专利名称：重组救活可线性化家蚕核多角体病毒基因工程载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术基因工程领域中的昆虫病毒载体，具体涉及重组救活可线性化家蚕核多角体病毒基因工程载体。
重组昆虫病毒表达系统，主要有两个一为以苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)为载体，秋粘虫Sf细胞或昆虫为宿主；一为以家蚕核多角体病毒(BmNPV)为载体，家蚕细胞或家蚕虫体为宿主。表达系统包括启动子、转移载体、NPV病毒载体和宿主细胞或虫体。两个表达系统都以各自病毒载体的多角体蛋白强启动子(Ph)为外源基因表达的调控元件。重组昆虫病毒表达系统操作的技术难度主要在于带有外源基因重组病毒的筛选。早期用显微镜技术按病毒感染细胞成空斑的形态来筛选极为繁琐，除需要熟练技术外，还费时，周期很长。Kitts.P.A.等在AcNPV多角体蛋白基因(Ph)旁侧引入两个Bsu36I限制性酶切位点，其中一个在AcNPV复制必需基因ORF1629上，由此构建成修饰型AcNPV病毒，即BacPAK6病毒[参见Kitts PA等，Biotech 1993；14810-817]。BacPAK6 DNA用Bsu36I切割线性化后，基因组不能复制，病毒失活，而只有通过与含必需基因ORF1629同源片段的转移载体pBacPAK质粒同源重组才能救活病毒。这一重组救活过程使存活的病毒90％以上为重组病毒，从而大大简化了筛选操作。且BacPAK6中的β-半乳糖苷酶基因LacZ也可作报导基因，使筛选更方便。但，在具有重要应用价值的重组家蚕BmNPV表达系统中，至今尚无类似AcNPV的BacPAK6修饰型病毒载体，而且AcNPV不能感染家蚕细胞。构建重组救活可线性化家蚕核多角体病毒基因工程载体很有必要性。
本发明的目的是提供重组救活可线性化家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，1997年10月31日，保藏登记编号为CGMCC 0328)。它是将商品化的AcNPV BacPAK6修饰病毒基因组DNA与中国镇江株野生型BmNPV ZJ8基因组DNA共导入家蚕细胞，在家蚕细胞内通过两种病毒基因组同源重组，将BacPAK6中含Bsu36I酶切位点、ORF1629及LacZ基因的片段替代BmNPV基因组相应部分，构建而成重组救活可线性化家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体。此病毒载体是以家蚕细胞和家蚕虫体为宿主，可用于BmNPV重组基因工程表达系统，大大提高重组病毒筛选率，并简化筛选操作。
本发明提供在家蚕细胞内同源重组获得杂合核多角体病毒载体的构建方法。将野生型BmNPV和修饰型AcNPV病毒BacPAK6这两种宿主不同的病毒用脂质体法导入家蚕细胞，经细胞内同源重组，将BacPAK6中所含的Bsu36I酶切位点、复制必需基因ORF1629及LacZ报导基因的片段替换BmNPV基因组DNA的相应部分。从家蚕细胞增殖出的病毒中，用β半乳糖苷酶底物X-gal筛选出表达LacZ基因，而呈蓝色空斑的重组病毒。此病毒即为可线性化修饰型杂合型家蚕核多角体病毒BmBacPAK。构建过程见图1。
