专利名称：一种固定化酶载体的制作方法
技术领域：
本发明是一种固定化酶载体。
目前，固定化酶载体主要有无机材料载体和有机材料载体两大类，前者有硅胶、活性氧化铝等，后者多数是人工合成的聚合物。
无机材料载体具有机械性能好、来源丰富和成本低等优点，但酶是靠吸附作用固定在载体上的，由于这种分子间作用力较弱，酶容易流失，缩短了固定化酶的使用时间。于是，日本专利昭63-252544和欧洲专利0109300文献以及刘立建等刊登在《离子交换与吸附》[11(6):541,1995]期刊上的“多孔硅球的活化和硅烷化”文章中，公开了一种将3-氨基丙基硅胶或玻璃微球通过双功能团交联剂或缩合剂来固定酶，使酶与载体之间形成共价键的技术。这虽然能提高固定化酶的稳定性，但因在固定化反应中使用交联剂或缩合剂，会使酶的高级结构发生变化，降低了酶的活性或使酶失活，致使固定化反应中，反应液中剩余的酶活力小，因而难以再利用，这不利于工业化生产。
有机材料载体的缺点在于其机械性能较差，比重小，有可压缩性。因而，用在某些反应器上时对液体的流动产生较大的阻力，并且成本比无机材料高。但是，由于此载体能使酶保持较高的活性，固定化酶的使用寿命长，所以，现在用于工业化生产的固定化酶大都采用聚合物作载体。
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供集无机材料载体和有机材料载体的优点于一身的一种固定化酶载体，以利于固定化酶用于工业化生产。
本发明的目的是这样实现的其由无机和有机材料载体构成复合型载体，包括聚丁二酰亚胺和3-氨基丙基硅胶或3-氨基丙基玻璃微球，二者以共价键相连。
制备上述复合型载体的方法是将聚丁二酰亚胺溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，加入3-氨基丙基硅胶或3-氨基内基玻璃微球，按其氨基的摩尔数与聚丁二酰亚胺中的丁二酰亚胺结构单元的摩尔数之比1∶5～8投料，然后从反应混合物中收集生成物，此生成物即为复合型载体。
本发明所述的固定化酶载体(以下简称新载体)与现有的载体相比有以下主要优点其一用新载体制得的固定化酶，能保持较高的活力。
其二用新载体固定酶的过程中，酶损耗小。因为，在固定化反应中，酶直接与新载体上的活性结构单元反应，反应液中剩余的酶能循环使用，同时避免了载体的预活化这一繁琐的步骤。
其三聚丁二酰亚胺能回收循环使用。因为，它在N,N′-二甲基甲酰胺中(以下简称DMF)很稳定，在水中的溶解度很小，将它的DMF溶液倒入水中便能进行回收，操作简便。
其四新载体制备方便，成本低且机械性能好。
总之，新载体实用性强，利于工业化生产，是一种集无机和有机材料载体的优点于一身的载体。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。
图1是制备本发明所述的新载体的示意图。
图2是用图1新载体固定酶的示意图。
图3是反应温度与脂肪酶及固定化脂肪酶相对活力的关系示意图。
图4是缓冲溶液的pH值与脂肪酶及固定化脂肪酶的相对活力的关系示意图。
图5是固定化脂肪酶在磷酸缓冲溶液中贮存的时间与其活力的关系示意图。
