治疗葡萄球菌感染的组合物和方法

专利名称：治疗葡萄球菌感染的组合物和方法
技术领域：
本发明属于一种治疗哺乳动物，包括人类葡萄球菌感染的方法。这种方法包括将剪切葡萄球菌细胞壁肽聚糖的含甘氨酸的肽交联键的溶葡萄球菌酶或者其他物质，以及抗生素同时给药，这种抗生素的抗菌能力是通过其作用于靶葡萄球菌的细胞壁的能力而引发的。这种联合给药可以有效治疗葡萄球菌感染，同时抑制对抗溶葡萄球菌酶或其它肽聚糖活化剂的菌株的形成。
背景技术：
溶葡萄球菌酶是一种由分离的并最初命名为溶葡萄球菌葡萄球菌(现为S.simulans)的葡萄球菌株分泌的细菌素。美国专利3,278,378描述了葡萄球菌素的生产。溶葡萄球菌酶是一种肽链内切酶，它剪切存在于葡萄球菌细胞壁上的肽聚糖聚甘氨酸交联键。美国专利3,398,056和3,594,284描述了对适于溶葡萄球菌酶生产的培养基和接种技术的改善。
美国专利4,931,390已经测序和克隆了源于S.simulans的溶葡萄球菌酶基因。已经通过B.sphaericus的非致病重组菌株的发酵生产出用作实验室试剂的溶葡萄球菌酶，由这种方法得到的溶葡萄球菌酶易于纯化。溶葡萄球菌酶基因的克隆和测序允许分离具有类似或不同于溶葡萄球菌酶野生种的性能的酶的变种。这样一种经改变的酶，具有单一氨基酸的改变，已显示在体外和在动物感染模型中具有有效的抗葡萄球菌活性。本文结合参考于1998年7月21日提交的系列号为09/120,030的美国专利申请。其它的溶葡萄球菌酶类似物，包括这种类型的天然产生的酶，已经被当成能够解决难题的有效剂，用以治疗由葡萄球菌感染引起的细菌性疾病。其它具有相关活性的肽酶是公知的。因而，Kessler.等人在生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2687503-08(1993)报道的和Li等人在生物化学杂志(J.Biol.Chem.)122772-778(1997)分别报道的lasA蛋白酶和无色肽酶(achromopeptidase)，由于它们对在肽聚糖细胞壁成分中的含甘氨酸交联键的消化，而具有抗葡萄球菌活性。这些药剂可用于本发明中代替溶葡萄球菌酶。
然而，溶葡萄球菌酶作为一种治疗葡萄球菌感染的有效抗生素的发展受阻于一个对于抗生素给药普遍的问题，葡萄球菌突变种的耐抗生素菌株日益发展。已经证实了许多种葡萄球菌感染对先前治疗所选择的各种抗生素耐受，包括抗二甲氧苯青霉素(称为MRSA的抗金黄色葡萄球菌二甲氧苯青霉素)和抗万古霉素菌株(称为VISA)。同样也记录了并非由敏感的葡萄球菌显示的对各种其它抗生素的耐受性。Stranden.等人在细菌学杂志(J.Bacteriology)179(1)9-16(1997)详细讨论了MRSA以及耐受其它抗生素的菌株。遇到了进一步的难题，即MRSA趋于蓄积各种其它的耐受性。人类疾病中的葡萄球菌TheStaphylococci In Human Diseases，158-174(Grossley，等人，1997编辑)一书中记载通常以万古霉素治疗耐受多种抗菌素的MRSA。万古霉素自身可能是有毒的。另外，在葡萄球菌感染中近来已经发现了万古霉素的耐受性。
耐受抗生素的传染物(antibiotic-resistant infectious agents)-例如葡萄球菌-连续发展引起的问题远超过治疗任何一个单个患者所包括的问题。通俗的出版物以及科学期刊已经提示由于不加选择地使用抗生素或过量使用，使耐药性菌株令人惊恐地增长。每当以抗生素治疗个体时，无论不必要地或合理地使用抗生素，对抗具体治疗的耐药性菌株出现的机率将升高。在许多医院葡萄球菌耐药性菌株变得地方性，当病人入院并感染此病菌后，就产生了对因患其它疾病而已虚弱的患者的一种胁迫生命的危险。
