专利名称：用于动物细胞培养的磁敏性微载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种动物细胞培养技术，特别是涉及一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体及其制备方法。
大规模培养动物细胞可用于生产许多生物制品，如疫苗、药用蛋白、细胞代谢物等。培养贴壁依赖性细胞最初是采用滚瓶系统，劳动强度大，单位体积提供的细胞生长面积小，按培养体积计算培养效率低。1967年Van Wezel开发了微载体培养系统，培养贴壁依赖性细胞。微载体是直径几十至几百微米的微珠。用微载体培养贴壁依赖性细胞时，细胞贴壁在微载体上，微载体悬浮于培养基中。因为微载体有很大的比表面积，因而大大提高了培养效率。
目前常用的动物细胞培养微载体按基质划分有以下几类(1)交联葡聚糖；(2)碳水化合物，如DEAE-纤维素微载体；(3)蛋白质，如明胶微载体；(4)多糖类，如几丁质；(5)橡胶；(6)玻璃，如空心玻璃珠；(7)塑料，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺。商品牌号有Biocarrier，Superbeads，Biosilon，Cytosphere，Cytodex1，Cytodex2，Cytodex3等，这些牌号均没有磁响应。
用于微载体培养的生物反应器有气升式生物反应器、通气搅拌笼式生物反应器、柱式反应器、机械搅拌式反应器、帆式搅拌反应器、流化床生物反应器等类型。由于微载体悬浮于液体中，相互碰撞，对细胞的生长不利，故微载体的量一般为1-5克／升，最高达到12-15克／升，所获细胞密度一般为106-107／ml。如果给柱式反应器中加上纵向磁场，同时其中的微载体颗粒又有磁敏性，则在一定条件下可以形成稳定的颗粒床层，颗粒在空间相对静止，装填密度可以达到很高，而液体可以自由通过，压降很低，因此可以实现高密度培养。
关于动物细胞培养用磁敏性微载体，文献1U．S．S．R．SU1567623报道了一种真核细胞培养用磁敏性微载体的制备方法，是将Fe、Co、Ni的氧化物与明胶混合制粒、研磨，然后用蛋白酶处理直到表面光滑，所用氧化物为0．005-0．05μm的粉末。该载体由于将磁粉与基质直接混合，难以保证磁粉不泄露和伤害细胞。
本发明为了提高动物细胞大规模培养的密度和反应器的效率，提供了一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其可用于在磁场动物细胞培养反应器中培养动物细胞。该微载体既要对磁场有响应，又要适于细胞的贴壁、生长，还不能有磁粉的泄露，以免污染培养液和伤害细胞。本发明还提供了上述用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法。
本发明的技术方案如下用于动物细胞培养的磁敏性微载体是核壳式结构，内核为磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物构成，壳层为适于细胞贴壁、生长的基质，所用磁粉的平均粒径为0．1-5微米，磁敏核直径与微载体直径的比值为1∶1．2-1∶5，微载体的平均粒径为120微米～300微米。
所说的磁粉为γ-Fe(OH)2、γ-Fe2O3或Fe3O4。所说的高分子聚合物可由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂制备，其中单体包括可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体，如苯乙烯系列，如苯乙烯、对乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯或α-甲基苯乙烯，和甲基丙烯酸甲酯。引发剂包括悬浮聚合常用的引发剂，如过氧化苯甲酰(BPO)或偶氮二异丁腈(AIBN)。交联剂包括悬浮聚合常用的交联剂，如二乙烯基苯和异氰尿酸三烯丙酯。壳层基质包括适合不同种类的细胞贴壁和生长的基质，如明胶、葡聚糖等。
微载体表面还可以根据需要进行化学修饰，以改变其电荷分布、亲水性等。
上述微载体的制备是采用高分子聚合物包裹磁粉形成磁敏核，再在外面包被一层基质，经后处理，即得到磁敏性微载体。
具体的制备包括下面两个步骤1．磁核制备将聚合单体与交联剂按体积比为100∶2-40混合均匀，按每100ml单体加入0．5-1克的引发剂，于60℃-70℃维持搅拌，按每100ml反应液再加入25-75克磁粉，以1．2-2℃／分钟的速度升温至80-90℃。提高搅拌转速，加入是单体体积6-15倍的重量百分比为3-8％的明胶溶液，聚合3-4小时。90-100℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以60℃以上热水浸洗3-5次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于100℃以下烘干，得所需磁核。2．包被基质用pH值为5．0-7．