专利名称：新型隐球菌的葡糖醛木甘聚糖－o－乙酰水解酶及其用途的制作方法
本专利文本一部分公开内容含有受版权保护的内容。版权所有人对复制专利文件或专利公开文本没有如专利商标局专利文件或记录那样复制的义务，但保留所有版权。
背景技术：
发明领域本发明一般涉及分子生物学领域和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的生物结构。更具体的，本发明涉及编码新型隐球菌的葡糖醛木甘聚糖脱-O-乙酰化的酶基因的克隆、测序和表达。
相关领域的描述新型隐球菌是一种有荚膜的酵母菌，存在两种变种。从鸽粪中已分离到新型隐球菌新型亚种(C.neoformans neoformans)，发现其在世界的温带气候地区分布，而新型隐球菌加氏亚种(C.neoformans gattii)与桉树有关，分布在热带或亚热带地区(13)。这两种变种对人都有致病性，可产生致命的隐球菌脑膜炎感染(13)。酵母菌是免疫抑制病人中，特别在晚期AIDS(8，49)病人中最常见的致病菌。
新型隐球菌具有4种不同的荚膜血清型A-D，其特征是有独特的化学组成(33)。本研究中唯一使用的血清型是血清A型，来自新型隐球菌新型变种(C.neoformans var.neoformans)。该血清型是导致大多数AIDS病人中所见隐球菌脑膜炎的病因(8，49)。
新型隐球菌细胞具有非常大的荚膜(图1)，它由多糖、葡糖醛木甘聚糖(GXM)构成。血清A型GXM具有α-1，3-D-甘露糖骨架，每个甘露糖三聚体具有一个β-D-葡糖醛酸和两个β-D-木糖苷(图2)(14)。该骨架也被O-乙酰化，范围是大约3-16.5％(33)。已显示O-乙酰化形成一些单克隆抗体(MAb)的抗原性表位部分(46)。因此，这些单克隆抗体可用于通过ELISA抗体捕获试验测定葡糖醛木甘聚糖上O-乙酰化的存在和程度。
已确定荚膜是新型隐球菌的一种最重要的毒性因子(33)。已发现几个实验室产生的无荚膜突变株是无毒性的(12，16，35，38)。已显示葡糖醛木甘聚糖以数种方式影响宿主抵抗力，包括但不限于抑制吞噬作用(10，11，37)，抑制淋巴细胞应答和增殖(9.43)，诱导T-细胞依赖性和不依赖性免疫耐受(36，44，53)和甚至增强体内HIV-1的感染性(47)。治疗包括抗真菌药、两性霉素B和氟胞嘧啶、或氮杂茂、酮康唑和氟康唑(45)。这些治疗常常因现存的感染，其治疗以及一些非常严重的副作用而复杂化。该疾病对医学界的许多前沿课题提出了挑战。
另一种挑战是循环性葡糖醛木甘聚糖和可能还有荚膜化的酵母细胞所导致的高粘度，有些人认为它导致脑水肿(23-27，39，40)。水肿特征是颅内压力上升，而且不是都会乐意(amenable)接受手术干预。它可以迅速发展而致命。可溶性葡糖醛木甘聚糖还提出了一个问题，即它不能非常有效的从宿主循环和组织中清除(32a，32b，32c和32d)。在抗生素和抗真菌药出现之前，学者们用能降解荚膜多糖的酶进行了实验。这类实验的第一个研究涉及用细菌降解III型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖荚膜(4，15)。从新泽西的cranberry犬中分离出细菌。随后进行了几个研究并扩大到用小鼠和家兔作体内研究。发现酶在提供保护抵抗致命性注射中是有效的，而且当感染在治疗前已牢固建立时也治疗有效(5，51，52)。用相似方法，Gadebusch在1960年发现了一种葡糖醛木甘聚糖水解酶。测试了土壤样品的酶活性分离到一种革兰氏阴性杆菌，称为碱杆菌(Alcaligenessp.)S-3723，它能完全降解新型隐球菌的荚膜(17-20)。在Gadebusch报告时，对GXM的组成和结构的了解是不完全的，而且有时是错误的。在回顾中，Gadebusch可能是两种或多种未鉴定或未确定特征的酶的混合物。在感染了新型隐球菌的小鼠体内检测到该酶混合物。ET50从未治疗小鼠的18天增加到用酶治疗的小鼠的47天。
Gadebusch对该酶的发现在1960和1961年发表(17-20)。两性霉素B作为隐球菌性脑膜炎的一种救命性治疗得到接受，该疾病在当时并不是非常流行。尚未想到作分子克隆，使得采用酶的治疗冗长乏味而昂贵，因为必须通过冗长的过程从天然细菌中纯化此酶。今天，在美国5-10％AIDS病人有新型隐球菌感染，是AIDS中最常见的威胁生命的机会性真菌感染(34)。抗真菌治疗延长了这些病人的存活，但对于脑水肿是无效的，对于抗原的高血清滴度影响很小。酶治疗可能是对长期存在的此问题的答案。
现有技术的缺陷在于缺乏对特异性GXM-切割酶的鉴定，和缺乏编码能修饰新型隐球菌荚膜多糖结构的酶的基因。另外，现有技术的缺陷在于缺乏能阻断隐球菌病过程中GXM产生的有害作用的方法。本发明填补了本领域这种长期存在的需要。
发明简述本发明公开了显示能对葡糖醛木甘聚糖脱O-乙酰化的一种新酶的克隆、测序、表达和特性鉴定。新酶是从一种微生物混合物中分离得到的，该微生物混合物是从Washoe County污水处理站获得的污水污泥样品中培养得到的。此微生物培养物产生了一组能完全降解葡糖醛木甘聚糖的酶。该培养物含有未知数量的微生物菌种，它尚未被鉴定。当菌种被分离时，培养物生长不良，使不同培养物成分难于鉴定。酶活性看来是最少4种酶的结果甘露糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸酶和O-乙酰水解酶(图2)。O-乙酰水解酶是该组第一个被纯化的。纯化后，对GXM-O-乙酰水解酶进行肽作图，提供了6个部分氨基酸序列(表1)。这些片确限定了克隆编码该酶的基因的起始位点。
表1纯化的天然GXM-O-乙酰水解酶及其LysC-切割的片段肽图序列
*该序列是全蛋白N-末端序列的继续。
本发明针对编码葡糖醛木甘聚糖(GXM)-O-乙酰水解酶的DNA，其中该DNA选自(a)分离的DNA，它编码GXM-O-乙酰水解酶；(b)分离的DNA，它与(a)中分离的DNA杂交，并编码GXM-O-乙酰水解酶；和(c)分离的DNA，它因为遗传密码的简并性在密码子序列上与(a)和(b)分离的DNA不同，但编码GXM-O-乙酰水解酶。优选DNA具有SEQ ID NO.30中所示的序列，和GXM-O-乙酰水解酶具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种能表达上述DNA的载体和用此载体转染的宿主细胞。
本发明还涉及用于PCR筛选本文公开的DNA的简并引物，和用于将DNA克隆入表达载体的引物。
本发明还涉及分离和纯化的GXM-O-乙酰水解酶，它由选自下列的DNA编码(a)分离的DNA，编码GXM-O-乙酰水解酶；(b)分离的DNA，它与(a)中分离的DNA杂交，并编码GXM-O-乙酰水解酶；和(c)分离的DNA，它因为遗传密码的简并性在密码子序列上与(a)和(b)分离的DNA不同，但编码GXM-O-乙酰水解酶。优选分离和纯化的GXM-O-乙酰水解酶具有SEQ ID NO.32中所示的氨基酸序列。还提供一种产生重组GXM-O-乙酰水解酶的方法。
本发明还提供一种具有SEQ ID NO.31所示氨基酸序列的重组GXM-O-乙酰水解酶。
本发明还提供一种通过对需要治疗隐球菌病的个体施用GXM-降解性酶治疗该个体的隐球菌病的方法。