各种论文已经记载了对溶葡萄球菌酶或β-内酰胺，例如二甲氧苯青霉素的耐受性的发展，以及它们之间的联系。从而，DeHart.等人，应用环境微生物学(Applied Environmental Microbiology)61，1475-1479(1995)记载了突变异种金黄色葡萄球菌重组细胞的发展，它对溶葡萄球菌酶耐受，但是易受二甲氧苯青霉素的影响。Zygmunt.等人，Can.J.Microbio.13，845-852(1966)，Polak.等人，微生物感染疾病的诊断(Diagn.Microbiol.Infet.Dis.)17265-270(1993)和Dlckson.等人，耶鲁生物医学杂志(Yale J.Bio.Med.)4162-67(1968)报道了同样的现象。每篇参考文献，以及后来的报道，例如Ehlert，细菌学杂志(J.Bacteriology)，1797573-7576(1997)，均阐明抗溶葡萄球菌酶的葡萄球菌，或者自发地或者通过诱导重组，变得易受二甲氧苯青霉素治疗的影响，反之亦然。在所有的这些参考文献中，一致的意见是在溶葡萄球菌酶给药疗程之后，甚至在短时间内，给予二甲氧苯青霉素。
美国专利5,760,026，因此一般选定，采用乳房内注入溶葡萄球菌酶这一特定方法治疗乳腺炎。该专利文献通过表ID和其它的论述报道，基于体外试验，溶葡萄球菌酶和β-内酰胺联合治疗乳腺炎时协同结果是可预见的。牛乳腺炎模型抗生素体内给药不是可预测的，反映哺乳动物例如人体内给药的环境或模型并未证实美国专利5,760,026报道的协同作用。
本领域熟练技术人员会意识到存在许多种葡萄球菌菌株。许多抗常规的抗生素，而不同于敏感的菌株。金黄色葡萄球菌菌株被认为是非常致命的和严重的全身感染的最普遍的单一病因。凝血酶-阴性葡萄球菌种，尽管通常比金黄色葡萄球菌更少侵略性，现在是形成感染高发生率的主要原因；特别对于疲惫不堪的或者免疫损伤病人更是如此。伴随心脏瓣膜置换而产生的心内膜炎即是一个此类感染的例子。这不过是种种难治的由于广泛使用抗生素而日益增长的葡萄球菌感染中的一种。
于是，需要发展一种方法，通过给予抗生素可有效治疗甚至抗药性葡萄球菌对哺乳动物(包括人)所致的感染，这是本领域普通技术人员的一个目的。希望发展这种方法，以抑制对使用的抗生素耐药的菌株的形成。
发明概述以上目的和以下阐明的其它目的，是通过抗葡萄球菌剂-例如溶葡萄球菌酶或其它通过剪切葡萄球菌细胞壁肽聚糖中含有甘氨酸的交联键而引发活性的药剂，与抗生素或通过其作用于葡萄球菌细胞壁的能力引发活性的抗菌剂，同时给药来实现。这些细胞壁活性剂包括β-内酰胺和糖酞。优选地，细胞壁活性抗生素是β-内酰胺。
对模型通过体外或体内同时给予由剪切含有甘氨酸的交联键来引发活性的抗葡萄球菌剂和细胞壁活性抗生素，未获得任何显著的协同作用，对于哺乳动物抗生素的体内给药具有可预测的优点。实际上，本领域的普通技术人员会意识到对于抗药性葡萄球菌，例如MRSA，给予任何量的二甲氧苯青霉素在治疗上并不是有效的。令人惊奇地，申请人已经发现，通过剪切含甘氨酸的交联键而引发活性的抗葡萄球菌剂-例如溶葡萄球菌酶，和细胞壁活性抗生素的联合给药，不仅能有效地治疗感染，而且抑制对剪切含甘氨酸的交联键而引发活性的抗葡萄球菌剂具有抗药性的葡萄球菌的形成。
