llusnidulans))，XP_001216899. 1(GID:115433524 ; 土曲霉）和 XPJ)01258585. 1 (GID:119473371 ;费氏新萨托）），或者它们的变体，所述变体具有的氨基 酸序列与野生型真菌转葡糖苷酶至少约70%相同，至少约80%相同，至少约85%相同， 至少约90%相同，至少约95%相同，或至少约98%相同。
[0114] 在本发明的一个方面，根据本发明所使用的转葡糖苷酶是具有如在本申请中所 描述的"转葡糖苷酶测试"中所测量的转葡糖苷酶活性的转葡糖苷酶。
[0115] 根据本发明的酶活性测试：
[0116] 细朐壁溶解测试：
[0117] 优选地，利用下面的测试测量麸溶解性。
[0118] 将（0. 1M)-磷酸氢二钠（0. 2M)缓冲液（pH5. 0)中的麦麸悬浮液制备为1. 33 %麸 (w/w)的浓缩液。将750μ1的等分试样在搅拌下从此悬浮液中转移到eppendorph管中。 将各个底物管在40°C下预加热5分钟。向其中加入250μ1酶溶液，使得底物的最终浓度 为1 %。每次测定（0, 30, 60和240分钟），由根据本发明的各个酶组合物制备三种稀释液 (一式两份），其具有增加的酶浓度（例如〇. 33 ;1. 0和3. 0μg酶/克麸）。作为空白，使 用了经热变性的酶组合物溶液。通过将所述管转移到设置为95°C的培养箱中，而在给定的 时间终止反应。将经热变性的样品保持在4°C直至所有的酶反应终止。当所有的酶反应均 被终止时，离心Eppendorph管以获得澄清的上清液。酶溶解麸的能力被表示为还原末端基 团的增加（如使用PAHBAH(Lever，1972)所测定的）。
[0119] 如果所使用的麸含有残留的淀粉，副活性（例如淀粉酶活性）可干扰上述测试， 麸溶解测试应该只在纯化的细胞壁修饰酶（没有淀粉酶活性）上进行。
[0120] 太聚糖酶测试（内切-β-1, 4-太聚糖酶活件）
[0121] 在柠檬酸（0. 1Μ)-磷酸氢二钠（0. 2Μ)缓冲液（pH5. 0)中稀释样品，以在此测试 中获得大约〇D59Q= 0. 7。在40°C将样品的三种不同的稀释液预温育5分钟。在时间=5分 钟时，将1片木聚糖酶（交联的，经染色的木聚糖底物，Megazyme,Bray,爱尔兰）加入lml 反应体积的所述酶溶液中。在时间=15分钟时，通过加入10ml的2%TRIS/NaOH(pH12)而 终止反应。使用1000μ1的缓冲液代替酶溶液而制备空白。离心（1500xg，10分钟，20°C) 反应混合物并且在590nm处测量上清液的0D。一个木聚糖酶单位（XU)被定义为以0.025/ 分钟增加〇D59。的木聚糖酶活性。
[0122] α-淀粉酶活性：
[0123]α-淀粉酶水解a-D-1，4-葡萄糖苷连接，并且其活性可作为淀粉-碘溶液由于 α1，4-D-连接的水解而改变颜色的速率而被检测。
[0124] β-淀粉酶活性：
[0125] β-淀粉酶活性可作为麦芽糖从淀粉溶液的非还原末端的释放而被检测。
[0126] 转葡糖苷酶活性：
[0127] 转葡糖苷酶在用α-D-寡聚葡萄糖温育时催化水解和转移反应。转葡糖苷酶活性 可在用麦芽糖或麦芽糊精温育时作为寡聚异麦芽糖（例如异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖） 的形成而被检测。
[0128] 淀粉脱支活性测试：
[0129] 特异于淀粉中的a-D-1，6葡萄糖苷连接的酶目前包括异淀粉酶（EC3. 2. 1. 68) 和支链淀粉酶（EC3. 2. 1. 41)。作用于淀粉的a-D-1，6葡萄糖苷连接的酶也通过其对支链 淀粉的作用而被分类并且其活性是作为对淀粉和支链淀粉的a-D-1，6葡萄糖苷连接的特 异性水解而被测量的。
[0130] 如本申请中所使用的，术语"脂修饰酶"指能够修饰脂质的任何酶。
[0131] 在一些优选的实施方式中，所述脂修饰酶是脂解酶，例如脂肪酶。