从下面对本发明优选实施例的描述可明白本发明的其它和另外的方面，特征和优点，这些描述是为了公开。
附图简述因此，获得了上述引用的本发明的特征、优点和目的，以及其它会变得清楚的方面，并可详细理解，上面简单总结的本发明更具体的描述将参考一些实施例并用
。这些附图是说明书的一部分。然而应注意
了本发明的优选实施例，因此不应认为限制了本发明的范围。
图1显示新型隐球菌的显微电镜照片。
图2显示葡糖醛木甘聚糖血清A型的结构。
图3显示pGEM T-Easy载体的图谱。
图4显示pET 28a(+)质粒图谱。
图5显示对-硝基苯酚合成底物的结构。
图6显示PCR筛选策略。
图7显示PCR的优化。
图8显示要测序的样品的琼脂糖凝胶电泳。
图9显示PCR产物序列的连续排列对比，和GXM-脱-O-乙酰水解酶基因的起始核苷酸序列。图9A显示正向和反向测序反应。图9B显示连续排列对比的核苷酸(SEQID NO.28)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO.29)。肽作图获得的氨基酸序列加下划线。起始筛选用的PCR引物下标实心箭头。
图10显示基因组DNA完全限制性酶消化的Southern印迹。
图11显示反向PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。
图12显示GXM O-乙酰水解酶的完整核苷酸序列和推测的氨基酸序列。
图13显示BLAST同源性检索结果的推测氨基酸序列的排列对比。
图14显示用于pET表达载体插入所制备的PCR产物的琼脂糖电泳。
图15显示重组pET28a(+)转化株的菌落PCR筛选的琼脂糖凝胶电泳。
图16显示PNP-乙酸酯试验结果的诱导实验时间过程的SDS-PAGE。
图17显示了SDS-PAGE纯化的重组株。
图18显示了重组酶和PNPA底物的pH情况。
图19显示了具有稳定区[E]的改变的[PNPA]的Michaelis和Menton图谱。
图20显示GXM对PNPA水解的影响。
发明详述新型隐球菌的一种主要毒性因子是其荚膜多糖，其主要组成是葡糖醛木甘聚糖。葡糖醛木甘聚糖不仅引起疾病的产生，还认为它引起某些病人中所见的高颅内压。这种高颅内压可能是由于感染期间释出的葡糖醛木甘聚糖的高粘度所引起。Gadebush的早期研究已显示，用GXM-降解酶治疗挽救了感染新型隐球菌小鼠的生命。由于GXM中所含糖苷键的数目，最有可能的是Gadebush制备物是一种粗酶混合物。
本发明涉及葡糖醛木甘聚糖降解酶的克隆、测序和表达。用PCR技术，使用获自天然酶的肽序列设计的引物，筛选了野生型基因组DNA。重组蛋白质在pET质粒系统中表达，并通过金属鳌合物层析纯化。已显示重组和天然的酶具有相同的底物特异性，和对这些底物相似的Km值。
在本发明的一个实施例中，提供了编码葡糖醛木甘聚糖(GXM)-O-乙酰水解酶的DNA，其中DNA选自(a)分离的DNA，它编码GXM-O-乙酰水解酶；(b)分离的DNA，它与(a)中分离的DNA杂交，并编码GXM-O-乙酰水解酶；和(c)分离的DNA，它因为遗传密码的简并性在DNA密码子序列是与(a)和(b)分离的不同，但编码GXM-O-乙酰水解酶。优选DNA具有SEQ ID NO.30中所示的序列，和GXM-O-乙酰水解酶具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种载体，该载体能表达适合在重组细胞中表达的上述DNA和在细胞中表达DNA必须的调控元件。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种用上述载体转染的细胞，它表达GXM-O-乙酰水解酶。优选宿主细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞。更优选的，细菌细胞是大肠杆菌。
本发明还涉及用于在培养物中PCR筛选本文公开的DNA的简并性N-末端引物，其中该引物选自SEQ ID NO.7和9；用于PCR筛选的简并性反向内部引物，其中该引物选自SEQ ID NO.12、15、18和21；和用于反向PCR获得DNA的起始和终止密码子的简并性引物，其中该引物选自SEQ ID NO.24和26。还提供了用于将DNA克隆入表达载体的引物，其中该引物选自SEQ ID NO.40和47。
本发明还提供了分离和纯化的葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶，由选自下列的DNA编码(a)分离的DNA，它编码GXM-O-乙酰水解酶；(b)分离的DNA，它与(a)中分离的DNA杂交，并编码GXM-O-乙酰水解酶；和(c)分离的DNA，它因为遗传密码的简并性在DNA密码子序列上与(a)和(b)分离的不同，但编码GXM-O-乙酰水解酶。优选分离和纯化的GXM-O-乙酰水解酶具有SEQ ID NO.31所示氨基酸序列。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种具有SEQ ID NO.31所示氨基酸序列的重组GXM-O-乙酰水解酶，其中该重组GXM-O-乙酰水解酶由一含有SEQ ID NO.30所示序列的核酸区段所编码，。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种产生重组GXM-O-乙酰水解酶的方法，包括步骤如下获得含有表达区的一载体，该表达区含有编码SEQ ID NO.31所示氨基酸序列的序列，该序列与启动子可操纵性连接；将此载体转染入细胞；和在有效表达此表达区的条件下培养该细胞。
本发明还涉及一种在需要治疗的个体中治疗隐球菌病的方法，包括给予个体单独或联合其它GXM水解酶的酶。优选个体患有一种或多种隐球菌性脑膜炎并发症，特别是脑水肿。还提供了一种含有纯化的葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的药盒。
给出下列实例为了说明本发明的不同实施例，不意味着以任何形式限制本发明。
实施例1克隆和测序野生型酶的纯化、LysC降解和氨基酸测序从污水中收集的混合的未知细菌培养物中纯化得到了天然的GXM-O-乙酰水解酶。纯化通过下列步骤实现胆盐抽提、硫酸铵沉淀、分子筛层析和在mono Q柱，然后是mono S柱上离子交换。
Nevada大学的Core Protein Facility的K.Schegg用Edman降解法在Procise492测序仪(Applied Biosystems)上进行了该天然蛋白质的氨基酸测序。在确定NH2-末端序列后，对此蛋白质进行LysC内切蛋白酶降解，在Microhm UMA HPLC上，以下列条件进行片段的分离柱-Reliasil C18，5微米，300；防护柱-基于二氧化硅的C18；溶剂A-0.1％ TFA；溶剂B-0.09％ TFA、60％乙腈；洗涤溶剂-20％甲醇、80％去离子水；温度40℃；梯度1-100％溶剂B，经60分钟。