本发明提供BmBacPAK病毒基因工程表达载体的结构和酶切图谱。BmBacPAK是一个杂合病毒，其基因组主体部分为BmNPV ZJ8野生型株的基因组，而含有的多角体蛋白基因(Ph)启动子、LacZ报导基因、部分ORF1629复制必需基因、Ph5’，3’旁侧序列的基因片段及其所含的相应的Bsu36I酶切位点均来自AcNPVBacPAK6。图2表示了这个杂合病毒的结构模式。用Bsu36I酶切修饰型家蚕病毒BmBacPAK DNA，与BacPAK6 DNA相比较(图3)，结果显示二者的Bsu36I酶切图谱相同。已知BmNPV ZJ8基因组中无Bsu36I位点，说明修饰型家蚕病毒BmBacPAK含有来自BacPAK6基因组的AcNPV核多角体蛋白基因启动子控制下的LacZ基因及两测序列，并包括两个人工引进的Bsu36I酶切位点。Bsu36I酶切位点可用于线性化病毒DNA。另外，用限制性内切酶EcoRI，HindIII，PstI酶切BmBacPAK和BacPAK6 DNA，发现修饰型家蚕病毒BmBacPAK的某些片段与野生型BmNPV ZJ8相同，而另一些酶切片段则与BacPAK6相同，说明BmBacPAK确由野生型BmNPV DNA与BacPAK6 DNA同源重组而产生(图4)。
重组昆虫病毒表达系统是一个真核表达系统。该系统用作外源基因表达时，具有表达效率高，表达后加工等优点。BmNPV表达系统不仅可以以家蚕细胞为宿主，而且可利用个体较大的家蚕虫体和家蚕蛹为宿主生产外源基因蛋白。外源基因在虫体或蛹中的表达比细胞中表达量更高，且表达后加工更完善。本发明构建的BmBacPAK重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒基因工程载体仍含有多角体蛋白基因强启动子，可作为外源基因表达的调控元件，有效表达外源基因。报道基因荧光素酶(Luc)基因，以及人促红细胞生成素(EPO)基因都利用BmBacPAK病毒为载体，在家蚕细胞、家蚕虫体和家蚕蛹中获得高效表达。
本发明BmBacPAK病毒基因工程载体可用于报导基因萤火虫荧光素酶(Luc)基因的表达。由于BmBacPAK中Ph基因两侧顺序被AcNPV BacPAK6相应部分取代，其中含Bsu36I酶切位点的ORF1629必需基因可被Bsu36I切割破坏，故BmBacPAK基因组可被Bsu36I酶切线性化而失活，只有通过与含完整ORF1629基因的转移载体质粒DNA同源重组才能救活。由此设计的外源基因导入BmBacPAK重组救活工作原理可以大大提高含外源基因重组病毒的筛选效率。用这一病毒载体构建含外源基因的重组病毒的工作原理见图5。以BmBacPAK病毒为载体，以昆虫荧光素酶基因(Luc)作报导基因构建的重组病毒感染家蚕细胞可以获得较高的表达。将荧光素酶基因克隆在质粒pBacPAK1(Clontech公司)的BamHI位点，构建成转移载体pBacPAK-Luc(图6)。转移载体pBacPAK-Luc DNA与线性化的BmBacPAK病毒DNA共转染家蚕细胞。培养4-5天后作病毒空斑分析，重组率几近100％。Luc在BmN细胞中的表达量参照荧光素酶标准曲线计算为45μg标准酶/106细胞(图7)。单斑纯化后的Luc基因表达水平与上述直接用共转染液病毒表达的Luc水平基本相同，显示了重组救活可线性化修饰型家蚕病毒BmBacPAK极高的应用价值。
本发明BmBacPAK病毒基因工程载体可用于人促红细胞生成素(EPO)基因在家蚕虫体和家蚕蛹中的高效表达。BmBacPAK重组救活杂合型可线性化修饰病毒是以家蚕细胞，家蚕幼虫和家蚕蛹为宿主的基因工程表达载体。通过与含外源基因的转移载体共转染家蚕细胞，在细胞内两种DNA同源重组后构成重组病毒。重组的BmBacPAK携带的外源基因在Ph启动子调控下，可以得到高效表达，生产有经济效益的重组蛋白或多肽。因此BmBacPAK病毒是一个有实用价值的基因工程载体。以BmBacPAk为病毒载体，将人工合成的人EPO基因(cDNA序列见图8)构建在载体pBacPAK8中的BamHI位点，获得转移载体pBacPAK-EPO(图9)。转移载体与线性化修饰型家蚕病毒BmBacPAK共转染家蚕细胞，经细胞内同源重组，获得重组病毒。用EPO检测药盒(Boehringer Mannheim公司)多抗-EPO-单抗夹心ELISA测定表达量为13600U/ml。重组病毒注射五龄起眠家蚕和结茧4天的嫩蛹，感染4-5天后，测定EPO表达量为6.2×104U/ml蚕血淋巴，7.4×104U/ml蛹血淋巴(表1)。
