纯化出了该蛋白酶，其具有150, 000A. U. /mg蛋白质的 比活性。
[0055] -个安森单位（A. U.)在此被定义为这样的酶量，其当在25°C下和在pH 7. 5下在 变性血红蛋白存在下温育10分钟时，从该底物中释放出1微克酪氨酸的等价量，这通过对 于用三氯乙酸不可沉淀的滤液的在280nm处的分光光度吸收来测定。
[0056] pi为大约8. 0的蛋白酶与前一种蛋白酶一起被回收，但在更大的体积（例如35ml 的体积）中，并且具有I. 48mg/ml的蛋白质浓度。该溶液的滴度为56, 000A. U. /ml左右。
[0057] 在均质化后，以50mg的规模纯化出了该蛋白酶，其具有38, 000A. U. /mg蛋白质左 右的比活性。
[0058] 上面所描述的经纯化的酶复合物主要包含蛋白酶和其他蛋白质。所进行的纯化和 所采用的电泳技术证明了额外的纯化和没有蛋白水解活性的负载物质的去除。
[0059] 所产生的各种不同蛋白酶可以通过测定其对于蛋白质例如胶原、角蛋白、弹性蛋 白或血红蛋白的活性来更好地进行表征。
[0060] 不幸的是，这些测定是复杂的，因为其缺乏灵敏度和其缺乏特异性。因此需要运用 多种活性测试，其构成了检测方法，主要为安森方法。
[0061] 活性测试：
[0062] 安森测试:
[0063] 该测试使得能够无特异性地测定蛋白水解活性的水平。它在于通过包含在所释放 出的寡肽中的酪氨酸的分光光度法测定来测定变性血红蛋白的水解的水平。
[0064] 用偶氮酪蛋白讲行的测试:
[0065] 该测试在于在440nm处通过分光光度法测定在其上固着有橙色染料的酪蛋白的 水解。该测试不是特异性的。在与酶一起进行温育之后，用三氯乙酸使剩余的偶氮酪蛋白 沉淀。光密度的测量反映了所释放出的肽的存在，因此反映了酶活性。
[0066] 弹性蛋白分解活性测试：
[0067] 用弾件蛋白-刚果红讲行的测试
[0068] 该测试在于在495nm处用分光光度法测定通过在其上固着有红色染料的弹性蛋 白的水解而释放出的经染色的肽的水平。
[0069] 该水平测定的可能问题来自底物的不溶性，因此其灵敏度依赖于底物取样的精确 度、温育介质的搅拌和底物在温育容器的壁上的粘附。
[0070] 所进行的试验显示在活性与酶量之间缺乏线性。确实在活性与温育时间之间观察 到线性，但代表其的直线不通过原点。
[0071] 因此，可以测量两个温育时间（20和40分钟）之间的吸光度差异。用10 μ 1的经 稀释10倍的复合物，测量到〇. 049 μ OD/分钟的变化。因此，本发明的酶复合物确实具有针 对弹性蛋白的蛋白水解活性。
[0072] 用NBA (N-Boc-L-丙氨酸-对硝基苯酚酷）讲行的测试
[0073] 该测试在于在347. 5nm处用分光光度法测定存在于弹性蛋白酶中的酯酶活性 的水平，这通过测定所释放出的对硝基苯酷来进行（Visser L.等人，Biochim, Biophys Acta, 268(1972)207. 260) 〇
[0074] 该水平测定对于弹性蛋白分解活性来说不是特异性的，但它是非常快的（3分钟 的动力学）并且具有良好的灵敏度。
[0075] 这是因为，用50 μ 1的经稀释100倍的复合物，测量到0. 235 μ OD/分钟的变化。因 此，所述酶复合物具有允许对硝基苯酚释放的活性。
[0076] 胶原分解活性测试：
[0077] 用azocoll讲行的测试
[0078] 该测试在于在520nm处用分光光度法测定通过azocoll (经研磨的并且在其上固 着有波尔多红染料的胶原）的水解而释放出的肽的水平（Chavira, Analytical Biochemis try, 136(1984)446-450) 〇
[0079] 该测试具有与弹性蛋白-刚果红（不可溶的底物）相同的缺点，但具有良好的灵 敏度：用50 μ 1的经稀释50倍的复合物，在10分钟的温育之后测量到0. 398的0D。因此， 本发明的酶复合物具有针对azocoll的蛋白水解活性。
[0080] 如此，证实了根据本发明的酶复合物的蛋白水解活性。所述复合物的纯化并不改 变其活性。
[0081] 如此获得的且经表征的蛋白质复合物可用于动物治疗，尤其是作为免疫刺激试剂 和作为派尔淋巴集结的再生试剂，特别是在年老的受试者中。
[0082] 此外，所述酶复合物使得能够在年老的动物（大鼠、鸡等）中使肠绒毛再生，并因 此大大地改善目的营养物的肠吸收。