DNA制备从混合细菌培养物中用Puregene细胞裂解溶液和蛋白质沉淀溶液(Gentra Systems)根据厂商说明分离得到基因组DNA。根据Sambrook等(50)进行琼脂糖凝胶电泳。用Qiax II琼脂糖凝胶抽提试剂盒(Qiagen)根据厂商说明从琼脂糖凝胶中抽提出DNA。从Promega和New England Biolabs购得限制性酶和T4 DNA连接酶，与厂商提供的缓冲液一起使用。
细菌菌株、培养条件、质粒和寡核苷酸野生型细菌培养物是一种从污水培养物获得的未知生物的混合培养物，维持在-20℃的甘油储液中。在30℃温箱内，1X YNB/MES/GXM培养基上，pH6.0下振摇培养此培养物酵母氮碱基(6.7克/升)、20mM MES缓冲液和GXM(400毫克/升)。
用大肠杆菌Max Efficiency DH5α(Gibco BRL，Life Technologies)和JM109High Efficiency Competent Cells(Promega)作为重组质粒的宿主。37℃在含有氨苄青霉素(最终浓度为100微克/毫升)、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖吡喃糖苷，最终浓度为80微克/毫升)和IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，最终浓度为0.5mM)的LB(Luria-Bertani肉汤)培养基上培养此大肠杆菌转化株。将该转化株菌落接种入5毫升含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃温箱中振摇培养过夜。
用Promega的pGEMT-Easy载体系统亚克隆PCR片段，制备用于测序的双链DNA。这些载体含有T7和SP6 RNA聚合酶启动子，旁侧是在β-半乳糖苷酶编码区中发现的多个克隆位点(图3)。
寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies或Gibcl BRL LifeTechnologies，或由Nevada大学，Reno的DNA分析实验室的E.Otteson在PCR-MATE EP 391 DNA合成仪(Applied Biosystems)上用寡核苷酸合成的亚磷酰胺法合成。
PCR扩增按照McPherson等(42)进行PCR。PCR扩增混合物(50微升用于筛选，2微升用于测序反应)含有DNA模板(0.3-2微克)、脱氧核苷三磷酸(各10纳摩尔)、寡核苷酸引物(各0.3-1微克)和taq DNA聚合酶(Promega)(2.5-5U)，在1.5mMMgCl2缓冲液(Promega)中。反应在Gene Amp PCR系统9600(Perkin Elmer)上进行反应30轮，每轮95℃一分钟，50-63℃退火一分钟(取决于引物的融化温度Tm)和72℃延伸一分钟。最后延长步骤72℃10分钟。Tm是在递送寡核苷酸时提供的。用凝胶电泳分离PCR产物并用Qiax II琼脂糖凝胶抽提试剂盒(qiagen)抽提和纯化。
核苷酸测序从大肠杆菌中用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)分离出含有基因组DNA最初筛选得到的PCR产物的重组pGEM-7 T-Easy载体。将这些质粒用作测序性PCR反应中的模板，该反应物中含有Terminator Ready ReactionMix(来自ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒，Applied Biosystems，Perkin Elmer)。该Terminator Ready Reaction Mix用荧光标记的双脱氧核苷酸在测序准备中标记了PCR产物的3’末端位置。Nevada大学，Reno的Core Sequencing Facility的J.Rowe用双脱氧核苷酸链中止法在ABIPRISM 310基因分析仪(Applied Biosystems)上对此PCR产物进行了测序。
Southern印迹分析分离得到基因组DNA，用EcoRI、HaeIII和HindIII(Promega)消化，用琼脂糖凝胶电泳分离。电泳后，将凝胶在室温下0.4MNaOH、0.6M NaCl中浸泡30分钟。将DNA从凝胶上转移到在以0.4M NaOH浸泡了15分钟的BiodyneB膜(Gibco BRL)上。转移在BIOS印迹单元中发生。印迹后，用0.2M Tris-HCl(pH7.5)、2X SSC(0.9M NaCl、0.09M柠檬酸钠，pH7.0)洗涤膜15分钟，室温温和振荡。80℃干燥此膜60分钟以上。
用[γ-32]ATP(150μCi)(DuPont)和T4多核苷酸激酶(8-10U)(Promega)放射性标记寡核苷酸探针(约10皮摩尔)。室温培养过夜后，用Stratagene Push ColumnβShield Device和NucTrap探针纯化柱从混合物中除去游离的放射标记。在Beckman LS 3801闪烁计数器上定量测定标记的探针。
将干燥的膜和放射性标记的探针在1.5X SSPE(3.0M NaCl、0.2M NaH2PO4、0.02MEDTA，pH7.4)、7％SDS、10％PEG 8,000和去离子水的杂交溶液中杂交。此杂交混合物含有10毫升杂交溶液、1毫升鲑精DNA(10毫克/毫升)(Gibco-BRL)和12微升放射标记探针。在玻璃试管中与膜一起65℃旋转过夜。
室温下在2X SSC、0.1％SDS中温和振荡30分钟，洗涤杂交膜，然后55℃在0.1X SSC、0.1％SDS中温和振荡30分钟。膜斑点干燥，包裹在塑料套中，置于含有X光胶片的筒中-80℃6小时，开始曝光。胶片在Konica Medical Film ProcessorQX-70上显影。以0.4M NaOH 55℃洗涤1小时剥离膜，然后以0.2M Tris-HCl(pH7.5)、2X SSC洗涤30分钟中和。然后如需要，重复杂交。
实施例2同源检索通过国家生物技术信息中心(NCBI)碱基位置排列对比检索工具(BLAST)检索引擎，以氨基酸序列进行计算机检索。这是一种主要根据Karlin和Altschul(30、31)的统计学方法的检索算法。该程序可将查询氨基酸序列和许多序列碱基数据进行比较，根据他们序列相似性的统计学显著性进行评分。结果以总分、E值、相同性评分和阳性评分提供。评分对于查询和数据库序列的残基组成、查询和数据库序列的总长度是唯一的。进行这种粗排列对比评分后作另一维的数位，它不依赖于所计算的评分的衡量标准，可提供一些交叉序列的比较。更高数位的评分表明更高程度的序列相似性。E值(期望值)与P值(概率值)相关，当检索特定大小的数据库时，与预期的命中数目相关。相同性评分与查询和数据库序列之间的相同残基的数目和组分有关。该数目常称作同源性程度。阳性评分与排列对比评分具有正值的残基数目和组成有关。
通过PSORT检索引擎也以氨基酸序列进行另一次检索。PSORT用Nakai和Kanehisa(42)改良的McGeoch方法(41)可预测信号序列的存在，并用以下三个参数对序列进行评分N-末端区的静电荷，中央疏水区的长度和中央疏水区的峰值。大的正评分表明该蛋白质具有信号序列的可能性高。