[0132] 如本申请中所使用的，术语"脂解酶"指水解一种或多种来自存在于植物材料（例 如谷物副流）中的脂质的脂肪酸的任何酶，其可引起在所述谷物副流中形成功能性脂质， 这提供了商业价值。贡献最显著的功能性效果的分子是具有乳化剂特征的分子，其为部分 水解产物，例如溶血磷脂，溶血糖脂，和单甘油酯分子。在面包制作中，极性脂水解产物 (例如溶血磷脂和溶血糖脂）是特别有优势的，并且能提供与乳化剂（例如DATEM)等同的 功能。
[0133] 谷物副流中脂肪酶的底物是麸脂，其为极性和非极性脂质的复杂混合物。极性脂 质可被分为糖脂和磷脂。这些脂质是由以两个脂肪酸酯化的甘油和极性基团构成的。所述 极性基团促成这些脂质的表面活性。酶促切割这些脂质中的脂肪酸之一导致具有高得多的 表面活性的脂质。公知的是具有高表面活性的乳化剂（例如DATEM)当被加入食品时是功 能很强的。
[0134] 在生面团产品中使用脂肪酶（E.C. 3. 1. 1.X)可能对酵母活性有有害的影响，和/ 或对面包体积有负面影响。对面包体积的负面影响通常通过过量使用而得到解释。过量使 用可导致面筋弹性的下降，这产生过硬的生面团并因此引起减小的面包体积。此外或备选 地，此类脂肪酶可降解加入生面团中的起酥油、油或乳脂，引起生面团和烘烤产品的异味。 过量使用和异味被归因于生面团中游离脂肪酸的累积。与本发明相关的，这些不希望的影 响可被避免，因为脂肪酶被加入谷物副流（例如作为谷麸悬浮液）中，然后在所述谷麸悬浮 液中生成功能性脂质，其经过或不经过进一步的加工而被用作生面团改良剂。进一步的加 工可以是所述功能性脂质的稀释、纯化。此外，所述功能性脂质可被加工以作为液体产品或 作为干燥配制的产品（例如冻干的产品）而被供应。
[0135] 在EP1193314，EP0977869，TO02/094123，TO00/32758 以及TO01/39602 中，报导了 使用作用于糖脂的脂解酶在面包制作的应用中是特别有益的，因为部分水解产物溶血糖脂 被发现具有非常高的乳化剂功能，这与有害的游离脂肪酸累积相比，显然产生了更高比例 的积极的乳化剂功能。然而，也发现所述酶对于甘油三酯具有显著的非选择性活性，这产 生不必要地高的游离脂肪酸。在面包制作中应用脂肪酶后，向生面团中加入脂肪酶后在所 述生面团中原位生成乳化剂。
[0136] 脂肪酶可以是任何来源的，例如动物来源（例如哺乳动物），例如来自胰 腺（例如牛或猪的胰腺），或者蛇毒或蜂毒。备选地，所述脂肪酶可以是微生物来源 的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如下列属或种：曲霉，例如黑曲霉；盘基网柄菌 (Dictyostelium)，例如盘基网柄菌（D.discoideum);稻痕菌（Magnaporthe)，例如稻痕病 菌（M.grisae);毛霉菌（Mucor)，例如爪唾毛霉（M.javanicus)、高大毛霉（M.mucedo)、 细孢毛霉（Μ·subtilissimus);脉孢菌（Neurospora)，例如粗糙脉孢菌（Ν·crassa); 根毛霉（Rhizomucor)，例如微小根毛霉（R.pusillus);根霉（Rhizopus)，例如无根 根霉（R.arrhizus)、日本根霉（R.japonicus)、葡枝根霉（R.stolonifer);核盘霉 (Sclerotinia)，例如白腐核盘霉（S.libertiana);毛癣菌（Trichophyton)，例如红色毛癣 菌（T.rubrum);维氏盘核菌（Whetzelinia),例如维氏盘核菌（W.sclerotiorum);芽孢杆 菌（Bacillus),例如巨大芽孢杆菌（B.megaterium)、枯草芽孢杆菌（B.subtilis);硝化菌 (Citrobacter),例如梓檬酸杆菌（C.freundii);肠杆菌（Enterobacter),例如产气肠杆菌 (E.aerogenes)、阴沟肠杆菌（E.cloacae)、迟缓愛德华氏菌（EdwardsiellaE.tarda);欧 文氏菌（Erwinia),例如草生欧文氏菌（E.herbicola);埃希氏菌（Escherichia),例如大肠 