酶复合物在养殖型动物的饲料中的用图
【专利说明】酶复合物在养殖型动物的饲料中的用途
[0001] 本发明的技术领域属于动物营养领域。
[0002] 已知弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae)菌株可以产生至少五种类型的称为 Ia、Ib、II、III、IV的蛋白酶和两种肽酶（专利GB 1133579)。
[0003] 在其专利申请WO 87/07905中，申请人描述了用于获得专一地由II、III和IV型 蛋白酶（其中Π 型蛋白酶占优势）组成的蛋白水解复合物的方法。该复合物是从WAKSMN 3535类型的弗氏链霉菌菌株开始通过下述过程而获得的：发酵，通过过滤来提取复合物， 然后在具有相应于2, 000至12, 000的分子量的截止阈值的膜上进行超滤，和最后粉化。如 此获得的以粉末形式的复合物具有至少2, 000安森单位（Anson unit)/mg蛋白质的滴度。
[0004] 在该申请中，II型蛋白酶以接近18kDa的分子量和接近9. 0的等电点为特征。
[0005] 在动物饲料中所使用的该复合物允许动物有效地同化富含粗蛋白质的食物并因 此刺激其生长。此外，在妊娠母猪中所使用的该复合物使得能够获得在出生时猪崽体重的 增加，伴随有饲料消耗的减少和健康状况的改善。
[0006] 然而，该方法并不能使得能够有效地去除污染性的副产物。
[0007] 在专利申请WO 97/37681中，提供了改进，其使得能够将滴度为至少4, 000安森单 位/mg蛋白质的产品用于治疗性应用。因此，占优势的蛋白酶具有大于100, 000安森单位 /mg蛋白质的比活性，具有30至36kDa的分子量和接近7. 0的等电点。
[0008] 后来进行的分析显示，所述蛋白酶的分子量为18_20kDa。
[0009] 所描述的治疗性应用主要在于：减少对于某些疾病来说特征性的粘液分泌过多的 正面作用；肠吸收和血液循环的改善；还有针对感染性疾病的对抗。此外，所述组合物被描 述为有利于肠粘膜的经萎缩的或被破坏的绒毛的再生。
[0010] 鉴于从弗氏链霉菌的培养物中提取的酶复合物的重大的治疗特性，重要的是使用 更加完全地摆脱了可能影响其活性的生物学杂质的酶复合物。
[0011] 因此，本发明旨在提供上面所描述的酶复合物的改善，以尤其是有利于在工业养 殖背景下的良好的养殖条件和动物健康。
[0012] 因此，本发明的目标在于通过培养弗氏链霉菌菌株而获得的包含蛋白酶混合物的 酶复合物用于对养殖型动物的饲料进行补充的用途，其特征在于，在所述混合物的这些蛋 白酶之中，一种蛋白酶具有7. 0左右的等电点，和另一种蛋白酶具有8. 0左右的等电点。
[0013] 所述复合物占非常多数地包含这两种类型的蛋白酶，即这两种蛋白酶的比例超过 所述混合物的活性的80%。
[0014] 根据本发明的一个特征，等电点为7.0左右的蛋白酶具有大约150, 000安森单位 /mg蛋白质的比活性。
[0015] 根据本发明的一个特征，等电点为8. 0左右的蛋白酶具有大约38, 000安森单位/ mg蛋白质的比活性。
[0016] 根据本发明的另一个特征，将所述酶复合物作为饲料补充物用于改善工业养殖型 动物的总体状况，所述饲料补充物以粉末、液体或任何其他适合于与饲料组合物相混合的 形式存在。
[0017] 根据本发明的一个特征，在旋转式滚筒中将以粉末形式的酶复合物与饲料组合物 进行干法混合直至均匀。
[0018] 根据本发明的另一个特征，在流化床中将以液体形式的酶复合物喷雾在饲料组合 物上，然后粒化。
[0019] 根据本发明的一个特征，在家禽的饲料中使用所述酶复合物。
[0020] 根据本发明的另一个特征，在猪的饲料中使用所述酶复合物。
[0021] 根据本发明的另一个特征，在鱼的饲料中使用所述酶复合物。
[0022] 本发明的目标还在于用于养殖型动物的饲料组合物，其包含本发明的酶复合物， 和任选地，具有营养目的的赋形剂或载体，或其他添加剂。
[0023] 最后，本发明的目标在于用于制备根据本发明的酶复合物的方法，其特征在于，培 养弗氏链霉菌菌株，过滤发酵液，然后着手进行通过超滤和离子交换色谱法以及随后的等 电聚焦来提取酶复合物，和最后将所获得的复合物冻干。
[0024] 该发明使得能够提供其特征受到严格限定的饲料补充物。
[0025] 本发明首先使得能够精确地调整待施用到饲料组合物中的剂量，以便获得所希望 的治疗效果。
[0026] 本发明还具有在工业养殖中改善动物的健康状况的优点。