PSORT还使用了另一种von Heijne(54)开发的信号识别方法。该方法根据加权基质方法可确定最可能的信号切割位点，该方法引入了关于切割位点周围的共有序列模式信息。大的正评分表明该蛋白质具有可切割信号序列的可能性高。在报告的该部分也给出了可能的切割位点的位置。
用von Heijne(55)开发的方法可分析提交序列的脂蛋白性质，该方法结合了Mc Geoch的方法和von Heijne分析切割位点周围共有序列的方法。然后将该试验的结果提交给Yamaguchi等(58)开发的方案，此方案可将蛋白质和内膜或外膜分开。
实施例3蛋白质表达细菌菌株、质粒、寡核苷酸和培养条件野生型细菌培养物是产生天然酶的未知生物的原始混合培养物，维持在-20℃的甘油储液中。在30℃温箱内，1XYNB/MES/GXM培养基上，pH6.0下振摇培养培养物。
用大肠杆菌Max Efficiency DH5α(Gibco BRL，Life Technologies)、NovaBlue感受态细胞(Novagen)和BL21(DE3)感受态细胞(Novagen)作为重组质粒的宿主。37℃在含有氨苄青霉素(最终浓度100微克/毫升)、X-Gal(最终浓度80微克/毫升)和IPTG(最终浓度0.5mM)的LB培养基上培养大肠杆菌Max Efficiency DH5α转化株。将转化的菌落接种入5毫升含有氨苄青霉素的LB培养基中，振摇中37℃温箱中培养过夜。NovaBlue和BL21(DE3)转化株37℃在含有最终浓度30微克/毫升的卡那霉素的LB培养基上培养。
用pET-28a(+)(Novagen)表达重组蛋白质并赋予用于选择的卡那霉素抗性(图4)。该质粒同时含有C-末端和N-末端6x HisX尾，可用于通过镍鳌合层析纯化。寡核苷酸由Integrated DNATechnologies或Gibco BRL Life Technologies合成。
PCT修饰用于插入pET质粒的靶基因PCR扩增混合物(50微升)在1.5mM MgCl2缓冲液(Promega)中含有DNA模板(0.3-2微克)、双脱氧三磷酸(各10纳摩尔)、寡核苷酸引物(各0.3-1微克)和taq DNA聚合酶(Promega)(2.5-5微升)。反应在PowerBlock System，Easy Cycler Series(ERICOMP，Inc.)上进行30轮，每轮94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟。最终延伸步骤是72℃10分钟。用PCR纯化系统(Gibco BRL，Life Technologies)纯化产物。
菌落PCR用菌落PCR筛选转染的非表达宿主细菌的菌落。用凝胶电泳分离产物，然后用CONCERT Rapid PCR纯化。从各平板上挑出两个菌落用作菌落PCR的模板，这些菌落也在此时新鲜接种，以确保任何阳性转化细胞系的连续。如上节所述建立混合物(50微升)。它们在相同系统上进行35轮，每轮94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃衍生2分钟。最终的延伸步骤是72℃6分钟。用琼脂糖凝胶电泳分离该反应的产物，来确定亚克隆是否成功。
载体制备制备了pET28a(+)载体(3微克)，通过用10-20微升BamHI和NdeI和10X BamHI缓冲液(总体积为30微升去离子水)同时限制性消化(用New EnglandBiolabs推荐的该双消化法)接受插入物。用琼脂糖凝胶电泳分离消化的载体，切下并如上纯化。含有PCR产物的插入物以相同方式双消化。
大肠杆菌细胞的转染首先将重组质粒克隆入非表达宿主，分析鉴定阳性克隆，然后用T7 RNA聚合酶基因转化入表达宿主。转染过程对各宿主都是相同的。融化感受态细胞，温和混合，分成20微升的等份。各等份接受1微升重组质粒，在冰上放置20分钟。样品42℃热休克40秒，然后置冰上2分钟。在各反应物中加入S.O.C.培养液(2％蛋白胨、0.5％酵母抽提物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4和20mM葡萄糖)(80微升)，然后200-250rpm37℃振摇1小时。将转化混合物(50微升)铺在含有30微克/毫升卡那霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜。
λDE3溶原菌的诱导在生长培养物中加入IPTG至最终浓度1.0mM，诱导大肠杆菌λDE3溶原菌的靶基因表达。从表达宿主转化株挑出一个菌落，用于接种250毫升Erlenmyer瓶中含30微克/毫升卡那霉素的50毫升LB。37℃振荡培养约4小时，此时OD600达到约0.8。取出样品用作未诱导对照。如上所述加入IPTG，诱导重组蛋白质的表达，并如前继续振荡培养2小时。在一个实施例中，在该培养过程中每30分钟取出样品，跟踪诱导的时间过程。用SDS-PAGE分离样品，在PNP-乙酸酯上测试酶活性。在另一个实施例中，对整个培养物进行纯化。在该实验中，在冰上冷却培养瓶5分钟，以5000xg 4℃离心5分钟收集细胞。将细胞25℃重新悬浮在0.25培养体积的冷50mM Tris-HCl pH8.0中，如上所述再次离心。此时，制备细胞-80℃以沉淀形式储藏，或用于蛋白质纯化。
在非变性条件下纯化带His-尾的重组酶由于pET载体携带有NB和C-末端组氨酸六肽，可快速亲和纯化重组蛋白质。Novagen提供的用于亲和柱的His·Bind树脂能与这些组氨酸尾结合，因此与重组蛋白质结合。洗掉未结合的蛋白质，用咪唑洗脱靶蛋白。洗脱后，将蛋白质用含0.05％Tween 20的PBS透析，因为在咪唑存在下活性会丧失。Tween 20减少了蛋白质与储藏容器的粘附。
纯化蛋白质之前，分析细胞裂解液的粗组分(可溶、不溶和培养液)的酶活性。离心后收集50毫升培养液。在1.5毫升培养液中加入三氯乙酸(TCA)(50微升)，沉淀存在的任何蛋白质。将混合物置于冰上15分钟，然后离心沉淀沉淀的蛋白质。用丙酮洗涤沉淀，风干，重新悬浮在PBS-Tween中。用PNP-乙酸酯法(对硝基苯酚法，下述)测试其酶活性。将50毫升培养液的原始细胞沉淀重悬在1/10培养体积的50mM Tris-HCl pH8.0中。加入Lysozyme(Sigma)至浓度为100微克/毫升，并加入1/10体积1％Triton X-100。30℃培养此混合物15分钟，然后用微量移液枪头超声剪切DNA。12,000xg 4℃离心裂解液15分钟。用上述相同试验测试上清液的可溶性酶活性。将沉淀重悬在PBS-Tween中，用相同试验测试不溶性酶的活性。