当然申请人并不希望局限于此解释，它显示自发突变通常有效地使葡萄球菌产生溶葡萄球菌酶耐受性，但也使得对细胞壁活性抗生素-例如二甲氧苯青霉素具有同样高的易敏感性。即使在该生物体开始是抗二甲氧苯青霉素的情况下这也是真的。两者同时给药显示在同时根除感染和抑制新药性菌株的产生上具有一致效果。明确地，抗葡萄球菌剂如溶葡萄球菌酶剪切含甘氨酸交联键。对抗此攻击的突变使得先前的抗药性菌株对细胞壁活性抗生素敏感。
本发明详述本发明包括能够有效治疗葡萄球菌感染的药物组合物的给药，该组合物包括至少两种活性成分，一种药剂如溶葡萄球菌酶，它剪切葡萄球菌细胞壁肽聚糖的含甘氨酸交联键，另一为细胞壁活性抗生素。本文的溶葡萄球菌酶指任何酶，包括溶葡萄球菌酶的野生类型、一种突变异种或者变异体的，或者保留分解蛋白活性的抗葡萄球菌细胞壁肽聚糖的含甘氨酸交联键的任何重组或有关的酶。可以通过蛋白质翻译后加工(或者通过生产菌株中存在的酶，或者通过该加工的任何阶段引入的酶或试剂)，或者通过结构基因的突变产生变异体。突变可包括位点删除、插入、结构域切除(removal)和置换突变。它们可以重组表达，或者采用其它方式。其它的通过剪切含甘氨酸的肽聚糖交联键而发挥作用的抗葡萄球菌活性剂包括lasA蛋白酶和无色肽基酶(achromopeptidase)。本发明包含这些影响肽聚糖交联键的抗葡萄球菌剂，但是本文以溶葡萄球菌酶作为例示。
细胞壁活性抗生素包括β-内酰胺和糖肽。优选β-内酰胺。适合的β-内酰胺包括但并非限制于青霉素类，例如青霉素、乙氧萘青霉素、甲苯异恶唑青霉素、二甲氧苯青霉素、羟氨苄青霉素和邻氯青霉素。其它的β-内酰胺包括头孢菌素类和氨基甲酰类(carbapenems)。代表性的头孢菌素类包括头孢菌素、头孢唑林、头孢羟唑、头孢噻甲羧肟和其它的。适合的氨基甲酰类包括imepenem和meropenem。
适合的糖肽包括万古霉素、替考拉宁和雷莫拉宁。
这两种药剂可以与进一步的药剂、助剂等等组合，但是以药学上可接受的载体有效地给药。给药一般是全身的，并且可以是静脉(IV)、肌肉(IM)、皮下(SC)、腹膜内(IP)、鞘内的或局部的。对哺乳动物体内给药的预测模型未曾显示组合的溶葡萄球菌酶和β-内酰胺或糖肽或细胞壁活性抗生素的协同作用。相应地，该有效组合的每一个药剂必需以治疗有效量给药。值得注意的是，在这点上的，当溶葡萄球菌酶和细胞壁活性剂一起给药时给药量是治疗有效的。本领域的熟练技术人员会理所当然地意识到，如果葡萄球菌感染是MRSA感染，对于-例如二甲氧苯青霉素，不存在治疗有效量。尽管如此，作为确定的抗非MRSA感染的治疗有效量的二甲氧苯青霉素的给药，与有效抗非溶葡萄球菌酶耐受性的葡萄球菌的一定量的溶葡萄球菌酶结合，会有效地治疗葡萄球菌感染，即使感染对一种或其它的抗生素耐受。从而，申请人本文所指的″治疗有效量″意指治疗学上治疗敏感金黄色葡萄球菌感染的有效剂量。这种同时给药，与现有技术通常的顺序给药相反，亦令人惊奇地抑制对抗生素或者它们的组合具有抗药性的菌株的形成。
可以采用各种药学上可接受的载体和稀释剂，一般为缓冲的。适当的药物载体对于本领域的熟练技术人员而言是公知的。本发明的制剂包括一种治疗量的溶葡萄球菌酶和一种治疗量的细胞壁活性抗生素，这样当联合给药时，治疗葡萄球菌感染，或者金黄色葡萄球菌或者凝血酶阴性葡萄球菌，同时抑制抗药性菌株的形成。其它的不干扰这两种抗生素活性的活性药剂可以联合给药。