杆菌（E.coli);克雷伯氏菌（Klebsiella),例如肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae);变形杆 菌（Proteus),例如普通变形杆菌（P.vulgaris);普罗威登菌（Providencia),例如斯氏普 罗威登菌（P.stuartii);沙门氏菌（Salmonella),例如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium); 沙雷氏菌（Serratia)，例如S.liquefasciens,粘质沙雷氏菌（S.marcescens);志贺 氏杆菌（Shigella),例如福氏志贺氏菌（S.flexneri);链霉菌（Streptomyces),例如 S.violeceoruber;耶尔森菌（Yersinia),例如肠炎耶氏菌（Y.enterocolitica)。因此，所 述脂肪酶可以是真菌的，例如来自核菌（Pyrenomycetes)纲，例如镰刀菌（Fusarium)属， 例如大刀镰孢菌（F.culmorum)、异孢镰刀菌（F.heterosporum),前病镰刀菌（F.solani) 的种，或者尖孢镰刀菌（F.oxysporum)的种。磷脂酶也可以来自曲霉属的丝状真菌菌 株，例如泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、臭曲霉（Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、黑曲霉（Aspergillusniger)或米曲霉（Aspergillusoryzae) 菌株。
[0137] 脂解酶的商业上优选的来源是微生物的脂肪酶或酰基转移酶。
[0138] 在一些实施方式中，脂肪酶来自丝状真菌，例如曲霉属的种和镰刀菌属的种。已 发现分离自丝状真菌的脂肪酶具有工业上可应用的特征，并且也发现其在异源性生产系统 (例如米曲霉、瑞氏木霉、镰刀菌和酵母）中表达是常规的。
[0139] 在一些实施方式中，脂肪酶来自如EP1433852中所公开的塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis)，此专利在此通过引用而并入。
[0140] 在一些实施方式中，脂肪酶来自如EP1722636中所公开的异孢镰刀菌（Fusarium heterosporum)，此专利在此通过引用而并入。
[0141] 在一些实施方式中，脂肪酶来自如EP0 130 064中或Hoshino等人（1992) Biosci.Biotech.Biochem56:660-664 中所鉴别的尖抱镜刀菌（Fusariumoxysporum)。
[0142] 在一些实施方式中，脂肪酶是猪胰腺磷脂酶A2,例如在黑曲霉中表达的 (Cakezyme(TM)，DSM)〇
[0143] 在一些实施方式中，脂肪酶是如ΕΡ0 869 167中所描述的，其中公开了克隆和表 达尖孢镰刀菌脂肪酶及其在烘烤中的用途。所述酶被描述为具有磷脂酶活性。此酶现在由 NovozymesA/S(丹麦）作为LipopanF?而销售。
[0144] 在一些实施方式中，脂肪酶是如W0 02/00852中所描述的，其公开了五种脂 肪酶以及它们的编码多核苷酸，分离自F.venenatum,硫色镰刀菌（F.sulphureum)，A. berkeleyanum,大刀镰孢菌（F.culmorum)和前病镰刀菌（F.solani)。所有五种酶被描述 为具有三酰甘油水解活性，磷脂酶和半乳糖脂肪酶活性。所述酶中的三种具有与EP0 869 167中所教导的尖孢镰刀菌酶等同的活性：F.venenatum,硫色镰刀菌，大刀镰孢菌。
[0145] 在一些实施方式中，脂修饰酶是脂解酶变体。产生了具有特定氨基酸置换和 融合的脂解酶变体，与野生型亲本酶相比，其中的一些对于极性脂质具有增强的活性。 W001/39602描述了此类变体，称为SP979,其为嗜热棉毛菌（Thermomyceslanuginosus)脂 肪酶与EP0 869 167中所描述的尖孢镰刀菌脂肪酶的融合。与甘油三酯相比，发现此变体 对磷脂和糖脂具有显著的高活性比率。