如前节所述，通过最初的离心步骤到诱导和生长，制备了100毫升诱导的培养物。在减压条件下脱气所有的缓冲液和His·Band树脂20分钟，然后用于该方法。加入His·Band树脂(5毫升50％EtOH溶液)，在装有pETSystem(Novagen)的柱中沉降。用无菌去离子水(3体积)、1X电荷缓冲液(5体积400mM NiSO4)和1X结合缓冲液(3体积40mM咪唑、4M NaCl、160mM Tris-HCl，pH7.9，最终pH7.9)洗涤此柱来加电荷并平衡，准备进行细胞抽提。5,000xg离心5分钟沉淀细胞抽提物。丢弃上清液，重新将细胞沉淀悬浮在冰冷的结合缓冲液(4毫升)中。简单超声处理此混合物以剪切染色体DNA。裂解液10,000rpm离心10分钟，除去碎片。然后将上清液滤过0.45微米膜，除去任何颗粒。将上清液上柱。然后用1X结合缓冲液(10体积)和1X洗涤缓冲液(6体积480mM咪唑、4M NaCl、160mM Tris-HCl，pH7.9，最终pH7.9)洗涤细胞抽提物，洗去任何未结合的蛋白质。用1X洗脱缓冲液(6体积4M咪唑、2M NaCl、80mM Tris-HCl，pH7.9，最终pH7.9)，然后用1X剥脱缓冲液(10毫升400mM EDTA、2M NaCl、r80 mM Tris-HCl、pH7.9，最终pH7.9)洗脱结合的蛋白质。在整个过程中，从细胞抽提物上样开始收集各1.5毫升组分。合并这些成为3-9毫升组分，用PBS-Tween透析，测试酶活性。
实施例4重组GXM-O-乙酰水解酶的特性鉴定纯化重组酶的定量和分子量估计用BCA法和280纳米处的吸收光谱(a≈0.1毫升/微克)定量测定了纯化的酶(7)。用SDS-PAGE还原凝胶(含有1X电泳溶液)分析了重组和天然的酶，测定大概的分子量。用12％分离胶和4％浓缩胶。重组酶和还原和非还原样品缓冲液一起泳动。
PNP-糖苷试验用显色试验，使用合成底物测定了天然和重组酶的底物特异性，合成底物是连接了对硝基苯酚的β-D-木糖苷、α-D-甘露糖苷和β-D-葡糖醛酸(图5)。该试验测定由于形成对硝基苯酚盐这三种不同的糖酶促释放硝基苯酚的特异性(48)。该试验在96-孔平板中进行，在BIO-TEK Ceres 900平板阅读仪上405纳米处读数。各反应体系含有200微升EPPS缓冲液(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-3-丙磺酸)，50mM，pH8.0，50微升酶溶液(含有不同水平的酶蛋白)和50微升PNP-糖溶液，5mM。空白含有200微升EPPS缓冲液，50mM，pH8.0，50微升PNP-糖溶液，5mM和50微升PBS-Tween，pH7.2，用于酶的相同缓冲液。所用空白能定量PNP-糖的非酶促水解。重组和天然的酶反应混合物和空白反应混合物30℃温育过夜。翌日早晨，用β-D-木糖苷、α-D-甘露糖苷和β-D-葡糖醛酸及其分别的PNP-连接的底物建立对照孔。培养这些底物特异性对照30℃4小时。建立标准在平板阅读仪上定量测定试验。
PNP-羧酸酯试验该试验确定了对于以下5种不同PNP-脂肪酸酯的酶活性的特异性PNP-乙酸酯(2碳)、PNP-丙酸酯(3碳)、PNP-丁酸酯(4碳)、PNP-月桂酸酯(12碳)和PNP-棕榈酸酯(16碳)。在96孔平板中建立该试验，BIO-TEK Ceres900平板阅读仪上读取405纳米处值。各反应体系含有200微升PBS缓冲液，pH7.2；50微升PNP-酯溶液，0.77mM；和在405纳米处读数前加入的50微升酶(含有不同水平的酶)。在含有200微升PBS缓冲液，pH7.2；50微升PNP-酯溶液，0.77mM；和50微升PBS，pH7.2，(用该缓冲液代替酶)的溶液中测定非酶促水解。通过测量已知量的对硝基苯酚溶液的A405获得了标准曲线。在30秒内以单点方式读取该试验值，因为酶对此底物作用迅速。
PNP-乙酸酯试验常规用该试验来测定上述的表达和纯化过程的各步骤中重组酶样品中的酶活性，但仅用PNP-乙酸酯底物。在pH6.2-8.2处测定该反应。PNP-乙酸酯试验在pH小于6.2时颜色变化很小。在pH大于8.2时，非酶促水解模糊了酶催化的反应。
GXM降解在如下建立的降解反应中，特别检查了酶样品对GXM的活性取10微升纯GXM(2毫克/毫升)在30℃下与30微升酶样品(含有不同水平的PNP-乙酸酯活性)一起培养。仅用GXM和不含酶的PBS缓冲液建立了对照。
定量测定GXM降解的ELISA试验用ELISA法，利用捕获抗体和指示抗体定量测定了上述降解反应的产物。首先用捕获抗体MAb471包被96孔平板，25℃培养过夜。这是一种抗GXM单克隆抗体。过夜培养所用的缓冲液是磷酸包被缓冲液，0.05M磷酸钠，pH7.4和EDTA。然后用封闭缓冲液(0.05M磷酸钠，pH7.4)洗涤平板，然后用封闭溶液(封闭缓冲液加0.05％Tween20)包被，室温培养90分钟。用PBS-Tween洗涤平板。将含有捕获抗体针对的抗原的上述降解反应物以洗涤缓冲液稀释1∶10,000，加到孔中，室温培养90分钟。再次用洗涤缓冲液洗涤平板，加入指示抗体辣根过氧化物酶(HRPO)标记的MAb 3C2，室温培养90分钟。Nevada大学的M.Grinsell用Pierce法标记了MAb 3C2。用缓冲液洗涤平板，加入HRPO底物溶液(TMB Microwell Peroxidase Substrate Solution Kirkegaard & PerryLabs，Inc.)，室温培养30分钟。在BIO-TEK Ceres 900平板阅读仪上，读取平板405纳米处值。
定量测定GXM上酰基的Hestrin试验用Hestrin试验测定了上述试验所用的GXM上和C.Savoy(29)用天然酶的酶促降解所用的GXM上存在的乙酰基数量。Hestrin试验包括使O-乙酰基与羟胺在碱性条件下反应，形成羟肟酸，与Fe3+在酸溶液中形成有颜色的复合物。颜色形成的程度和存在的O-乙酰基量有关，用分光光度计在540纳米处测定。用以0.001M乙酸钠配的乙酰胆碱0.004M，pH4.5作为标准。
竞争性试验GXM对PNP-乙酸酯在固定的0.333mM浓度下的PNP-乙酸酯和递增量的GXM中，进行了PNP-乙酸酯平板试验，以测定PNP-酯水解速率的变化。该试验用与Michaelis Menton等式类似的等式，在竞争性抑制剂存在下提供了GXM酶的表观Km。以50、100和150微升将GXM(2毫克/毫升的PBS-Tween溶液)加到递减量(以取代方式)的200微升PBS-Tween中。在其中加入50微升用PBS-Tween稀释的酶和50微升PNP-乙酸酯，5mM，用BIO-TEK Ceres 900平板阅读仪上在405纳米处读数平板。用各种量的GXM、PNP-乙酸酯和不用酶进行酶对照。同时进行对硝基苯酚的标准品的测定。
动力学使用PNP-乙酸酯平板试验和上述竞争性试验研究了酶的动力学。在BIO-TEK Ceres 900平板阅读仪上，405纳米处用动力学法读数平板，每隔20秒读数一次3分钟。分析结果，确定了天然酯和重组酶用PNP-乙酸酯和GXM作为底物的Km和Vmax参数。
实施例5混合的未知基因组的PCR筛选该筛选策略首先用肽图获得的氨基酸序列设计的简并引物筛选该混合的基因组，然后用反向PCR法获得此基因的起始和终止密码子(图6)。
分析了Core Protein Facility提供的肽图结果，确定PCR引物最可能的序列。还考虑了适合的解链温度、末端碱基、自身退火和发夹形成。根据表2制备了1个N-末端正向引物和4个内部反向引物。虽然不知产生此蛋白质的生物物种，但有理由预测它是一种好氧细菌。因此用肠细菌的密码子用法设计了第一组简并引物。引物长度是19和21个碱基，具有一个或两个在第三位使用的碱基(表2)。用N-末端19-聚物起动PCR反应，52聚物N-末端用于随后反应，如图7所示。反向引物具有表2所示的反向互补核苷酸和氨基酸序列。