表1，重组病毒BmBacPAK-EPO感染家蚕虫体和家蚕蛹，人EPO基因的表达活性测定(单位U/ml)感染天数03 456.5幼虫034000 6280046000/蛹 020500 470007400033400综上，本发明优点如下提供不同宿主的两个核多角体病毒BmNPV和AcNPV的基因组共转染家蚕细胞，在细胞内获得以BmNPV为母体，含AcNPV部分序列的杂合病毒及其构建方法；BmBacPAK修饰型病毒可以线性化，重组救活方式大大提高了含外源基因的重组BmNPV基因工程病毒载体筛选效率，简化了操作；BmBacPAK以Ph基因强启动子为调控外源基因表达的元件，外源基因在家蚕细胞，家蚕虫体和家蚕蛹中得到很高的表达，具有实用意义；相比以往用BmNPV或AcNPV表达系统必须各自选用自身的转移载体，BmBacPAK病毒载体可利用任何BmNPV和AcNPV表达系统中的转移载体来构建重组病毒。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明范围。
图1，重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒BmBacPAK的构建过程。
图2，BmBacPAK杂合病毒的结构模式。
图3，BmBacPAK DNA与BacPAK6 DNA的Bsu36I的酶切图谱比较1，λ/HindIII，2，BmBacPAK/Bsu36I，3，BacPAK6/Bsu36I，4，BmBacPAK不酶切，5，BacPAK6不酶切。
图4，BmBacPAK DNA与BacPAK6 DNA的其它酶切图谱比较1，AcNPV/EcoRI，2，BmNPV/EcoRI，3，λ/HindIII，4，BacPAK6/EcoRI，5，BmBacPAK/EcoRI，6，BacPAK6/HindIII，7，BmBacPAK/HindIII，8，BacPAK6/PstI，9，BmBacPAK/PstI，10，λ/HindIII。
图5，可线性化病毒重组救活工作原理。
图6，重组病毒BmBacPAK-Luc的构建。
图7，重组病毒BmBacPAK-Luc感染家蚕细胞后，Luc基因的表达时相曲线。
图8，人工合成的人促红细胞生成素(EPO)基因cDNA序列。
图9，转移载体pBacPAK-EPO的构建。
实施例1重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒BmBacPAK的构建野生型BmNPV ZJ8 DNA 0.2μg与修饰型AcNPV病毒BacPAK6(Clontech公司)DNA 0.2μg加水至50μl，取Lipofectin(GIBCO BRL公司)溶液34μl加水至50μl，两者混合后室温放置20分钟。将混合液滴加入经无血清培基TC100(GIBICO BRL公司)洗过的家蚕细胞BmN(1.5×106)。27℃培养4天后，转染上清作病毒空斑分析。取不同稀释度的转染液加入含105细胞的30mm培皿中，27℃保温1小时，吸去转染液，加含1％低熔点琼脂糖凝胶，以及0.2mg/ml X-gal的培养基2ml，27℃培养4天。由于野生型BmNPV ZJ8不含β-半乳糖苷酶LacZ基因，并在感染细胞内出现多角体，而BacPAK6病毒不能在家蚕细胞中复制，只有二者重组的杂合型重组修饰病毒才能在家蚕细胞中复制，且带有LacZ基因。在培养基中添加终浓度为0.2mg/ml β-半乳糖苷酶底物X-gal，可筛选重组病毒。挑取呈蓝色但不含多角体的空斑，即为野生型BmNPV ZJ8与BacPAK6同源重组的重组可线性化修饰型家蚕核多角体病毒BmBacPAK(图1)。