产生疗效的剂量大体上应考虑给定的葡萄球菌感染的性质、被感染的个体，和与溶葡萄球菌酶一起采用的抗生素。对于抗葡萄球菌活性剂例如溶葡萄球菌酶而言，其代表性的用量，对于人给药大约为15-150mg/kg体重/天，优选为25-100mg/kg/天。对于以乙氧萘青霉素为基础的β-内酰胺，其用量为50-250mg/kg/天，优选100-200mg/kg/天，糖酞例如万古霉素给药量为10-75mg/kg/天，优选15-50mg/kg/天。
给药疗程与当前单一抗生素治疗的给药基本相同，为7-28天，尽管一般采用7-21天的疗程在治疗各种葡萄球菌感染中有效。
实施例为比较耐药性菌株的发展，在Mueller Hinton肉汤中得到三种二甲氧苯青霉素耐药性葡萄球菌菌株的体外生长曲线。
在玻璃锥形烧瓶的Mueller Hinton肉汤(50ml)中完成生长曲线。烧瓶接种100μl的过夜生长并调节至0.5 Macfarland以获得大约105-106CFU/ml的开始浓度。在溶葡萄球菌酶、溶葡萄球菌酶和甲苯异恶唑青霉素(1μg/ml)或者无抗生素(对照)的存在下测定生长曲线。在OD 600下于0、2、4、6和24小时记录光密度。在24小时，烧瓶在MHA、含溶葡萄球菌酶(6μg/ml)的MHA和含甲苯异恶唑青霉素(6μg/ml)的MHA涂板，以筛选抗药性突变异种。测试到三种二甲氧苯青霉素耐药性金黄色葡萄球菌菌株272855、450M和Mu3。
以溶葡萄球菌酶(0.0625μg/ml)、溶葡萄球菌酶(0.0625μg/ml)和甲苯异恶唑青霉素(1μg/ml)和无抗生素培养24小时之后记录。
产生的数据导致下列结论1.在溶葡萄球菌酶中加入甲苯异恶唑青霉素对于三种菌株导致显著的生产抑制。
2.甲苯异恶唑青霉素的存在抑制三种菌株对于溶葡萄球菌酶耐药性的表达。
为了介绍本申请的有效性，进行了一些实验。进行棋格易感性试验以确定溶葡萄球菌酶和甲苯异恶唑青霉素(β-内酰胺)的同时给药对于抑制耐药性的产生是否有效。甲苯异恶唑青霉素浓度在0.0156μg/ml和1μg/ml之间变动。溶葡萄球菌酶浓度在0.00048和0.9μg/ml之间变动。为了溶葡萄球菌酶和甲苯异恶唑青霉素之间协同作用的显著性，测试四个菌株；27619，Col，27227和VA348。在试验的浓度范围内没有明显的协同作用或拮抗作用。溶葡萄球菌酶的MIC在浓度至高为1μg/ml的甲苯异恶唑青霉素的存在下对于一切试验菌株未改变。检测在溶葡萄球菌酶和甲苯异恶唑青霉素存在下菌株的过夜过长。四种菌株在无药物培养基(MHB)、含0.1μg/ml溶葡萄球菌酶的MHB、含0.1μg/ml溶葡萄球菌酶和1μg/ml甲苯异恶唑青霉素的MHB，以及含1μg/ml甲苯异恶唑青霉素的MHB中生长过夜。这四种受试的菌株包括450M、Col和它们的溶葡萄球菌酶耐药性突变异种450 M lyso和Col lyso。结果如表1所示。
表1

通过广泛被接受的能够预测人的体内给药情况的主动脉瓣心内膜炎(endoearditis)兔模型的体内试验，显示了同样的意想不到的结果。当对葡萄球菌感染的兔子以低剂量(1mg/kg每天二次，以杀菌的5mg/kg最小值每天三次作为对照)的溶葡萄球菌酶给药时，由于典型的抗葡萄球菌剂通过剪切含甘氨酸的交联键的作用，导致许多抗药性菌落的再生，在增殖体和肾脏具有高数量，当同样剂量与乙氧萘青霉素(β-内酰胺)一起给药时产生无菌的肾脏，一些无菌增殖体，并且没有抗药性菌株出现。治疗葡萄球菌感染同时抑制抗药性菌株形成是一项令人兴奋的和用途广泛的现有技术未预测到的发明。本发明提供治疗葡萄球菌感染并同时抑制对任何或一切服用的活性药剂耐受的菌株的形成的可行性。