[0027] 此外，本发明还提供了在工业养殖中动物的总体状况的改善，这提高了经营的赢 利性。
[0028] 本发明还允许动物生长的增加，同时引起饲料消耗的下降。
[0029] 通过与图解说明了肠绒毛的图片相关联地阅读下面的对于作为实例而给出的实 施方案进行的补充描述，将会更好地理解本发明的其他特征、细节和优点。
[0030] 已知以名称 Panstimase# (PANcreatic STIMulating diastASE)进行销售的 酶混合物是来自弗氏链霉菌发酵的酶复合物。该复合物被描述为占多数地包含三种蛋白 酶，其中的一些特异地作用于硬化蛋白（胶原、弹性蛋白、角蛋白），但也作用于由霍乱弧菌 或某些大肠杆菌（Escherichia coli)致病菌株所释放的蛋白质性质的某些毒素。
[0031] 在畜牧学领域中，重要的是拥有在技术上明确的、十分恒定的且其特性因此清楚 地确定的产品。
[0032] 为了获得根据本发明的酶复合物，培养弗氏链霉菌菌株并过滤发酵液。然后，着手 进行通过超滤、离子交换色谱法和等电聚焦来提取和表征酶复合物。最后，着手进行将所获 得的复合物冻干。
[0033] 对于弗氏链霉菌菌株的培养，使用例如WAKSMAN 3535类型的菌株，并且所述菌株 可以是在遗传上经改进的，以便尤其是获得蛋白水解活性的增加或任何抗生素分泌的取 消。
[0034] 在工业生产型发酵罐中在合适的培养基中进行所述培养。该培养基可以例如基 于：15g/l大豆磨粉；30g/l葡萄糖；lg/Ι磷酸氢二钾；10g/l碳酸钙。
[0035] 所述反应在7. 0至7. 5的pH下，在大约28°C的发酵温度下，以0. 3体积的无菌空 气/培养基体积/分钟的通气来进行。
[0036] -旦培养结束，就通过在澄清剂存在下过滤发酵液来去除菌丝体。
[0037] 酶复合物的提取需要使用几项技术，包括超滤、离子交换色谱法和等电聚焦。
[0038] 轺滤
[0039] 滤液的超滤借助于具有50kDa的截止阈值的膜来进行。
[0040] 在3小时的过滤后，所收集的滤液（起始体积的71 % )具有通过明胶薄膜测试而 揭示的蛋白水解活性。该测试在于用银进行染色且放置在固体支持物上的明胶薄膜的降 解。
[0041] 离子夺换色谱法
[0042] 采用使用具有合适尺寸的Cellufine C-500羧甲基凝胶柱（Amicon)来进行的阳 离子交换色谱法。
[0043] 色谱法缓冲液为pH 5. 5的IOmM柠檬酸盐缓冲液，并且洗脱通过0至1.0 M的NaCl 梯度来进行。洗脱流速根据柱的大小来调整，例如对于直径为2. 5cm且高度为27cm的柱子， 它为10至15ml/分钟。
[0044] 等电聚隹
[0045] 在Phast-system上，对于从3至9的pH，用Pharmacia公司的即用型凝胶来进行 分析型等电聚焦。用考马斯蓝来进行揭示。
[0046] 在固体介质中的制备型等电聚焦的情况下，将酶溶液逆蒸馏水（95ml)进行透析， 并且与5ml的具有4. 7g Ultrodex凝胶和0. 5g甘氨酸的3-9的两性电解质相混合。将凝 胶在40°C下干燥6小时。在3W的恒定功率下，在整夜或等价的时间段期间进行迀移。用考 马斯蓝来进行揭示。
[0047] 取出各种不同的凝胶条带，用3ml水进行漂洗，过滤，然后用3ml Tris-HCl缓冲液 进行漂洗。
[0048] 然后，就其蛋白水解活性容量和其蛋白质含量来对如此获得的级分进行分析。然 后，将样品逆0.3M Tris-HCKpH 8.0)缓冲液进行透析。
[0049] 在液体介质中的制备型等电聚焦的情况下，将逆蒸馏水进行透析的酶溶液与两性 电解质（3.5ml)相混合。迀移在8W的恒定功率下进行4小时。
[0050] 对所取得的级分进行分析，然后将其逆0. 3M Tris-HCl (pH 8. 0)缓冲液进行透析。
[0051] 上面所指出的实验条件将可根据希望获得的产品的量和在工业条件下的使用来 进行调整。
[0052] 因此，在所述混合物中获得：占多数的具有7.0左右的等电点（pi)的蛋白酶，和以 较少比例，具有8.0左右的pi的蛋白酶。
[0053] 在9ml的体积中获得占多数的pi为大约7. 0的蛋白酶，其中具有0. 49mg/ml的蛋 白质浓度。由于该蛋白酶在其等电点处沉淀，因而关于纯化的特别预防措施可能是必需的。 所获得的溶液具有75, 000A. U. /ml左右的滴度。
[0054] 在均质化后，以4mg的规模