实施例2家蚕修饰型病毒BmBacPAK DNA和AcNPV修饰型病毒BacPAK6 DNA的酶切图谱分析a，病毒DNA的抽提经病毒感染的昆虫细胞培养液24000rpm超离心1小时，收集沉淀，作10％和60％蔗糖非梯度24000rpm超离心1小时。收集在两层蔗糖溶液界面处形成的病毒粒子。病毒悬浮后，加100μl 20％Sarkosyl溶液，60℃，30分钟，裂解病毒。然后作50％CsCl(W/W)/EB(10mg/ml)密度梯度超离心，46000rpm，20℃，19小时，以纯化病毒DNA。DNA经透析后4℃保存。
b，酶切图谱比较在总反应体积20μl中，加入病毒DNA 2μg，10x酶切缓冲液2μl，合适的限制性内切酶10单位，37℃1-2小时，作0.6％琼脂糖凝胶电泳，凝胶在0.5mg/ml溴己啶(EB)中染色5-10分钟，紫外灯下观察并照相记录，结果见图3和图4。
实施例3以修饰型家蚕病毒BmBacPAK为载体，在家蚕细胞中表达荧光素酶(Luc)基因a，转移载体pBacPAK-Luc的构建将含昆虫荧光素酶基因的质粒pUC-Luc用BamHI酶切完全。走1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在EB存在下，在紫外灯下切割出1.8kb含荧光素酶基因片段。65℃保温凝胶10分钟，苯酚抽提，乙醇沉淀DNA。载体pBacPAK1(Clontech公司)质粒DNA用BamHI酶切完全。在10μl总反应体积中，加入pBacPAK DNA和Luc基因片段DNA共约0.5μg，5x连接酶缓冲液2μl，T4DNA连接酶1-2单位，14℃保温过夜。连接样品转化大肠杆菌，碱法抽提质粒DNA。用EcoRV酶切鉴定，筛选出含Luc基因的转移载体pBacPAK-Luc.(图6)。用T7 DNA测序试剂盒(Amershan公司)，双脱氧法进行DNA序列分析。结果表明Luc基因起始码ATG与启动子之间间隔48bp，且连接处序列正确。
b，重组病毒BmBacPAK-Luc的分离上述重组救活修饰型家蚕病毒BmBacPAKDNA用Bsu36I酶切线性化，与转移载体pBacPAK-Luc DNA共转染家蚕BmN细胞。27℃培养4-5天后，共转染上清用作病毒空斑分析。在0.2mg/ml X-gal存在下，病毒空斑均呈多角体阴性，LacZ基因阴性，无蓝色空斑出现。以感染指数MOI＝20接种细胞后作空斑分析，亦无蓝色空斑出现。说明重组救活后，获得重组病毒比例几近100％。
c，Luc基因在家蚕细胞中的表达时相和表达水平共转染病毒以MOI＝1感染105家蚕细胞(BmN)。分别在感染后48、60、72、84、96小时收集细胞，悬浮于25mM苷氨酰苷氨酸(Glycylglycine)pH7.8，150mM NaCl溶液中，加TritonX-100至终浓度1％，裂解细胞。12000rpm离心5分钟。上清置于荧光光度计配套比色杯，加入荧光素酶检测液(3.3mM ATP，6.6mM MgCl2，100mM D-荧光素Lucuferin)立即进行荧光光度检测。结果显示感染后72小时，Luc基因在家蚕细胞中表达最高。参照标准曲线计算出表达量达45μg/106细胞(图7)。
实施例4以修饰型重组救活可线性化家蚕病毒BmBacPAK为载体，在家蚕虫体及家蚕蛹中表达人促红细胞生成素(EPO)基因
a，转移载体pBacPAK-EPO的构建和重组病毒的获得由中科院上海生物工程基地化学合成的人EPO基因cDNA(图8)用XbaI和BamHI双酶切，经大片段DNA聚合酶(Klenow)补平后，用T4DNA连接酶连接在质粒pBacPAK8(Clontech公司)DNA的BamHI补平位点上。使EPO基因在多角体蛋白基因启动子控制之下，获得转移载体pBacPAK-EPO(图9)。转移载体DNA2μg与病毒DNA1μg混合后，加水至50μl。另取Lipofectin溶液15μl，加水至50μl。两者混合后，室温放置15分钟，然后滴加入含单层家蚕细胞(BmN)的平皿中，27℃培养6小时，换3ml含10％胎牛血清的培养基TC100(GIBICO BRL公司)，继续培养5天。收集上清病毒用于感染。
