一种海参功能保健品及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种海参功能保健品及其制备方法，其是以海参冻干粉、牛磺酸、维生素E为主要原料，根据现代医学和传统中医学理论相结合而组方。海参冻干粉补肾经、益精髓，且富含可促进合成免疫物质的蛋白质、氨基酸，提高机体免疫功能；牛磺酸、维生素E也有提高免疫力的功效；本发明选取的原料来源广泛，质量可靠、价格实惠，而且实施例的大量研究实验证明，其对机体免疫功能有良好的增强作用。和其他同类保健食品相比，具有一定的综合优势。
【专利说明】
一种海参功能保健品及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于功能食品技术领域，具体涉及一种能够提高人体免疫力的海参功能保 健品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 现在人的身体素质越来越差，亚健康的状态越来越多。提高抵抗力是现代每一个 人关心的话题，亚健康的主要特征包括:①身心上不适应的感觉所反映出来的种种症状，如 疲劳、虚弱、情绪改变等，其状况在相当时期内难以明确;②与年龄不相适应的组织结构或 生理功能减退所致的各种虚弱表现;③微生态失衡状态;④某些疾病的病前生理病理学改 变。
[0003] 临床表现多种多样，躯体方面可表现为疲乏无力、肌肉及关节酸痛、头昏头痛、心 悸胸闷、睡眠紊乱、食欲不振、脘腹不适、便溏便秘、性功能减退、怕冷怕热、易于感冒、眼部 干涩等；心理方面可表现有情绪低落、心烦意乱、焦躁不安、急躁易怒、恐惧胆怯、记忆力下 降、注意力不能集中、精力不足、反应迟钝等;社会交往方面可表现有不能较好地承担相应 的社会角色，工作、学习困难，不能正常地处理好人际关系、家庭关系，难以进行正常的社会 交往等。
[0004] 世界卫生组织早已证实，反复感冒是免疫力低下的一种表现。换句话说，如果一个 人在一年内感冒超过5次，抵御各种重大疾病的能力就比正常人降低80%，这类人群还会伴 随着一些其他的慢性疾病。中国70%以上的人都处于亚健康状态，由于工作压力的增大，营 养的失衡、污染的加重等因素，导致机体免疫力普遍降低，从而成为各种亚健康状态的潜 因。免疫力是人体抵抗疾病与治疗疾病的基础，免疫力低下可引发多种疾病，如感冒，肝炎， 甚至肿瘤等。
[0005] 根据我国血脂异常治疗现状的调查分析，我国高脂血症患者的年龄主要在40~80 岁之间，其中60~69岁占40.9%，在伴随疾病中，高血压最常见，占60.6%;冠心病其次，占 45.1 %，糖尿病32.8%，脑卒中13.7%。高脂血症患病率主要表现为经济发达地区高于经济 不发达地区，一些人群高胆固醇和高低密度脂蛋白的患病率超过30%，有的甚至超过50%。
[0006] 导致上述亚健康状况的主要原因有很多，包括:饮食不合理、缺乏运动、作息不规 律、睡眠不足、精神紧张、心理压力大、长期不良情绪等。因此，现代社会中，越来越多的人为 了让自己更快的远离亚健康状态选购提高抵抗力的保健品。保健品已经成为现代人提高抵 抗力的一个很重要的手段；
[0007]通常情况下，目前市场上的保健品，主要分为几大类：以维生素和矿物质为主要成 分的营养型保健品；以天然或珍贵植物为原料，提取出有效营养成分的保健品；以名贵中药 或有药用价值的动植物为主要原料的补养型保健品；从海洋生物中提取有效成分制成的保 健品；以动物初乳为原料制成的保健品；以"第七营养素"一一膳食纤维为主的保健品；纯天 然，不含任何添加剂的一一氨基酸为主的保健品。而各类保健品因为原料和加工方式不同， 因此有其各自的特点和应用的局限性，为了丰富日益多元化的市场需求，丰富保健品种类， 本发明提供一种新型保健品。
【发明内容】
[0008] 本发明以海参冻干粉、牛磺酸、维生素 E为主要原料，根据现代医学和传统中医学 理论相结合而组方。具体的，本申请所述能够提高人体免疫力的海参功能保健品的制备方 法如下：
[0009] 1、海参冻干粉:将海参进行清洗、去杂后，将海参经过多级酶解、离心、超滤处理后 直接真空冷冻干燥。
[0010] 具体方法:将进行清洗、去杂后的海参研磨成细浆状，按照海参与水1:(0.5-3)的 质量比混匀，过100-200目筛网后，依次利用海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶进行三级 降解。将酶解液通过离心去除不溶物，再进行超滤处理，得到海参水溶液，通过真空浓缩后， 最后进行真空冷冻干燥得到海参冻干粉。
[0011] 2、按照海参冻干粉：牛磺酸:维生素 E的质量比为= (180-220) :(30-40) :(10-30) 的比例进行充分混合搅拌；
[0012] 3、将步骤2所得的海参冻干粉、牛磺酸粉、维生素 E混合物经40-100目过筛后，置混 合机中混合30min，得混合粉，混合粉应色泽均匀一致，进行装囊、包装为成品。
[0013] 具体的，上述技术方案中，步骤1)中所述将海参经过多级酶解的具体方法为:将海 参研磨成细衆状，按照海参与水1: (0.5-3)的比例进行混匀，过100-200目筛网后，依次利用 海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶进行三级降解。
[0014] 具体的，上述技术方案中，所述海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的使用条件 为:海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶分别在40°(：、45°(：、55°(：进行三级降解，所述海参 自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的使用量分别为:0.1 -2 %、0.1-0.6 %、0.02-0.07 %的质 量比。