[0083] 根据本发明的酶复合物主要旨在畜牧学，和更特别地，旨在改善家畜（牛、猪、 羊）、家禽、兔子和鱼以及任何其他单胃动物的饲料。
[0084] 当以从0. 025至lg/kg的剂量掺入到饲料组合物中时，该酶复合物改善了这些动 物的代谢并且有助于确保它们具有更好的健康状况。优选地，引入到饲料组合物中的复合 物的剂量为0.05至0.2g/kg。
[0085] 在成组养殖的情况下，健康状况的保持发挥了重要的作用，因为它避免了由于混 杂或禁闭而引起的疾病传播。如此，明显地降低了由细菌污染引起的养殖型动物的发病率， 尤其是死亡率。
[0086] 基于该酶混合物的饲料组合物包含一种或多种具有营养目的的赋形剂或载体，例 如谷物（小麦、优质小麦、玉米、黑麦、大米、黍、高粱）磨粉、大豆磨粉、糖类（乳糖、甘露 糖）、负载成分（酪蛋白、麸皮、纤维素、纤维素衍生物）和/或矿物成分（白垩、粘土、膨润 土、硅石）以及任何其他在动物营养中所使用的成分。
[0087] 在旋转式滚筒中将这些组合物与复合物进行干法混合直至均匀，或者在流化床中 将以液体形式的（特别地，水性形式的）酶复合物喷雾在饲料组合物上，然后粒化。此类操 作可以在从15°C至60°C的可变温度下进行。
[0088] 因此，更纯的和更具活性的酶复合物的使用使得能够更精确地测定根据本发明的 营养组合物的生物学活性水平，并且确保所获得的结果的令人满意的均一性。
[0089]因此，根据本发明的饲料组合物具有清楚地确定的和非常恒定的酶复合物含量。 [0090] 因此，下面是旨在用于养殖型动物的饲料组合物的几个非限制性实例，所述饲料 组合物包含与具有营养目的的合适的赋形剂或载体相混合的根据本发明的酶复合物。
[0091] 用于家倉的饲料组合物:
[0092] 对于IOkg的批次，通过添加酶复合物制备了组合物：
[0093]
【主权项】
1. 通过培养弗氏链霉菌菌株而获得的包含蛋白酶混合物的酶复合物用于对养殖型动 物的饲料进行补充的用途，其特征在于，在所述混合物的这些蛋白酶之中，一种蛋白酶具有 7. O左右的等电点，和另一种蛋白酶具有8. O左右的等电点。
2. 根据权利要求1的用途，其中等电点为7. O左右的蛋白酶具有大约150, OOO安森单 位/mg蛋白质的比活性。
3. 根据权利要求1的用途，其中等电点为8. 0左右的蛋白酶具有大约38, 000安森单位 /mg蛋白质的比活性。
4. 根据前述权利要求之一的用途，其中所述酶复合物作为饲料补充物用于改善工业养 殖型动物的总体状况，所述饲料补充物以粉末、液体或任何其他适合于与饲料组合物相混 合的形式存在。
5. 根据权利要求4的用途，其中在旋转式滚筒中将以粉末形式的酶复合物与饲料组合 物进行干法混合直至均匀。
6. 根据权利要求4的用途，其中在流化床中将以液体形式的酶复合物喷雾在饲料组合 物上，然后粒化。
7. 根据前述权利要求之一的用途，所述用途是在家禽的饲料中的用途。
8. 根据前述权利要求之一的用途，所述用途是在猪的饲料中的用途。
9. 根据前述权利要求之一的用途，所述用途是在鱼的饲料中的用途。
10. 用于养殖型动物的饲料组合物，其包含根据前述权利要求之一的酶复合物，和任选 地，具有营养目的的赋形剂或载体。
11. 用于制备根据前述权利要求之一的酶复合物的方法，其特征在于，培养弗氏链霉菌 菌株，过滤发酵液，然后着手进行通过超滤和离子交换色谱法以及随后的等电聚焦来提取 酶复合物，和最后将所获得的复合物冻干。
【专利摘要】本发明涉及通过培养弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)菌株而获得的包含蛋白酶混合物的酶复合物用于对养殖型动物的饲料进行补充的用途，在所述蛋白酶混合物中，一种蛋白酶具有7.0左右的等电点，和另一种蛋白酶具有8.0左右的等电点。本发明还涉及包含所述酶复合物的用于养殖型动物的饲料组合物，以及生产该复合物的方法。
【IPC分类】C12P1-04, A23K1-165, C12R1-54, A23K1-18
【公开号】CN104837360
【申请号】CN201380061450
【发明人】多米尼克·霍尔曼
【申请人】多米尼克·霍尔曼, 德尼·霍尔曼, 让-诺埃尔·霍尔曼, 埃尔韦·霍尔曼
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年11月22日
【公告号】CA2834538A1, EP2735235A1, US20140147550, WO2014080094A1