表2简并PCR引物引物种类核苷酸和相关的氨基酸序列筛选PCRN-末端19聚物5′GAC CCG GTT CCG GCW GGY G 3′(SEQ ID No.7)D P V P A G (SEQ ID No.8)N-末端52聚物5′GAC CCG GTT CCG GCW GGY GCW AAC CGT GCWD P V P A G A N R A反向互补5′GCW GTT GCW GTW CCG CGT AAC 3′(SEQ ID No.9)A V A V P R N(SEQ ID No.10)内部21聚物“A” 5′RGT CGG GTG WAC GAA GTC CGG 3′(SEQ ID No.11)反向互补5′CCG GAC TTC GTW CAC CCG ACY 3′(SEQ ID No.12)P D F V H P T(SEQ ID No.13)内部21聚物“B” 5′GTC RCC GTC WGC GTA ACG GGA 3′(SEQ ID No.14)反向互补5′TCC CGT TAC GCW GAC GGY GAC 3′(SEQ ID No.15)S R Y A D G D(SEQ ID No.16)内部21聚物“c” 5′CAG WGC GTT TTC WAC ACG GTC 3′(SEQ ID No.17)反向互补5′GAC CGT GTW GAA AAC GCW CTG 3′(SEQ ID No.18)D R V E N A L(SEQ ID No.19)内部21聚物“D” 5′GTT GTT GAT CGG CAG GAT WGC 3′(SEQ ID No.20)反向互补5′GCW ATC CTG CCG ATC AAC AAC 3′(SEQ ID No.21)A I L P I N N(SEQ ID No.22)反向PCR前半个29聚物(R) 5′TTA ATG TCA TCC ACC TGT CCC TTG CTC AA 3′(SEQ ID No.23)反向互补5′TTG AGC AAG GGA CAG GTG GAT GAC ATT AA 3′(SEQ ID No.24)L S K G Q V D D I(SEQ ID No.25)后半个20聚物(F) 5′TC AAC AGC GCG GAA CAA ATC 3′(SEQ ID No.26)F N S A E Q I(SEQ ID No.27)筛选内部引物编号为A-D。
反向PCR引物标记为(R)反向或(F)正向W＝T或A Y＝T或C R＝A或GPCR筛选的第一步是用N-末端正向引物和4个不同的内置反向引物克隆此基因的内部部分。该过程产生了不规则结果，其标志是PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上出现太多条带或没有条带(图7)。多条条带的情况归因于非特异性结合，可能是由于存在多个基因组而加重的。无条带归因于退火温度超过了引物的解链温度。将N-末端引物从19个简并碱基增加到52个克服了非特异性结合的困难。
以递增温度重复此实验，直到发生产物丧失，再次证明超过了最大解链温度。该实验的结果是所用的4个内置反向引物中的三个(B、C和D)均产生了位置一致的条带。图7显示了当使用各内置反向引物时，19聚物对52聚物N-末端引物的结果。
从凝胶上切下下列条带进一步实验两条条带来自52聚物的55℃实验，大小约400和600个碱基对；1条条带来自52聚物的63℃实验，大小约500个碱基对；1条条带来自52聚物的55℃实验，大小约250个碱基对；1条条带来自52聚物的63℃实验，大小约650个碱基对。切下这些条带，纯化并连接入pGEM T-Easy载体系统，准备通过转染入大肠杆菌和克隆增殖扩增其序列。
初步测序反应表明引物C紧随已知的N-末端序列之后。用引物C获得的小PCR产物证实了这个情况。因此不用引物C来进行以后的测序反应。相同的初步测序反应排除了将引物A得到的更小的PCR引物作为阳性序列，据信它是该实验的人为结果。
转染和培养后，分离得到含有用引物A、B和D的PCR产物的重组载体。用EcoRI限制性处理载体，证实掺入了正确长度的产物(图8)。重组载体A的插入物约600个碱基对。重组载体B的插入物约500个碱基对。重组载体D的插入物约650个碱基对。这些插入物与最初结果良好吻合，并制备插入物用于测序反应。
将载体插入物A、B和D的核苷酸序列转变为蛋白质序列，用DNAStar软件排列对比(图9)。图9A中列出了正向和反向测序反应，图9B列出了核苷酸(SEQ IDNO.28)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO.29)。通过肽作图原始获得的肽序列下划黑线。PCR引物下划箭头，表明它们的方向。用ABI测序试剂盒提供的引物进行了正向和反向测序。一式两份获得了大部分序列。仅列出已知的核苷酸序列；氨基和羧基末端仍然未知，因为它们获自简并引物。该蛋白质的推测分子量确定是24,145道尔顿。
此时，还需要对氨基和羧基末端进行测序。常规方法要求建立和筛选基因组或亚基因组文库。然而培养物中存在的物种数目排除了该作用过程。未将培养物分成单个物种，因为它们似乎依赖于其它物种的存在才能存活。然而进行了Southern印迹，预计建立了一个亚基因组文库。该印迹表明放射性标记的52聚物N-末端引物与一段约1Kb HaeIII的片段杂交(图10)。该信息导致克隆该基因的下一个阶段，反向PCR。
实施例6用反向PCR测定氨基和羧基末端的序列用HaeIII限制性处理基因组DNA，并用琼脂糖凝胶电泳分离。切下并制备大小在900-1000碱基对范围内的条带。将这些条带连接形成环状DNA，然后用向外的引物作PCR，该引物设计成能与此基因的中央区杂交(表2)。用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，绘在图11中。这些产物的大小似乎大约850-900个碱基对。通过减去基因组DNA的量计算预期的分子量，该基因组DNA不包括在从大约全长质粒的约1Kb分子量的克隆的区域中(落在两个外向PCR引物之间的DNA)，该预期分子量大约900个碱基对。由于产物与预期值相符合，对其测序。获得的序列包括起始和终止位点，如图12所示(核苷酸序列SEQ ID NO.30；推导的氨基酸序列SEQ IDNO31)。这些实验结果导致获得采这种新颖的GXM-O-乙酰水解酶基因的全长序列。计划下一步是在大肠杆菌中表达此重组蛋白质。
实施例7同源性检索BLAST同源检索没有产生获得的该基因序列的确切匹配物，虽然它对5个不同的血小板激活因子乙酰水解酶大鼠β(57，SEQ ID NO.32)、人β(2，21，SEQ IDNO.33)、小鼠β(3，SEQ ID NO.34)、人γ(1，SEQ ID NO.35)、牛γ(22，28，SEQ ID NO.36)和大鼠γ(3，SEQ ID NO.38)的108-113位具有非常高的评分(图13，小鼠γ，SEQ IDNO.37；天然，SEQ ID NO.31)。E值(与概率值类似)也非常高，范围在1e-23到4e-25之间，表明当检索所用的数据库时预期的命中数目。查询和数据库(序列)之间的相同性，相同残基组分的比例都是35％。阳性、排列对比评分具有正值的残基组分范围在54-58％。