2的磷酸缓冲液配制重量百分比为5％-20％的明胶溶液，按每克磁核(湿)需10-100ml明胶溶液的比例将磁核加入到明胶溶液中，搅拌5分钟以上。将该液加入到搅拌中的4-8倍于明胶溶液体积的甲苯液中，甲苯液中溶有Sp80的比例为0．5-4mlSp80／克于明胶，于40-50℃搅拌5分钟以上，使裹有明胶的磁核充分分散，之后降温至0-10℃，搅拌5分钟以上。按照0．2-3ml戊二醛溶液／克干明胶的比例滴加重量百分比为10-50％的戊二醛溶液，升温到20-30℃，交联1-3小时。过滤收集微珠，用pH值为7．0-7．2的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9-10，加入NaBH4至溶液中的NaBH4的重量百分比浓度为0．5-2％，还原10-24小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，用梯度乙醇冲洗(重量百分比为60％，70％，80％，95％)，于70℃以下烘干，得本发明的微载体。
为了获得更好的效果，也可采用下面的五步骤制备。
即在第1步骤的“磁核制备”之前加上一个磁粉硅烷化步骤其是对磁粉的表面进行处理，使之更容易与高分子聚合物融合，以提高磁核的磁粉含量。向100体积份的重量百分比为0．1-1％的醋酸水溶液中加入0．2-10体积份的硅烷溶液，搅拌均匀，根据需要加入一定量磁粉，低速搅拌10分钟以上，过滤，于100℃以下烘干，研细。
在第1步骤的“磁核制备”和第2步骤的“包被基质”之间加上磁核表面处理步骤其是对磁核的表面进行处理，使之更容易挂上不同种类的细胞贴壁和生长的基质。将磁核(干)加入到适量铬酸洗液或磺化液中使磁核被浸没并悬浮，略搅拌，室温浸泡3分钟以上。过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。
在第2步骤“包被基质”之后加上微载体表面修饰步骤；将已包被的微载体颗粒(干)加入到能淹没载体并能使之悬浮的1～2M DEAECl·HCl的溶液中，于40-50℃搅拌10分钟以上。向体系缓慢加入是DEAECl·HCl溶液体积的0．5～3倍的1～3M NaOH溶液，搅拌1小时以上。过滤，依次用去离子水、0．05～0．5M HCl、0．05～0．5mM HCl、去离子水、pH值为7．0-7．2的磷酸缓冲液冲洗载体颗粒，再用梯度乙醇冲洗，于70℃以下烘干，或置于70％的乙醇保存。
在制备磁核时，将磁粉加入到单体、交联剂和引发剂的混合物中以后，可经过10-20分钟的预聚合，再加入分散上述混合物的明胶溶液。所制得的微载体可以进一步进行包括DEAE修饰或衍生化的表面修饰。
本发明的磁核由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂与磁粉经悬浮聚合制得，制备出的磁核的平均粒径为60μm-100μm，磁粉含量为30％-50％(wt)。
微载体的平均粒径为120μm-300μm，湿比重1．1-1．5g／cm3，微载体具有刚性致密结构。壳核式结构的微载体，其壳层为有利于细胞贴壁、生长的基质，这种结构既使微载体对磁场有响应．又隔绝了磁粉与细胞的直接接触，还防止了在培养基中磁粉的泄露、污染培养液和对细胞的伤害，培养结果表明适于Vero细胞贴壁生长。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例11．磁粉硅烷化向重量百分比为0．1％的醋酸水溶液100ml中加入0．2ml硅烷溶液，搅拌均匀，加入10克铁氧体粉末(Fe3O4)，低速搅拌3小时，过滤，将磁粉于70℃烘干，研细，得硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)。2．磁核制备在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)0．4ml，混合均匀后加入过氧化苯甲酰(BPO)0．1g，于65℃、450rpm转速搅拌下，加入硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)5g，以1．2℃／分钟的速度升温至80℃。提高搅拌转速至650rpm，加入重量百分比为8％明胶溶液120ml，聚合4小时。100℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以60℃热水浸洗5次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于70℃烘干，得干磁核。3．磁核表面处理取4ml铬酸洗液，加入0．5g磁核(干)略搅拌，室温浸泡3分钟。过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。4．包被基质用pH值为5．5的磷酸缓冲液配制20ml重量百分比为15％的明胶溶液，然后加入0．5g磁核(湿)，搅拌0．5小时，将该液加入到搅拌中的溶有1．5ml Sp80的150ml甲苯液中，50℃搅拌5分钟，搅拌速度300rpm，之后转入冰水浴，降温至0℃，搅拌10分钟。