[0146] 在一些实施方式中，脂修饰酶为脂质酰基转移酶。
[0147] 如本申请中所使用的，术语"脂质酰基转移酶"指具有脂肪酶活性（根据生物化学 与分子生物学国际联盟命名委员会的酶命名推荐（1992)通常归类为E.C. 3. 1. 1.X)也具有 酰基转移酶活性（通常归类为E.C. 2. 3. 1.X)的酶，从而所述酶能够从脂质向一种或多种 接受者底物转移酰基，所述接受者底物为例如下列的一种或多种：留醇；留烷醇；碳水化合 物；蛋白质；蛋白质亚基；甘油。
[0148] 在一些实施方式中，用于本发明的方法和/用途的脂质酰基转移酶能够从脂质 (如本申请中所定义的）向下列一种或多种酰基接受者底物转移酰基基团：留醇，留烷醇， 碳水化合物，蛋白质或其亚基，或者甘油。
[0149] 对于某些方面，所述酰基接受者可以是任何包含羟基（-0H)的化合物，例如多价 醇（包括甘油）；留醇；留烷醇；碳水化合物；羟基酸（包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗 坏血酸）；蛋白质或其亚基，例如氣基酸，蛋白质水解广物和妝（部分水解的蛋白质）；以及 它们的混合物和衍生物。
[0150] 在一些实施方式中，根据本发明所使用的脂质酰基转移酶所作用的脂质底物是 下列脂质的一种或多种：磷脂，例如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱，三酰甘油，心磷脂，甘油 二酯或糖脂，例如双半乳糖甘油二酯（DGDG)。如本申请中所用的，术语卵磷脂包括磷脂酰 胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
[0151] 对于某些方面，优选地，所述脂质酰基转移酶所作用的脂质底物是磷脂，例如卵 磷脂，例如磷脂酰胆碱或磷脂酰肌醇。
[0152] 在一些实施方式中，所述脂质底物是食品脂质，也就是说食品的脂质组份。
[0153] 合适地，根据本发明所使用的脂质酰基转移酶可显示一种或多种下列脂肪酶活 性：糖脂肪酶活性（E.C. 3. 1. 1. 26)，三酰基甘油脂酶活性（E.C. 3. 1. 1. 3)，磷脂酶A2活性 (E.C. 3. 1. 1. 4)或磷脂酶A1活性（E.C. 3. 1. 1. 32)。如本申请中所使用的，术语"糖脂肪酶 活性"包括"半乳糖脂肪酶活性"。
[0154] 合适地，根据本发明所使用的脂质酰基转移酶可具有至少一种或多种下列活性： 糖脂肪酶活性（E.C. 3. 1. 1. 26)和/或磷脂酶A1活性（E.C. 3. 1. 1. 32)和/或磷脂酶A2活 性（E.C. 3. 1. 1. 4)。
[0155] 对于某些方面，优选地，根据本发明所使用的脂质酰基转移酶能够从糖脂和/或 磷脂向留醇和/或留烷醇转移酰基基团以至少形成留醇酯和/或留烷醇酯。
[0156] 合适的留醇酰基接受者包括胆固醇和植物留醇，例如α_谷留醇，谷甾醇， 豆甾醇，麦角固醇，菜油甾醇，5, 6-二氢甾醇，菜子甾醇，α-菠菜甾醇，β-菠菜甾 醇，y-菠菜留醇，δ菠菜留醇，岩藻留醇，黑海留醇，子囊留醇，serebisterol,表甾醇 (episterol)，anasterol，hyposte;rol，范菜留醇，链留醇，chalinosterol,多孔留醇，穿 贝海绵留醇，留醇糖苷，以及其它天然或合成的异构形式和衍生物。
[0157] 在一个方面，优选地，所述酰基接受者是下列的一种或多种：α-谷留醇，谷 甾醇，豆留醇，麦角固醇，谷留烷醇，ss-谷留烷醇或菜油甾醇。
[0158] 对于某些方面，优选地，根据本发明所使用的脂质酰基转移酶能够从糖脂和/或 磷脂向甘油转移酰基基团以至少形成甘油二酯和/或单甘油酯。
