖生物合成基因；涉及放线菌阿卡布糖生物合成基因的分离方法，即利用来源于已知dTDP-葡萄糖脱水酶的高度保守蛋白质区域的基因探针，寻找acbA基因(编码dTDP-葡萄糖合酶)、acbB基因(编码dTDP-葡萄糖脱水酶)和acbC基因(编码一种环化酶，此环化酶与AroB即细菌-3脱氢奎尼酸合酶部分相同)或者一个或多个游动放线菌属阿卡布糖生物合成基因；还涉及阿卡布糖生物合成基因的应用。
文档编号C12N15/60GK1144271SQ96102718
公开日1997年3月5日 申请日期1996年3月1日 优先权日1995年3月2日
发明者A·克吕格, W·皮帕斯堡, J·迪斯勒, A·施特拉曼 申请人:拜尔公司