滴加9ml重量百分比为10％的戊二醛溶液，升温到20℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7．0的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9，加入NaBH4至2％浓度，还原10小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于60℃烘干。5．微载体表面修饰称取已包被微载体颗粒(干)0．5克，加入15ml 2M DEAECl·HCl溶液，于50℃搅拌10分钟。向体系缓慢加入10ml 3M NaOH溶液，搅拌1小时。过滤，依次用去离子水、0．05MHCl、0．05mM HCl、去离子水、pH值为7的磷酸缓冲液冲洗载体颗粒，再依次以60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于60℃烘干。所得微载体粒径为60-300微米，平均粒径200微米，湿比重1．37g／cm3。
1．磁粉硅烷化向0．5％的醋酸水溶液100ml中加入2ml硅烷溶液(比例)，搅拌均匀，加入15克磁粉，低速搅拌浸泡1小时，过滤，将磁粉于85℃烘干，研细，得硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)。2．磁核制备在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)4ml，混合均匀后加入过氧化苯甲酰(BPO)0．2g，于60℃、450rpm转速搅拌下，加入硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)10g，以1．6℃／分钟的速度升温至85℃。提高搅拌转速至650rpm，加入5％明胶溶液200ml，聚合3．5小时。95℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以80℃热水浸洗4次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于85℃烘干。3．磁核表面处理取2ml磺化液，加入0．5g磁核(干)略搅拌，室温浸泡10分钟。过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。4．包被基质将0．5g磁核(湿)加入到用pH5．0的磷酸缓冲液配制的5ml 20％的明胶溶液中，搅拌1小时，将该液加入到搅拌中的溶有2ml Sp80的40ml甲苯液中，40℃搅拌20分钟，搅拌速度400rpm，之后转入冰水浴，降温至5℃，搅拌20分钟。滴加1ml 20％的戊二醛溶液，升温到25℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7．1的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH至9．5，加入NaBH4至1％浓度，还原18小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于50℃烘干。5．微载体表面修饰称取已包被微载体颗粒(干)0．5克，加入10ml 1M DEAECl·HCl溶液，于50℃搅拌0．5小时。向体系缓慢加入5ml 2M NaOH溶液，搅拌1小时。过滤，依次用去离子水、0．2MHCl、0．2mM HCl、去离子水、磷酸缓冲液液冲洗载体颗粒，再依次以60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于50℃烘干。所得微载体粒径为60-400微米，平均粒径240微米，湿比重1．45g／cm3。
权利要求
1．一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其特征在于该微载体为核壳式结构，内核为磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物构成，壳层为适于细胞贴壁、生长的基质，所用磁粉的平均粒径为0．1-5微米，磁敏核直径与微载体直径的比值为1∶1．2-1∶5，微载体的平均粒径为120微米～300微米。
2．按照权利要求1所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其特征在于所说的磁粉为γ-Fe(OH)2、γ-Fe2O3或Fe3O4。
3．按照权利要求1所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其特征在于所说的高分子聚合物由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂制备，其中单体选自苯乙烯、对乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯、α-甲基苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯；引发剂包括过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈交联剂包括二乙烯基苯和异氰尿酸三烯丙酯。