通过参考特定的实施例，已经总体地公开了本发明的组合物和使用的方法，除非指明，实施例并非是限定性的，本领域普通技术人员无需花费创造性的劳动还会使本申请产生一些变化。尤其是，除非通过以下的权利要求专门排除，对本领域的熟练技术人员而言无需花费创造性能力的，等同于细胞壁活性抗生素与通过剪切含甘氨酸的交联键而发挥作用的抗葡萄球菌剂联合给药的变化类型，以及它们各种重组和突变的变异体，载体和浓度的变动，仍然在本
权利要求
1.一种治疗哺乳动物葡萄球菌感染的方法，包括给予一种抗菌剂并同时抑制对所述抗菌剂耐受的葡萄球菌突变菌株的形成，所述方法包括同时给予一定量的通过剪切葡萄球菌细胞壁肽聚糖的含甘氨酸的交联键而引发活性的抗葡萄球菌剂(肽聚糖活性剂)和一定量的有效抑制敏感葡萄球菌的另一种抗生素，其中所述的抗生素活性是通过细胞壁活性而引发的(细胞壁活性抗生素)，当联合给药时，能够抑制对所述肽聚糖活性剂耐受的葡萄球菌突变菌株的形成，其中所述的肽聚糖活性剂的量和所述细胞壁活性抗生素的量在治疗学上均分别能充分有效地对抗敏感葡萄球菌。
2.权利要求1的方法，其中所述肽聚糖活性剂是溶葡萄球菌酶。
3.权利要求1的方法，其中所述的给药是通过静脉(IV)、肌肉(IM)、皮下(SC)、腹膜内(IP)、鞘内或局部给药的一种或多种方式而进行的。
4.权利要求权利要求3的方法，其中所述的给药是SC、IP、鞘内或局部给药。
5.权利要求3的方法，其中所述的给药是IV或者IM。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞壁活性抗生素是β-内酰胺或糖酞。
7.权利要求6的方法，其中所述的细胞壁活性抗生素是β-内酰胺。
8.权利要求7的方法，其中所述的β-内酰胺选自青霉素、头孢菌素和氨基甲酰。
9.权利要求8的方法，其中所述的β-内酰胺是青霉素。
10.权利要求1的方法，其中所述的葡萄球菌感染通过至少一种金黄色葡萄球菌微生物引发。
11.权利要求1的方法，其中所述的葡萄球菌感染是通过至少一种凝固酶-阴性葡萄球菌微生物引发的。
12.一种有效治疗哺乳动物葡萄球菌感染的组合物，其活性组分包括一种通过剪切葡萄球菌细胞壁肽聚糖的含甘氨酸的交联键而引发活性的抗葡萄球菌剂(肽聚糖活性剂)和一定量的另一种对敏感葡萄球菌有效的抗生素，其中所述的抗生素的活性是通过细胞壁活性而引发的(细胞壁活性抗生素)，此组合物进一步包括药学上可接受的载体，其中所述的肽聚糖活性剂和细胞壁活性抗生素分别具有治疗葡萄球菌感染的治疗有效量。
13.权利要求12的组合物，其中所述的抗葡萄球菌肽聚糖活性剂是溶葡萄球菌酶。
14.权利要求12的组合物，其中所述的细胞壁活性抗生素是β-内酰胺或糖酞。
15.权利要求14的组合物，其中所述细胞壁活性抗生素是β-内酰胺。
16.权利要求15的组合物，其中所述β-内酰胺选自青霉素、头孢菌素和氨基甲酰。
17.权利要求16的组合物，其中所述β-内酰胺是青霉素。
全文摘要
剪切葡萄球菌细胞壁肽聚糖交联键的溶葡萄球菌酶或其它抗葡萄球菌剂,例如溶葡萄球菌酶,与一种由于细胞壁活性引发的抗生素活性而有效抑制葡萄球菌的抗生素联合给药,甚至能抑制对一种或多种溶葡萄球菌酶或细胞壁活性抗生素耐受的葡萄球菌所致的感染。联合给药同时抑制抗生素抗药性突变菌株的产生。有效的细胞壁活性抗生素包括β－内酰胺和糖酞。
文档编号A61K45/06GK1353602SQ00804527
公开日2002年6月12日 申请日期2000年3月3日 优先权日1999年3月5日
发明者M·克里莫, E·墨菲, G·阿切尔 申请人:Ambi公司