本发明所述载体是复合型载体，由有机和无机材料载体构成，包括聚丁二酰亚胺和3-氨基丙基硅胶或3-氨基丙基玻璃微球，二者以共价键相连。其制备方法是先将聚丁二酰亚胺溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，再加入3-氨基丙基硅胶或3-氨基丙基玻璃微球，按3-氨基丙基硅胶或3-氨基丙基玻璃微球中氨基的摩尔数与聚丁二酰亚胺中的丁二酰亚胺结构单元的摩尔数之比(以下简称摩尔数之比)1∶5～8投料，然后从反应混合物中收集生成物，此生成物是本发明所述的固定化酶载体，本申请人命名其为聚丁二酰亚胺-硅胶或聚丁二酰亚胺-玻璃微球(见图1)，简称新载体。图1中序号1、2、3分别是3-氨基丙基硅胶或3-氨基丙基玻璃微球、聚丁二酰亚胺、新载体。
一、新载体制备实施例实施例一10.8克聚丁二酰亚胺溶于55mL DMF中，加入15克3-氨基丙基硅胶，摩尔数之比1∶5。在室温下将其搅拌约8小时，使之充分反应后，再经抽滤和用DMF浸泡，通过洗涤工序除去未反应的聚丁二酰亚胺。然后，用乙醚洗三次，除去DMF。最后经干燥(自然晾干)，得新载体即聚丁二酰亚胺-硅胶固体产品16.69克，增重1.69克，每克载体上含聚丁二酰亚胺0.101克。
实施例二12.4克聚丁二酰亚胺溶于65mL DMF中，加入15克3-氨基丙基玻璃微球，摩尔数之比1∶6。其余操作同例一。得聚丁二酰亚胺-玻璃微球16.98克，增重1.98克，每克载体上含聚丁二酰亚胺0.117克。
实施例三14.0克聚丁二酰亚胺溶于65mL DMF中，再加入15克3-氨基丙基硅胶，摩尔数之比1∶6.5。其余操作同例一。得聚丁二酰亚胺-硅胶固体产品17.27克，增重2.27克，每克载体上含聚丁二酰亚胺0.131克。
实施例四17.2克聚丁二酰亚胺溶于75mL DMF中，再加入15克3-氨基丙基硅胶，摩尔数之比1∶8。其余操作同例一。得聚丁二酰亚胺-硅胶17.41克，增重2.41克，每克载体上含聚丁二酰亚胺0.138克。
上述实施例中的滤液可循环使用。例如，向实施例三中的滤液补加2克聚丁二酰亚胺，再加入15克3-氨基丙基硅胶，其余操作同例一。得17.09克聚丁二酰亚胺-硅胶，增重2.09克，每克载体上含聚丁二酰亚胺0.122克。
二、新载体应用效果新载体应用效果可用图3、图4、图5曲线图说明。其中符号■为用新载体制备的固定化脂肪酶，符号▲为用3-氨基丙基硅胶为载体制备的固定化脂肪酶，符号●为脂肪酶。
如图3所示，用新载体制备的固定化脂肪酶的热稳定性最高，这是通过将上述三种物质置于不同温度下催化橄榄油水解，测定其活力和计算其相对活力得出的。图中相对活力，其定义是某个温度下的活力值与其中最高活力值之比得到的百分数，即为该温度下的相对活力。
如图4所示，在pH≤7.0的缓冲溶液中，用新载体制备的固定化脂肪酶的相对活力，要比用3-氨基丙基硅胶为载体制备的固定化脂肪酶的相对活力大得多。此图中的相对活力，其定义是某个pH值下的活力值与其中最高活力值之比得到的百分数，即为该pH值下的相对活力。图中pH≤8.0的缓冲溶液，由KH2PO4和NaOH配制，pH≥9.0的缓冲溶液由K2HPO4和NaOH配制，浓度均为0.1mol/L。
如图5所示，用新载体制备的固定化脂肪酶在缓冲溶液中，其活力保持的时间要比用3-氨基丙基硅胶为载体制备的固定化脂肪酶在同样的条件下长得多，而且它在30～35℃下的缓冲溶液中的活力比保存在4℃下的活力还要高，放置到90天时其活力仍比保存在4℃下的活力约高55％。所谓同样条件，是指将这两种物质置于5mL缓冲溶液和30～35℃的环境中，并且每隔一段时间测一次活力。