4．按照权利要求1所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其特征在于壳层基质是明胶、葡聚糖。
5．一种制备权利要求1～4所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于包括下面两个步骤(1)磁核制备将聚合单体与交联剂按体积比为100∶2-40混合均匀，按每100ml单体加入0．5-1克的引发剂，于60℃-70℃维持搅拌，按每100ml反应液再加入25-75克磁粉，以1．2-2℃／分钟的速度升温至80-90℃，提高搅拌转速，加入是单体体积6-15倍的重量百分比为3-8％的明胶溶液，聚合3-4小时，90-100℃熟化2小时，过滤收集颗粒，依次用热水浸洗，冷水冲洗，用无水乙醇室温冲洗，用无水乙醇浸泡过夜，于100℃以下烘干；(2)包被基质用pH值为5．0-7．2的磷酸缓冲液配制重量百分比为5％-20％的明胶溶液，按每克湿磁核需10-100ml明胶溶液的比例将磁核加入到明胶溶液中，搅拌5分钟以上，将该液加入到搅拌中的4-8倍于明胶溶液体积的甲苯液中，甲苯液中溶有Sp80的比例为0．5-4mlSp80／克干明胶，于40-50℃搅拌5分钟以上，使裹有明胶的磁核充分分散，之后降温至0-10℃，搅拌5分钟以上，按照0．2-3ml戊二醛溶液／克干明胶的比例滴加重量百分比为10-50％的戊二醛溶液，升温到20-30℃，交联1-3小时，过滤收集微珠，用pH值为7．0-7．2的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9-10，加入NaBH4至溶液中的NaBH4的重量百分比浓度为0．5-2％，还原10-24小时，以磷酸缓冲液洗微球三次，用梯度乙醇冲洗，于70℃以下烘干。
6．按照权利要求5所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于在上述第(1)步骤之前加入一个磁粉硅烷化步骤向100体积份的重量百分比为0．1-1％的醋酸水溶液中加入0．2-10体积份的硅烷溶液，搅拌均匀，根据需要加入一定量磁粉，低速搅拌10分钟以上，过滤，于100℃以下烘干，研细。
7．按照权利要求5所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于在上述第(1)步骤和上述第(2)步骤之间加入一个磁核表面处理步骤将干磁核加入到适量铬酸洗液或磺化液中使磁核被浸没并悬浮，略搅拌，室温浸泡3分钟以上，过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。
8．按照权利要求5所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于在第(2)步骤之后加入一个微载体表面修饰步骤将已包被的干微载体颗粒，加入到能淹没载体并能使之悬浮的1～2M DEAECl·HCl溶液中，于40-50℃搅拌10分钟以上，向体系缓慢加入是DEAECl·HCl溶液体积的0．5～3倍的1～3M NaOH溶液，搅拌1小时以上，过滤，依次用去离子水、0．05～0．5M HCl、0．05～0．5mM HCl、去离子水、pH值为7．0-7．2的磷酸缓冲液冲洗载体颗粒，再用梯度乙醇冲洗，于70℃以下烘干，或置于70％的乙醇保存。
9．按照权利要求5所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于制备磁核时，将磁粉加入到单体、交联剂和引发剂的混合物中以后，经过10-20分钟的预聚合，再加入分散上述混合物的明胶溶液。
10．按照权利要求5～9所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于所制得的微载体可以进一步进行包括DEAE修饰或衍生化的表面修饰。
全文摘要
本发明涉及一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体及其制备方法。该微载体为核壳式结构,内核为磁敏核,磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物构成,壳层为适于细胞贴壁、生长的基质,所用磁粉的平均粒径为0.1－5微米,磁敏核直径与微载体直径的比值为1∶1.2－1∶5,微载体的平均粒径为120微米~300微米。方法包括磁粉硅烷化、磁核制备、磁核表面处理、包被基质、微载体表面修饰。由高分子聚合物包裹磁粉形成,由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂与磁粉经悬浮聚合制得。微载体具有刚性致密结构。
文档编号C12N5/06GK1289842SQ9911964
公开日2001年4月4日 申请日期1999年9月23日 优先权日1999年9月23日
发明者丛威, 吕秀菊, 欧阳藩 申请人:中国科学院化工冶金研究所