[0159] 对于某些方面，在根据本发明加入脂质酰基转移酶之前或与之同时，存在于含脂 质植物材料中的一种或多种留醇可被转化为一种或多种留烷醇。可采用将留醇转化为甾烷 醇的任何合适的方法。例如，可通过化学氢化作用而进行所述转化。所述转化可在根据本 发明加入脂质酰基转移酶之前进行或者与之同时进行。W000/061771教导了用于将留醇转 化为留烷醇的合适的酶。
[0160] 合适地，可利用本发明来在脂质植物材料中产生植物留烷醇酯。植物留烷醇酯具 有增加的穿过脂膜的可溶性、生物利用率和提高的健康益处（参见例如W092/99640)。
[0161] 用于测宙％酰基转務S每活件的方案：
[0162] 根据本发明向其中加入了脂质酰基转移酶的含脂质植物材料可按照以 CHC13:CH30H2:1进行的酶促反应而被提取，并且分离了含有脂质材料的有机相且根据本申 请下文中详述的过程通过GLC和HPLC进行了分析。由GLC和HPLC分析，测定了游离脂肪 酸和一种或多种留醇/留烷醇酯；碳水化合物酯，蛋白质酯；甘油二酯；或单甘油酯的量。 以相同的方式分析了未向其中加入酶的含脂质植物材料对照。
[0163] 计算：
[0164] 由GLC和HPLC分析的结果，可以计算游离脂肪酸和甾醇/甾烷醇酯和/或碳水化 合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油二酯和/或单甘油酯的增加：
[0165]Δ%脂肪酸=%脂肪酸（酶）-%脂肪酸（对照）；Mv脂肪酸=脂肪酸的平均分子 量；
[0166] Α=Δ%甾醇酯/Mv甾醇酯（其中，Δ%甾醇酯=%甾醇/甾烷醇酯（酶）-%甾 醇/甾烷醇酯（对照）以及Μν甾醇酯=甾醇/甾烷醇酯的平均分子量）_当酰基接受者为 甾醇和/或甾烷醇时适用；
[0167] Β=Δ%碳水化合物酯/Μν碳水化合物酯（其中，Δ%碳水化合物酯=%碳水化 合物酯（酶）_%碳水化合物酯（对照）以及Μν碳水化合物酯=碳水化合物酯的平均分子 量）_当酰基接受者为碳水化合物时适用；
[0168] C=Δ%蛋白质酯/Μν蛋白质酯（其中，Δ%蛋白质酯=%蛋白质酯（酶）-%蛋 白质酯（对照）以及Μν蛋白质酯=蛋白质酯的平均分子量）-当酰基接受者为蛋白质时适 用；以及
[0169] D=甘油二酯和/或单甘油酯/Μν双/单甘油酯的绝对值（其中，△ %甘油二酯 和/或单甘油酯=%甘油二酯和/或单甘油酯（酶）_%甘油二酯和/或单甘油酯（对照） 以及Μν双/单甘油酯=甘油二酯和/或单甘油酯的平均分子量）-当酰基接受者为甘油时 适用。
[0170] 转移酶活性被计算为总酶活性的百分比：
[0172] (*_适当时删除）。
[0173] 在优选的方面，本发明提供含脂质植物材料，其中脂质通过脂解酶的作用被修饰 成为功能性脂质。其可伴有或不伴有所述功能性脂质的纯化而被用作食品成分。
[0174] 合适地，如本申请中所使用的，术语"食物"或"食品"可指随时可被消费的形式 的食品。然而，备选地或此外，如本申请中所使用的，术语食品可指一种或多种用于食品制 备的食物材料。仅以示例的方式，术语食品包括由生面团生产的烘烤产品以及用于制备所 述烘烤产品的生面团。
[0175] 合适地，如本申请中所使用的，术语"食品"指适于人和/或动物消费的物质。
[0176] 另一方面，根据本发明的食品可以是动物饲料。
[0177] 在一些实施方式中，根据本发明所使用的食品选自下列的一种或多种：蛋，基于 蛋的产品，包括但不限于蛋黄酱，沙拉酱，调味料，冰激凌，蛋粉，经修饰的蛋黄以及由 之制作的产品；烘烤产品，包括面包，蛋糕，甜的生面团产品，分层的生面团，液体面糊， 松饼，甜甜圈（doughnut)，饼干，薄脆饼干和小饼（cookies);糖果，包括巧克力，糖，焦 糖，halawa，口香糖（包括无糖和加糖增甜的口香糖，泡泡糖，软泡泡糖，咀嚼口香糖） 和布丁；冷冻产品，包括雪糕，优选冷冻的乳制品，包括冰激凌和冰牛奶；乳制品，包括奶 酪，黄油，牛奶，咖啡奶（coffeecream),生奶油，乳蛋糕乳脂（custardcream),奶饮品 和酸奶，慕斯，搅打的植物奶油（whippedvegetablecream);