250X 4.6mm，5 μπι);流动相为40%乙腈；洗脱速度为1.0 mL/min ;紫外检测波长为220 nm0
[0017]本发明的酶解贻贝蛋白制备降压肽的方法，具有如下优点:
本发明采用的是一种生物酶法，易通过对酶解过程的监控，使ACEP最大程度地释放出来，提高原料的利用率。所制备的ACEP是贻贝肉经酶水解制得，安全、无毒副作用，ACE抑制活性显著，对高血压患者具有降压作用。
[0018]本发明的产品可以作为药品和保健食品等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。较之现有的制备方法，本发明同时融合了酶解、超滤、磁性微球固定化酶吸附和RP-HPLC多种手段，方法更加完善，而且得到的降压肽具有较高的活性。
[0019]
【附图说明】
[0020]图1是本发明实施例用Zorbax C18 (250X4.6mm, 5 μ m)柱进行层析时所获得的色谱图。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0023]实施例:
一种贻贝蛋白降压肽的快速制备方法，制备流程如下:贻贝肉"组织破碎"酶解"超滤〃琼脂糖磁性微球固定化ACE的吸附"RP-HPLC纯化〃降压肽。
[0024])琼脂糖磁性微球的制备与活化:按照重量体积比1.5g: 30 mL将琼脂糖加入到水中，共同煮沸至琼脂糖完全溶解，加入I ml Fe3O4磁流体，在旋涡混合器上充分混合；在搅拌下将混合液滴入到80°C的有机相(Span-80:液体石蜡=Ig: 25mL)中，并在80°C下反应20 min ;有机相冷却至40°C于250 rpm转速机械搅拌15 min使微球成形，并在磁场中分离，制得的微球分别用石油醚和去离子水清洗3次，以清除残余有机相，得琼脂糖磁性微球；将似8!14按照重量体积比2mg:1mL加入到NaOH溶液(0.8 mol/L)中，然后将环氧氯丙烷按照体积比0.5:1再加入到NaOH溶液(0.8 mol/L)中，最后按照重量体积比3 g:1 mL将琼脂糖磁性微球加入到NaOH溶液(0.8 mol/L)中，于40°C下搅拌3 h，得活化琼脂糖磁性微球。
[0025]) ACE的固定:按照质量比1.5: 10将血管紧张素转化酶(ACE)和活化的琼脂糖磁性微球加入硼酸盐缓冲液(0.1 mol/L)中，50°C振荡3 h后，混合液放入磁场中，分离琼脂糖磁性微球，并用蒸馏水充分洗涤，直至无酶蛋白被洗出，真空冷冻干燥得琼脂糖磁性微球固定化ACE。
[0026])贻贝蛋白的酶解和超滤:将厚壳贻贝iMytiluscoruscus)去壳，贻贝肉与甘氨酸-NaOH缓冲液按照Ig:4 mL的重量体积比混合、匀浆，调节pH值至9.5，得混合液；混合液调温度至50°C，然后按照贻贝肉质量的0.8%加入碱性蛋白酶(2.0X 15 U/g)，酶解5 h ；酶解液升温至95°C，并于此温度保持10 min后；调温度至37°C，用I mol/L NaOH溶液调pH至8.6，按照贻贝肉质量的1.0%加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，酶解6 h后，将酶解液采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，冻干，即为超滤酶解物。
[0027])贻贝蛋白降压肽的制备:将超滤酶解物依次经琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制(RP-HPLC)纯化，得降压肽。
[0028]①琼脂糖磁性微球固定化ACE的吸附:向硼酸盐缓冲液(0.1 mol/L, pH 7.8)加入NaCl至浓度为0.2 mol/L，然后加入超滤酶解物至浓度为6 mg/mL，最后按照溶液中酶解物重量的40倍加入琼脂糖磁性微球固定化ACE，吸附45 min后，利用磁场将磁性微球与溶液分离，用硼酸盐缓冲液反复洗涤微球至洗涤液220 nm和280 nm无紫外吸收后，然后将磁性微球在1.0 mol/L的NaCl溶液中解吸附，利用磁场将磁性微球与溶液分离，溶液冻干，得降压肽混合物。
[0029]②RP-HPLC纯化:将降压肽混合物配成45 μ g/mL溶液，利用RP-HPLC (条件:进样量为20 yL ;色谱柱为Zorbax C18 (250 X 4.6mm，5 μ m);流动相为40%乙腈；洗脱速度为1.0 mL/min;紫外检测波长为220 nm)进行纯化，根据对ACE的抑制活性得一个高活性降压肽(见图1)。
[0030]③结构检测:收集活性最高的降压肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp (VSffPCRff), ESI/MS检测分子量为935.07 Da0
[0031]将上述制得的贻贝蛋白降压肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp (VSffPCRff)进行ACE抑制活性实验。实验结果表明:该多肽的半数抑制率(IC5tl)为37.53 土 1.09 μΜ?因而，该多肽可用于制备有关心血管保健、降血压、治疗高血压的保健食品或医疗药品。
[0032]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种贻贝蛋白降压肽的用途，其特征在于该降压肽用于制备降血压保健食品、预防或治疗高血压的保健食品，以及心血管保健食品中的用途。
2.根据权利要求1所述的一种贻贝蛋白降压肽的用途，其特征在于所述的降压肽的氨基酸序列为 Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp，ES1-MS 测定分子量为 935.07 Da。
【专利摘要】本发明公开了一种贻贝蛋白降压肽的用途，该降压肽具有降血压活性，其氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp（VSWPCRW），ESI-MS测定分子量为935.07 Da。贻贝经去壳取肉、酶解、超滤、琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制（RP-HPLC）纯化，得活性肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp。本发明制备的活性肽具有显著的血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性，可用于高血压治疗相关的药物。
【IPC分类】A61K38-08, A61P9-12, A23L1-305
【公开号】CN104757561
【申请号】CN201510177317
【发明人】王斌, 迟长凤, 赵玉勤, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月15日