[0015] 具体的，上述技术方案中，步骤1)中所述的离心条件为：将酶解液通过3000-1000 Orpm离心 10-40min。
[0016] 具体的，上述技术方案中，步骤1)中所述的海参是鲜活海参、干海参、盐渍海参中 的一种，且蛋白质含量大于50%。
[0017] 本发明的另一方面在于，保护一种利用上文所述的方法制备获得的海参功能保健 品，色泽均匀一致，且为灰褐色粉末。以及一种利用上文所述的保健品在提高人体免疫力方 面的应用。本发明所述方法中海参为经过消化处理的水溶性物质，蛋白质以及多种活性成 分非常容易被人体消化吸收，并在酶解过程中形成一些短肽等活性物质。将不好吸收的海 参转变成极易消化吸收的海参水溶液，再配以牛磺酸以及维生素 E，通过本发明实施例4的 功能试验证明，海参的营养物质得到了有效的利用，且牛磺酸、维生素 E与海参营养成分的 配合使用达到了更好的协同效果，该产品具有极强的保健功能。
【具体实施方式】
[0018] 下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。
[0019] 本发明实施例1~3所用的原料如无特殊说明均可以由常规方法制备或者商业途 径购买获得，其中：
[0020]牛磺酸:应符合GB14759食品安全国家标准食品添加剂牛磺酸的质量要求。
[0021]维生素 E:应符合GB29942食品安全国家标准食品添加剂维生素 E(dl-a-生育酚）的 质；
[0022]海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶分别可以由商业途径购买获得。
[0023] 所述的海参是鲜活海参、干海参、盐渍海参中的一种，且蛋白质含量大于50%。 [0024] 实施例1
[0025] 1、海参冻干粉:将鲜活海参进行清洗、去杂后，将海参经过多级酶解、离心、超滤处 理后直接真空冷冻干燥。
[0026] 具体方法:将进行清洗、去杂后的海参用胶体磨将海参进行研磨打成细浆状，按照 海参与水1:1的比例进行混匀，过100目筛网后，依次利用海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋 白酶分别在40°(：、45°(：、55°(：进行三级降解。将酶解液通过离心去除不溶物后，进行超滤处 理，得到海参水溶液，通过真空浓缩后，最后进行真空冷冻干燥得到海参冻干粉。
[0027] 所述海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的使用量分别为:0.1%、0.1%、0.02% 的质量比。将酶解液的离心条件为:3000rpm离心40min;
[0028] 2、按照海参冻干粉:牛磺酸:维生素 E的质量比为180: 30:10的比例进行充分混合 搅拌；
[0029] 3、将步骤2所得的海参冻干粉、牛磺酸粉、维生素 E混合物经40-100目过筛后，置混 合机中混合30min，得混合粉，混合粉应色泽均匀一致，进行装囊、包装为成品。样品核准净 含量为0.25g/粒。胶囊内容物为灰褐色粉末。人体推荐剂量为：1.5g/60kgBW，置阴凉、干燥 处保存，保存期24个月。
[0030] 实施例2
[0031] 1、海参冻干粉:将干海参进行清洗、去杂后，将海参经过多级酶解、离心、超滤处理 后直接真空冷冻干燥。
[0032]具体方法:将进行清洗、去杂后的海参用胶体磨将海参进行研磨打成细浆状，按照 海参与水1:2的比例进行混匀，过150目筛网后，依次利用海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋 白酶分别在40°(：、45°(：、55°(：进行三级降解。将酶解液通过离心去除不溶物后，进行超滤处 理，得到海参水溶液，通过真空浓缩后，最后进行真空冷冻干燥得到海参冻干粉。
[0033] 所述海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的使用量分别为：1%、0.3%、0.05%的 质量比。将酶解液的离心条件为:5000rpm离心20min;
[0034] 2.按照海参冻干粉:牛磺酸:维生素 E的质量比为200: 35:15的比例进行充分混合 搅拌。
[0035] 3、将步骤2所得的海参冻干粉、牛磺酸粉、维生素 E混合物经40-100目过筛后，置混 合机中混合30min，得混合粉，混合粉应色泽均匀一致，进行装囊、包装为成品。样品核准净 含量为0.25g/粒。胶囊内容物为灰褐色粉末。人体推荐剂量为：1.5g/60kgBW。置阴凉、干燥 处保存，保存期24个月。
[0036] 实施例3
[0037] 1、海参冻干粉:将盐渍海参进行清洗、去杂后，将海参经过多级酶解、离心、超滤处 理后直接真空冷冻干燥。
[0038]具体方法:将进行清洗、去杂后的海参用胶体磨将海参进行研磨打成细浆状，按照 海参与水1:3的比例进行混匀，过200目筛网后，依次利用海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋 白酶分别在40°(：、45°(：、55°(：进行三级降解。将酶解液通过离心去除不溶物后，进行超滤处 理，得到海参水溶液，通过真空浓缩后，最后进行真空冷冻干燥得到海参冻干粉。