b，EPO基因在家蚕虫体和家蚕蛹中的表达家蚕用人工饲料饲养。5龄起眠蚕或结茧第4天蛹经表皮消毒，每头蚕穿刺接种1×105pfu重组病毒。发病后收集血淋巴。液氮和37℃反复冻融三次，离心去除细胞碎片和脂质，上清用于EPO检测。按Boehringer Mannheim公司产品说明书描述的方法，根据多抗-EPO-单抗夹心ELISA测定EPO单位，结果见表1。
权利要求
1.一种保藏登记号为CGMCC 0328的重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体，其特征在于它是一个含苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)基因组部分片段的杂合型家蚕病毒，是一个双链DNA病毒，长度为130kb，其基因组主体部分为野生型家蚕核多角体病毒基因组，还含有来自于AcNPV的BacPAK6修饰型病毒载体的多角体蛋白基因(Ph)启动子；LacZ报导基因；部分ORF1629复制必需基因；Ph5’，3’旁侧序列基因片段及人工引入的两个Bsu36I酶切位点。
2.如权利要求1所述家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体的构建方法，其特征在于它是通过野生型家蚕核多角体病毒与修饰型苜宿银纹夜蛾核多角体病毒(BacPAK6)经全基因组共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内同源重组而获得。
3.如权利要求1所述家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体，其特征在于所述野生型家蚕核多角体病毒是中国镇江株(BmNPV ZJ8)病毒。
4.如权利要求1所述家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体的应用，其特征在于它含有多角体蛋白基因启动子，可应用于外源基因在BmNPV表达系统中的高效表达。
5.如权利要求4所述的家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体的应用，其特征在于它可用于报道基因萤火虫荧光素酶基因在BmNPV表达系统中的表达。
6.如权利要求4所述家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体的应用，其特征在于它可用于人促红细胞生成素基因在BmNPV表达系统中的表达。
7.如权利要求1所述家蚕核多角体病毒BmBacPAK基因工程载体，其特征在于它是以家蚕细胞，家蚕虫体和家蚕蛹为宿主的基因工程表达载体。
全文摘要
通过野生型家蚕核多角体病毒中国镇江株BmNPV ZJ8基因组与修饰型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcNPV BacPAK6基因组在家蚕细胞内同源重组,构建成重组救活可线性化修饰型家蚕核多角体病毒基因工程载体BmBacPAK。BmBacPAK含有LacZ基因和两个Bsu36I酶切位点用于线性化。BmBacPAK用作外源基因表达重组救活病毒筛出率几近100%。BmBacPAK用作载体表达人EPO基因,感染家蚕虫体和家蚕蛹时,EPO表达量达7.4×10
文档编号C12N15/86GK1242428SQ9811096
公开日2000年1月26日 申请日期1998年7月17日 优先权日1998年7月17日
发明者吴祥甫, 杨冠珍, 胡建新 申请人:中国科学院上海生物化学研究所