上述酶活力的测定过程是12克橄榄油加入40mL 25％聚乙烯醇溶液，在超声波的作用下乳化5分钟，得到白色乳状液。将脂肪酶溶于缓冲溶液中，配成1mg/mL的溶液。5mL橄榄油乳状液加入4mL缓冲溶液中，再加入1mL脂肪酶溶液，于37℃下反应30分钟。以20mL乙醇-丙酮(1∶1,V/V)终止反应，加5滴酚酞溶液(当测酶在pH≥9缓冲溶液中的活力时，终止反应后，先向混合物中加入1mL 0.1mol/L KH2PO4溶液)，用0.04N NaOH溶液滴定至红色，这个滴定值为V1。
在上述测定中，将1mL脂肪酶溶液在终止反应后加入混合物中，其余操作不变，同样用0.04N NaOH溶液滴定至红色，这个滴定值为空白值V2。由V1和V2的差值来计算酶的活力。
测固定化脂肪酶活力时，将5mL橄榄油乳状液和0.15g用聚丁二酰亚胺-硅胶制备的固定化脂肪酶或0.7g用3-氨基丙基硅胶为载体制备的固定化脂肪酶加入5mL缓冲溶液中，其余操作同脂肪酶活力的测定。
用上述新载体制备固定化脂肪酶，如图2所示，序号3是新载体，NH2-En是脂肪酶，序号4是用新载体制备的固定化脂肪酶。其方法是将0.6g脂肪酶和6g用实施例三制备的聚丁二酰亚胺-硅胶加入16mL缓冲溶液中，在4℃下搅拌6小时。抽滤，固定化脂肪酶用缓冲溶液洗四次，然后真空干燥。固定化反应的活力回收达90％，活力回收的定义为固定化酶与滤液中剩余酶的活力之和占用于固定化反应的脂肪酶总活力的百分数。该固定化反应液可以再利用，例如24mg脂肪酶和0.2g新载体加入缓冲溶液中，在4℃下搅拌6小时。离心分离，离心液加入另一份0.2g载体中，用0.4mL缓冲溶液洗固定化脂肪酶，洗涤液也加入另一份0.2g载体中，这一份混合物再在4℃下搅拌6小时，如此重复四次。每一次固定化脂肪酶都用缓冲溶液洗四次，然后真空干燥。测各次固定化脂肪酶的活力分别为13.5、11.7、8.9、6.5、5.9个单位。一个活力单位定义为每克固定化脂肪酶在一分钟内催化橄榄油乳状液水解所生成的脂肪酸的微摩尔数。
用上述3-氨基丙基硅胶为载体制备固定化脂肪酶，可参照文献(Shi-Jun Ge etal.Biotechnol.Appl.Biochem.24,1,1996)制备，即10g 3-氨基丙基硅胶加入30mL2％甲醛的磷酸缓冲溶液(pH8.0,0.1mol/L)中，在4℃下搅拌12小时，抽滤，用蒸馏水洗，除去过量的甲醛。再将与甲醛反应过的3-氨基丙基硅胶加入含0.33g脂肪酶的30mL缓冲溶液中，在4℃下搅拌过夜。抽滤，固定化脂肪酶用缓冲溶液洗四次，然后在真空下干燥。滤液中酶的活力较低，活力回收为34％。活力回收的定义为固定化酶与滤液中剩余酶的活力之和占用于固定化反应的脂肪酶总活力的百分数。
三、实施例中的原料及有关试验中所用的仪器、试剂说明
1、原料聚丁二酰亚胺和3-氨基丙基硅胶、3-氨基丙基玻璃微球可由国外进口，也可以按下述方法制备。
按文献[Pietro Tundo,et al.Journal of the American ChemistrySociety.101(22):6606,1979；]和刘立建等刊登在《离子交换与吸附》[11(6):541,1995]期刊上的“多孔硅球的活化和硅烷化”文章中公布的技术，制备3-氨基丙基硅胶(玻璃微球)50g硅胶加入150mL 7％的甲烷磺酸中，加热使之回流5小时。冷却，抽滤，用蒸馏水洗三次后，再用蒸馏水浸泡，再抽滤，用蒸馏水洗至中性，真空下干燥至恒重。