[0039] 所述海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的使用量分别为:2%、0.6%、0.07%的 质量比。将酶解液的离心条件为：1000 rpm离心10min;
[0040] 2、按照海参冻干粉:牛磺酸:维生素 E的质量比为220:40: 20的比例进行充分混合 搅拌。
[0041 ] 3、将步骤2所得的海参冻干粉、牛磺酸粉、维生素 E混合物经40-100目过筛后，置混 合机中混合30min，得混合粉，混合粉应色泽均匀一致，进行装囊、包装为成品。样品核准净 含量为0.25g/粒。胶囊内容物为灰褐色粉末。人体推荐剂量为：1.5g/60kgBW，置阴凉、干燥 处保存，保存期24个月。后文实施例4中样品名称简述为海参牛磺酸维生素 E胶囊。
[0042] 实施例4
[0043] 一.实验材料
[0044] 选用北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK-(京）2009-0007]繁殖的 18~22g昆明种健康清洁级雌性小鼠192只，共分为四批进行试验，每批随机分为4组，每组 12只。实验一批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、半数溶血值(HC 5q)的测定和 抗体生成细胞数的测定;实验二批进行碳廓清实验;实验三批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 鸡红细胞实验；实验四批进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定。实验 动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF级动物室，实验动物使 用许可证号：SYXK(京）2007-0020。基础饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证 号:SCXK-(京)2009-0008 ]生产。
[0045]剂量：推荐剂量为相当于为成人（按60kg体重计）每日1.5g，相当于0.025g/日/ 1^81。实验分别涉人体推荐量的5、10、30倍，即每日：0.128/1^81、0.258/1^81和0.758/1^8￥ 为低、中、高剂量组。受试物用无菌水配制。每日一次经口给予受试物，连续灌胃33天后测各 项指标。小鼠灌胃体积为〇.l〇mL/10g鼠重。同时设一溶剂对照物(Og/kgBW)，用无菌水代替 受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。各剂量组均给予基础饲料。
[0046]本发明实施例4的数据处理方式为：
[0047]用SPSS软件进行数据处理。采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐 性检验，方差齐，计算F值，F值〈F0.05，结论：各组均数间差异无显著性;F值多FO . 05，PS 0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐 的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计;若变 量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
[0048] 二.实验方法
[0049] 1.脏器体重比值的测定
[0050]小鼠称重后颈椎脱白处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污， 称重，计算脾脏体重比值和胸腺体重比值。
[0051 ]海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠体重的影响 [0052] 表1各组小鼠的初始体重（[±SD丨
[0056] 由表1可见，小鼠的初始体重在四批实验动物各剂量组与Og/kgBW组间比较，差异 均无显著性(P>〇.05)。即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。
[0057] 表2海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠体重的影响（[±SD)
[0060]由表2可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，小鼠的体 重在四批各剂量组与Og/kgBW组间比较，差异均无显著性(P>0.05)。即海参牛磺酸维生素 E 胶囊对小鼠体重无不良影响。
[0061 ]海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠脏器/体重比值的影响
[0062] 表3海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠脾脏/体重比值的影响（i±SD)
[0064] 由表3可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，各剂量组 脾脏/体重比值与Og/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。即海参牛磺酸维生素 E胶囊对 小鼠的脾脏/体重比值无特别影响。
[0065] 表4海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠胸腺/体重比值的影响（^±SD)