PSORT检索表明在氨基酸21处有一可能的切割位点，它就在肽测序确定的原始N-末端前。PSORT还提出该蛋白质似乎具有可切割的N-末端信号序列。此程序确定该蛋白质很可能被导向天然细菌的周质间隙或外膜。此算法需要关于表达该天然蛋白的细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴性的信息。由于这是未知的，因为原始污水细菌培养物的混合状态未知，输入了各种革兰氏状态，当原始细菌菌种被定为革兰氏阴性，而不是革兰氏阳性状态时，得到了更多信息。
实施例8载体和插入物的制备制备了表达质粒的载体和插入物。用PCR建立引物，加入BamHI和NdeI限制性酶位点，用于插入pET表达质粒，并将此基因的编码区置于正确的阅读框中(表3)。突变的核苷酸加下划线。反向引物具有反向互补核苷酸和氨基酸序列。制备了两个克隆，一个长一个短。长克隆包括声称的信号靶序列，短克隆不包括。在1％琼脂糖凝胶电泳上分离PCR产物(图14)，长插入物看来约750个碱基对，短插入物看来如预期的，约700个碱基对。用旋转柱纯化PCR产物，并用260纳米处的吸收光谱定量。插入物的浓度范围是36.3-46.2纳克/微升。
表3为表达载体设计的PCR引物引物类型 核苷酸和相关氨基酸序列正向加入NDe I位点
引物类型 核苷酸和相关氨基酸序列反向加入Bam HI位点 GTT GA 3′(SEQ ID No.45)GTT GA 3′(SEQ ID No.46)GTT AC 3′(SEQ ID No.47)V 3′(SEQ ID No.48)Nde I限制性位点5′-CA↓TA TG-3′(SEQ ID No.49)3′-GT AT↑AC-5′Bam HI限制性位点 5′-G↓GATC C-3′(SEQ ID No.50)3′-C CTAG↑G-5′用限制性酶BamHI和NdeI消化载体和插入物。此双重消化使得插入物在载体中有正确朝向。在1.2％琼脂糖凝胶电泳上分离消化的载体和插入物，切下并纯化。用260纳米光谱定量，显示载体和插入物大约都是9.9纳克/微升，浓度低但能用于下面的连接步骤。
连接载体和插入物，并转化入非表达宿主大肠杆菌Novablue感受态细胞。用菌落PCR发现了3个转化株，两个具有长插入物，1个具有短插入物(图15)。在LB肉汤中培养过夜，用miniprep分离质粒DNA。260纳米光谱定量显示质粒DNA的浓度是8.3-24.8纳克/微升。将质粒转化入表达宿主大肠杆菌菌株BL21，接种37℃培养过夜。
翌日，从这些平板接种100毫升LB-Kan培养物。获得合适的生长后诱导培养物，每30分钟取出样品，测定诱导的时间过程。用SDS-PAGE分离样品，用PNP-乙酸试验分析酶活性(图16)。SDS-PAGE难于破译，因为它是一种细胞粗抽提物，存在许多蛋白质。SDS-PAGE上的样品1、3和4中呈现大约28-30kD的蛋白质浓度增加。这些蛋白质的存在可归因于pET质粒的诱导，这些蛋白中一些比天然酶的大小大可能是该重组蛋白质上存在12X组氨酸尾的缘故。然而只有样品2和3证明对于PNP-乙酸酯底物具有酶活性。
选择图16的样品3作亲和纯化，因为它对于PNP-乙酸酯具有酶活性，而且是短克隆。用该短克隆首先尝试纯化，因为其分子量更接近天然酶，而且声称的靶信号序列似乎不是必需的，因为表达是在与天然不同的物种中进行的。纯化长克隆不排除作为可能的未来实验。收集Ni3+柱纯化的1.5毫升各等份，起始时加入细胞粗抽提物。将各等份混合成为4.5毫升样品，以1X PBS-Tween透析后测试酶活性。洗脱缓冲液后采集的样品证明具有最高活性。因此，它被用于所有鉴定特征的试验。
实施例9纯化的重组酶的定量和分子量估计用BCA法测定样品具有32.2微克/毫升的蛋白质浓度。280纳米吸收光谱表明大约57微克/毫升的浓度。用BCA法测定用于比较性试验所提供的天然酶具有9.58微克/毫升的蛋白质浓度。然而当用两种酶以相同体积进行并排试验时，天然酶证明在所有的底物浓度时都具有更高活性。因此，认为重组酶不是完全纯的，此蛋白质试验含有污染物。因此该浓度估计是高估了实际值。此纯化的重组酶的SDS-PAGE得到一条以上的条带(图17)。最明显的条带似乎比同时分析的天然酶的稍大。大小的差异是由于重组蛋白上存在12X组氨酸尾之故。用质谱测定了天然酶蛋白的分子量是24,866道尔顿，是该凝胶的标准品。
实施例10PNP-葡糖醛酸试验用该试验首先测定此酶是否对GXM的任一糖成分(葡糖醛酸、木糖苷、或甘露糖苷)都具有活性。重组和天然酶都不导致PNP-糖底物的水解(表4)。以证明在用PNP-乙酸酯的诊断试验中最佳的浓度，使用了葡糖苷。用α-D-甘露糖苷、β-D-木糖苷和β-D-葡糖醛酸作为对照，来确保底物是反应性的。这些对照都是阳性的，证实底物是反应性的。
表4对硝基苯酚底物试验的结果，表示成405纳米处孔的吸光度和底物转化成纳摩尔的量
实施例11PNP-羧酸酯试验用该试验观察此酶在水解中对哪种长度的酰基链酯活性提高。测试了2-16个碳的PNP-连接的酯。重组酶和天然酶对于PNP-乙酸酯底物都有最大活性(表4)。对于其它底物有少量活性，但几乎接近0。
实施例12脱乙酰基活性的PNP-乙酸酯平板试验在这点上需要定量测定底物水解的速率。首先研究了氢离子浓度对此反应的影响。在碱性pH下PNP-连接的底物水解最有效，颜色改变在pH＝6时还检测得到。然而此酶最初是在最佳生长需要微酸培养基的细菌中发现的。此酶随pH下降变得更活跃(图18)，然而PNP-乙酸酯试验不能在低于pH＝6时检测到其活性。结果，未测得最佳[H+]。图18显示最佳pH可能在酸性区。图18中菱形所标定的三个点代表的反应在速率上与非酶性水解不可区别。在pH7.2时有活性。由于所有诊断试验都在pH7.2下进行，pH7.2看来同时适合于酶活性和试验要求，与最终体内使用酶相关。以下试验均在pH＝7.2下进行。
实施例13Hestrin定量测定GXM降解此计划的下一阶段是证实GXM上乙酸酯基团的存在，以及在酶降解过程中乙酸酯基团的丧失。为此目的使用了Hestrin试验。测定了在该研究整个过程中唯一使用的血清A型CN6菌株的GXM，其含有约13.6％(w/w)的乙酸酯基团。在用天然酶降解过程中乙酸酯基团的丧失通过C.Savoy进行的Hestrin试验而证实。重组酶和天然酶在过夜后都降解了GXM。用Hwstrin试验定量了乙酸酯基团的丧失。天然酶还原了96％的乙酸酯基团。重组酶还原了91％的乙酸酯基团。
实施例14PNP-乙酸酯平板试验用一个实验测定了重组酶和天然酶对于PNP-乙酸酯底物的Km和Vmax，该实验中酶用量保持稳定，而增加PNP-乙酸酯量。以不同PNP-乙酸酯浓度下的反应速率对Sigma Plot上的反应时间作图(图19)。通过一次双曲线回归测定Vmax和Kmy=axb+x]]>它和Michaelis Menton等式相当(48)v=VmaxSKm+S]]>其中S是该试验所用的PNP-乙酸酯浓度，Vmax是反应中获得的最大速率，Km是反应达到最大速率一半时所需的底物浓度。发现重组酶和天然酶具有非常相似的Km值，分别是1.34mM±0.10和1.26mM±0.29。这表明不仅两种酶都偏爱PNP-乙酸酯作为底物，而且它们的反应在动力学上非常相似。PNP-乙酸酯底物的Km和Vmax从此时起将称为KPNPA和VPNPA。