然后，将43.2g经酸处理后的硅胶加入40mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和120mL甲苯的混合物中，搅拌，缓慢升温并使之回流10小时。冷却，抽滤，用甲苯浸泡洗涤三次，再用无水乙醚洗三次，干燥至恒重，得3-氨基丙基硅胶49.27g，增重6.08g，每克硅胶上含1.48mmol氨基，其红外光谱数据Y N-H(3228-3614cm-1,1100cm-1),δN-H(1639cm-1,801cm-1)。
以玻璃微球代替硅胶，制备3-氨基丙基玻璃微球，其操作同上，每克3-氨基丙基玻璃微球含1.42mmol氨基。
按文献[Neri Paolo,et al.Journal of Medicinal Chemistry.16(8):893,1973l制备聚丁二酰亚胺50g研细的L-天冬氨酸和25g 85％的磷酸置于烧杯中混合均匀，然后将混合物均匀平摊在瓷盘中，在180℃下减压反应4小时。冷却，将粗产物加入200mLDMF中，搅拌使之溶解。将溶液缓慢倒入1L蒸馏水中，同时剧烈搅拌。静置后抽滤，沉淀物用水洗至中性，真空于燥，得白色粉末状固体32.5g，产率89％，特性粘度34.1mL·g-1(DMF,25℃)。
其红外光谱数据YC=O(1788cm-1,1712cm-1)。
2、仪器和试剂Nicolet FT-IR红外光谱仪乌氏粘度计。
硅胶为化学纯，100-200目；多空玻璃微球为色谱固定相，120-160目；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(武汉大学化工厂产品)，用前减压重蒸；L-天冬氨酸为生化试剂；橄榄油为化学纯；甲苯、DMF、甲醛(40％)和无水乙醚为分析纯；聚乙烯醇为实验试剂，平均聚合度为1750±50；脂肪酶(porcine pancreas)为Sigma公司产品，蛋白质含量为25％，活力为55单位/毫克；缓冲溶液由分析纯的KH2PO4NaOH(pH≤8.0)和K2HPO4、NaOH(pH≥9.0)配制，除特别注明外，缓冲溶液的pH值为7.5，浓度均为0.1mol/L。
权利要求
1.一种固定化酶载体，其特征在于所述的载体是由无机和有机材料载体构成的复合型载体，包括聚丁二酰亚胺和3-氨基丙基硅胶或3-氨基丙基玻璃微球，二者以共价键相连。
2.一种制备权利要求1所述载体的方法，其特征是将聚丁二酰亚胺溶于N,N′-二甲基甲酰胺中，加入3-氨基丙基硅胶或3-氨基丙基玻璃微球，按其氨基的摩尔数与聚丁二酰亚胺中的丁二酰亚胺结构单元的摩尔数之比1∶5～8投料，然后从反应混合物中收集生成物。
全文摘要
本发明是一种固定化酶载体,其由无机和有机材料载体构成,包括聚丁二酰亚胺和3－氨基丙基硅胶或3－氨基丙基玻璃微球,二者以共价键相连。其制备方法是:将聚丁二酰亚胺溶于N,N′,－二甲基甲酰胺中,加入3－氨基丙基硅胶或3－氨基丙基玻璃微球,按其氨基的摩尔数与聚丁二酰亚胺中的丁二酰亚胺结构单元的摩尔数之比1∶5～8投料,然后从反应混合物中收集生成物。本发明具有实用性强、利于工业化生产等优点。
文档编号C12N11/00GK1216776SQ9812166
公开日1999年5月19日 申请日期1998年11月10日 优先权日1998年11月10日
发明者柏正武, 周宜开, 任恕 申请人:同济医科大学