[0067]由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，各剂量组 胸腺/体重比值与Og/kgBW组比较，差异均无显著性(P>0.05)。即海参牛磺酸维生素 E胶囊对 小鼠的胸腺/体重比值无特别影响。
[0068] 2迟发型变态反应(DTH)实验(足跖增厚法）
[0069] 取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2% (v/v，用生理盐水配制）压积 SRBC(2000r/min，10min)0.2mL，致敏后4d，测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平 均值。然后在测量部位皮下注射20% (v/v，用生理盐水配制)压积SRBC20yL，于注射后24h测 量足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于 对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
[0070] 表5海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响(iSEO
[0072] 与Og/kgBW组比较有显著性差异
[0073]由表5可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，0.25g/ kgBW和0.75g/kgBW组与Og/kgBW组比较，足跖肿胀度有显著性差异(P〈0.05)。即海参牛磺酸 维生素 E胶囊在0.25g/kgBW和0.75g/kgBW组均能提高小鼠的迟发型变态反应能力。
[0074] 3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法）
[0075]无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单 个细胞悬液。经200目筛网过滤，制成细胞悬液。用Hank's液洗3次，每次离心10min(1000 r/ min)。然后将细胞悬液于ImL的完全培养液中，镜检计数，调整细胞浓度为3 X 106个/mL。再 将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，没孔ImL，在其中一孔加75μΙΧ〇ηΑ液(相当于7.5μ g/ml)，另一孔作为对照，置5 % C02，37 °CC02孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去 上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT (5mg/mL) 50yL/孔。 继续培养4h。培养结束后，每孔加入ImL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后 将此液体移入比色杯中，在755分光光度计上比色测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用 加 ConA孔的光密度值减去不加 ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。受试样品组的 光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
[0076]表6海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠淋巴细胞转化实验的影响（kSD )
[0078] *:与Og/kgBW组比较有显著性差异
[0079]由表6可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，0.75g/ kgBW组与Og/kgBW组比较，淋巴细胞的增殖能力有显著性差异(？〈0.01)。即海参牛磺酸维生 素 E胶囊在0.75g/kg BW组能提高小鼠的淋巴细胞增殖能力。
[0080] 4抗体生成细胞数的测定(Jerne改良玻片法）
[0081] 取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2% (v/v，用生理盐水配制）压积 SRBCO. 2mL。将SRBC免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬 液。离心（l〇〇〇r/min) IOmin，用Hank ' s液洗2遍，最后将细胞悬浮在8mLHank' s液中。将琼脂 糖加热溶解后，与等量双倍浓度的Hank' s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10% (v/v，用SA液配制）压积SRBC50yL，脾细胞悬液SyL，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的 玻片上，做平行片，待琼脂凝固后将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中37°C温 育Ih，然后用SA缓冲液稀释的补体（1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h，计数溶血空 斑数。用空斑数/全脾细胞来表示。受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定 该项实验结果阳性。 rnnR?l 串7·矣Φ硫酿維生麦F.防壺对Α??
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[0084] *:与0g/kgBW组比较有显著性差异
[0085] 由表7可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，0.75g/ kgBW组与0g/kgBW组比较，抗体生成细胞数有显著性差异(P〈0.05)。即海参牛磺酸维生素 E 胶囊在〇. 75g/kgBW组能提高小鼠的抗体生成细胞数。
[0086] 5半数溶血值(HC50)的测定
[0087] 取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2% (v/v，用生理盐水配制）压积 SRBC0.2mL进行免疫。5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约lh，将凝固血与管壁剥离，使 血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为300倍，取ImL置 试管内，依次加入10 % (v/v，用SA缓冲液配制）压积SRBCO. 5mL，补体ImL(用SA缓冲液按1:8 稀释）。另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）。置37°C恒温水浴中保温15min后，冰浴终 止反应。2000r/min离心10min，取上清lmL，加都氏试剂至3mL。同时取10% (v/v，用SA缓冲液 配制）压积SRBCO. 25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混勾，放置IOmin后，于540nm 处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式 计算：
[0088]样品半数溶血值=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值X稀释倍数 [0089] 受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50,可判定该项实验结果阳性。
[0090]表8海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠半数溶血值(HC5q)的影响（SzbSD )
[0092] 与Og/kgBW组比较有显著性差异
[0093]由表8可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，0.75g/ kgBW组与Og/kgBW组比较，半数溶血值有显著性差异(P〈0.05)。即海参牛磺酸维生素 E胶囊 在0.75g/kgBW组能提高小鼠的半数溶血值。
[0094] 6小鼠碳廓清实验
[0095] 按体重从小鼠尾静脉注射4倍的印度墨汁(0.05mL/10g)。待墨汁注入，立即计时。 注入墨汁后2、IOmin，分别从内眦静脉丛取血20yL，并将其加到2mL0.1 %Na2CO3溶液中。用 755分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na 2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取 肝脏和脾脏称重。以碳廓清指数(a)表示小鼠碳廓清的能力按下式计算a:
[0096] k= (lgODi_lgOD2)/(t2-ti)
[0097] a =体重+ (肝重+脾重）Xk1/3
[0098] 受试样品组的碳廓清指数显著高于对照组的碳廓清指数，可判定该项实验结果阳 性。
[0099] 表9海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠碳廓清能力的影响(g±SD)
[0102] 与Og/kgBW组比较有显著性差异
[0103]由表9可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，0.25g/ kgBW组与Og/kgBW组比较，碳廓清吞噬指数有显著性差异(P〈0.05); 0.75g/kgBW组与Og/ kgBW组比较，碳廓清吞噬指数有显著性差异(P〈0.01)。即海参牛磺酸维生素 E胶囊在0.25g/ kgBW和0.75g/kgBW组均能提高小鼠的碳廓清能力。
[0104] 7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法）
[0105] 小鼠腹腔注射20%(v/v，用生理盐水配制）鸡血细胞(2000r/min，10min)悬液lmL， 间隔30min，颈椎脱臼处死，将其仰位固定于鼠板上，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板 lmin。取腹腔巨噬细胞洗液mL，分别滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37 °(：孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1:1丙酮甲醇溶液 固定，4% (v/v)Gicmsa-磷酸缓冲液染色再用蒸馏水漂洗瞭干。油镜下计数，每片计数100个 巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
[0106] 吞噬百分率（％ )=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的吞噬细胞X 100
[0107] 吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
[0108] 得出的吞噬百分率再按下式进行数据转换，X = sin-lVp，式中P为吞噬百分率，用 小数表示。所得数据为计量资料，受试样品组的吞噬百分率和吞噬指数均显著高于对照组 的吞噬百分率和吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。
[0109] 表10海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率的影响 (x+SD)
[0111] 与Og/kgBW组比较有显著性差异
[0112] 由表10可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，0.75g/ kgBW组与Og/kgBW组比较，小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率有显著性差异斤〈0.01)。即海 参牛磺酸维生素 E胶囊在0.75g/kgBW组能提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率。
[0113] 表11海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响 C x±SD)
[0115] 与Og/kgBW组比较有显著性差异
[0116] 由表11可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，0.75g/ kgBW组与Og/kgBW组比较，小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数有显著性差异(P〈0.0 l)。即 海参牛磺酸维生素 E胶囊在0.75g/kgBW组能提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数。
[0117] 8. NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶LDH测定法）
[0118] 实验前24h将靶细胞YAC-I进行传代培养，应用前以Hank's液洗3次，用含10%小牛 血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4X105个/mL。受试小鼠颈椎脱白处死，无菌取 脾，制成脾细胞悬液，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)。弃上清液将细胞浆弹 起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank ' s液及8mLHank ' s液，1000 r/ min，IOmin离心，用ImL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，镜检计数，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为2 X 107个/mL。使效靶比为50:1。取靶细胞和效应细胞各100yL， 加入U形96孔培养板中；祀细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100yL，靶细胞最大释放孔 加靶细胞和1 % NP40各IOOyL;上述各项均设三个平行孔，37 °C、5 % C02培养箱中培养4h，将 96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清IOOyL置平底96孔培养板中，加入LDH基质液 IOOyL，反应3-10min，然后每孔加入lmol/L的HCl溶液30yL终止反应，在酶标仪490nm处测光 密度值(OD)，计算NK细胞活性。
[0119] NK细胞活性（％ )=(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔0D) X 100
[0120] 得出的NK细胞活性按下式进行数据转换，X = sin-1 V p，式中P为NK细胞活性，用小 数表示。所得数据为计量数据，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可 判定该项实验结果阳性。
[0121] 表12海参牛磺酸维生素 E胶囊对小鼠 NK细胞活性的影响（^±SD)
[0123] 由表12可见，经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊33天后，各剂量组 NK细胞活性与0g/kgBW组比较，差异均无有显著性(P>0.05)。即海参牛磺酸维生素 E胶囊对 小鼠 NK细胞活性无影响。
[0124] 综上，实施例4的所有实验结果判定依据为：
[0125] 《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)规定:在细胞免疫功能、体液免疫功能、 单核一巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果呈阳性，可判定该受试样品具 有增强免疫力功能作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一 个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项 目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功 能测定结果阳性。单核一巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实 验的两个剂量组结果阳性，可判定单核一巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的 一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。
[0126]实施例4的所有实验结果证明：经口给予小鼠不同剂量的海参牛磺酸维生素 E胶囊 33天后，与Og/kgBW组比较，该受试物在0.25g/kgBW组能提高小鼠迟发型变态反应能力(P〈 〇 · 05)，提高小鼠的碳廓清能力(P〈0 · 05)。在0 · 75g/kgBW组能提高小鼠迟发型变态反应能力 (P〈0.05);提高小鼠的淋巴细胞增殖能力(P〈0.01);提高小鼠的抗体生成细胞数(P〈0.05)， 提高小鼠的半数溶血值(P〈〇. 05)，提高小鼠的碳廓清能力(P〈0.01 )，提高小鼠巨噬细胞吞 噬鸡红细胞吞噬率(P〈〇.01)和吞噬指数(P〈〇. 01)。且受试物对小鼠体重增长无不良影响， 根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)对增强免疫力保健食品的判定标准可知，海 参牛磺酸维生素 E胶囊增强免疫力功能动物实验结果阳性。
【主权项】
1. 一种海参功能保健品的制备方法，其特征在于： 1) 海参冻干粉的制备:将海参进行清洗、去杂后，将海参经过多级酶解、离心、超滤处理 后真空冷冻干燥； 2) 按照海参冻干粉：牛磺酸：维生素 E的质量比为（180-220): (30-40): (10-30)的比例 进行混合； 3) 将步骤2)所得的海参冻干粉、牛磺酸粉、维生素 E混合物经40-100目过筛后，置混合 机中混合30min，得混合粉。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤1)中所述将海参经过多级酶解的 具体方法为:将海参研磨成细浆状，按照海参与水1: (〇. 5-3)的比例进行混匀，过100-200目 筛网后，依次利用海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶进行三级降解。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋 白酶的使用条件为:海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶分别在40 °C、45 °C、55 °C进行三级 降解，所述海参自溶酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的使用量分别为，按质量比0.1-2%、0.1_ 0·6%、0·02-0·07%〇4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤1)中所述的离心条件为:将酶解 液通过3000-1 OOOOrpm离心 10_40min。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤1)中所述的海参是鲜活海参、干 海参、盐渍海参中的一种，且蛋白质含量大于50 %。6. 利用权利要求1所述的方法制备获得的海参功能保健品，色泽均匀一致，且为灰褐色 粉末。7. 利用权利要求6所述的保健品在提高人体免疫力方面的应用。
【文档编号】A61K31/185GK105942286SQ201610273191
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】王海东, 焦健
【申请人】北京同仁堂健康（大连）海洋食品有限公司