实施例15竞争性试验GXM对PNP-乙酸酯设计最后一个实验用于测定重组和天然酶对于GXM的Km(KGXM)。这是通过在与此酶的一个反应中竞争两种底物PNP-乙酸酯和GXM完成的。维持PNP-乙酸酯和酶浓度稳定，同时改变GXM的浓度。维持酶浓度稳定。这产生了一张PNP-乙酸酯水解速率随GXM浓度升高而下降的图(图20)。该图用双曲线抑制公式回归y=abb+x]]>其中a是不存在GXM的的PNPA水解速度，b是EC50值，x是GXM浓度，y是反应速度。EC50是将PNPA水解降低到没有GXM的速度的50％的GXM浓度。考虑对于竞争性抑制剂存在下反应的Michaelis和Menton等式为v=Vmax[S]Km(1+IKI)+[S]]]>就竞争性底物而言，等式变成v=VPNPA[PNPA]KPNPA(1+EC50KGXM)+[S]]]>用EC50值和下列等式计算KGXMv=Vmax[S]Km+[s]-----(1)]]>V2=Vmax[S]kPNPA(1+EC50KGXM)+[S]-----(2)]]>用等式(2)，即在竞争性抑制剂存在下一半速率的Michaelis和Menton等式除等式(1)，即Michaelis和Menton经典等式，得到KGXM的解答。KGXM=EC50(1-[S]KPNPA)]]>从图19显示的结果计算KPNPA，[S]是在所有反应中使用的底物量。该分析得到重组和天然酶的KGXM分别是1.45mM±0.19和0.60mM±0.01。这些值彼此之间和KPNPA值都是在同一数量级内的。这些相似性表明这两种酶均视GXM是和PNP-乙酸酯一样的可接受的底物，因为PNP-乙酸酯及它们的反应在动力学上非常相似。
讨论本研究的目的是产生一种对GXM脱-O-乙酰基化的新颖酶的重组克隆。最初在Kozel实验室中由Houpt和Savoy从污水样品培养的细菌分离和纯化了该天然蛋白质，并制作了肽图。该肽图产生了部分序列，这些序列被用于从该混合培养物中筛选基因组DNA来开发该酶基因的PCR引物。
全部证据表明，表达的重组酶是天然GXM-O-乙酰水解酶的一个克隆。第一，其核苷酸序列(图12)与已知的天然酶的肽序列匹配。将获得的最后的全基因序列(含有起始和终止密码子)翻译成一蛋白质序列。该蛋白质序列含有100％吻合的原始肽序列。第二，该重组酶具有与天然酶相同的底物特异性。它们是GXM-O-乙酰水解酶，如合成性对硝基苯酚底物试验所示。第三，这两种酶在与两种底物(PNPA和GXM)的反应中具有相似的动力学参数。最后，该全序列蛋白质的推导分子量测定为27,032道尔顿。该分子量值比天然蛋白质略高，后者由Core Protein Facilityof the University of Nevada用质谱测定为24,866道尔顿左右。
通过BLAST进行的同源性检索未能揭示此蛋白质的完全匹配物，表明这可能是一种新蛋白质。然而产生了许多血小板激活因子(PAF)乙酰水解酶作为具有高度相似性的匹配物，如图13所示。这证实了测序的此蛋白质应具有乙酰水解酶型的活性。
血小板激活因子乙酰水解酶是PAF的关键灭活剂，在发育中起到重要作用(22，56)。由于PAF是哺乳动物蛋白，这些酶仅见于哺乳动物中。此酶是异源三聚体，由29、30和45kDa的亚基构成。29-kDa亚基称为γ亚基，当不和其它两个亚基一起表达时，显示在大肠杆菌中具有催化活性(22)。GXM-O-乙酰水解酶的序列对于人、小鼠和牛PAF-乙酰水解酶的29和30kDa亚基是高度同源的。
BLAST检索中列出的各种PAF乙酰水解酶都具有活性位点残基。当需要确定该酶更高水平的特征时，关于活性位点残基的这些信息对该检索可提供进一步指导，如突变分析。
PSORT检索也提供了可鉴定该蛋白质起源的物种信息。当宣布起源物种是革兰氏阴性而不是革兰氏阳性菌时，此信息的形式是更高程度的PSORT反应。当宣布起源物种是革兰氏阳性菌时，此程序提供的信息很少，而当宣布起源物种是革兰氏阴性菌时，得到了更多信息。当与Gadebusch从革兰氏阴性菌产碱杆菌S-3723中分离到可能的混合的GXM-水解酶的实验相连系时，这更加有趣(17)。对起源菌种进一步的研究可在逻辑上对准如下假设，即搜寻的菌种可能是革兰氏阴性菌。
PSORT还鉴定到一种可能的信号靶序列，该序列含有此蛋白质的头21个氨基酸。通过肽作图提示切割位点就在鉴定的第一个N-端残基之前。没有该信号序列的蛋白质推导的分子量是24,086道尔顿，与天然蛋白质的分子量24,866非常接近。可能天然酶的活性形式是此种切割的形式。信号序列靶向的可能部位是周质。这与Kozel实验室的发现相符，其在天然培养物的培养液中未发现酶，看来限于细胞。
两个试验证明了重组和天然酶可水解葡糖醛木甘聚糖上的O-乙酰基团这两个试验是ELISA捕获抗体试验和PNPA对葡糖醛木甘聚糖动力学试验。ELISA用于证明，当葡糖醛木甘聚糖O-乙酰化形成一些单克隆抗体的抗原表位时，可发生此种特异性水解。如果没有O-乙酰化表位，MAb则不能与葡糖醛木甘聚糖结合。ELISA试验中颜色消失表明该结合的不存在。葡糖醛木甘聚糖对PNPA活性的影响实验显示，在所用的所有葡糖醛木甘聚糖浓度下PNPA活性下降。该下降是由于重组和天然酶都偏爱结合葡糖醛木甘聚糖而不是PNPA。用动力学比色试验和在竞争性抑制剂存在下的Michaelis和Menton的反应速率公式定量测定了该下降。测定两种酶对于葡糖醛木甘聚糖的Km值是同一数量级的。
已研究了几种微生物的多糖降解酶及其对于人病原体的用途。发现了能降解肺炎链球菌和新型隐球菌多糖荚膜的酶，虽然似乎还未进行这些酶的广泛纯化或动力学研究。第一个研究在二十世纪三十年代由Avery和Dubos所做，他们发现了一种能降解III型肺炎球菌荚膜多糖的细菌(4，5，15)。他们显示该活性是由一种酶引起的，并成功的从该细菌分离到了这种酶。该酶用于体外和体内研究。Avery和Dubos显示，该酶能降解三种条件下的III型肺炎球菌荚膜多糖第一，体外作为可溶性多糖，第二，来自培养液中生长的活菌，和第三，在动物体内(5)。小鼠体内的研究不仅证明其抗感染的保护力是酶预处理的结果，还证明在已被III型肺炎球菌感染的小鼠中用此酶处理也得到一些积极作用(5)。
1960年，Gadesbuch报道发现了一种能降解新型隐球菌荚膜多糖的酶。除了进行了与Avery和Dubos非常相似的试验(获得了相似的结果)外，Gadesbuch将其研究扩大到评估荚膜降解对于新型隐球菌致病性的作用(17-20)。通过与此酶一起培养，用部分去荚膜的细胞免疫小鼠。部分去荚膜的细胞在体内同时刺激了凝集素和保护性抗体。显示这些实验的抗血清对于保护小鼠抵抗荚膜菌的致命性注射时有效(18)。
这些早期研究显示，这些酶可以成为新型隐球菌的潜在治疗剂。另外，可用重组酶作为工具，对新型隐球菌和葡糖醛木甘聚糖作进一步研究。首先，可用重组酶在体内和体外模型中研究新型隐球菌的致病性。目前还不知道荚膜多糖脱O-乙酰化对于致病性的影响。另外，由于此酶能可靠的修饰葡糖醛木甘聚糖的抗原表位，可利用该酶研究表位。最后，对于GXM的各种生物活性的结构要求还所知甚少。可用重组酶作为工具来阐明多糖的结构-功能关系。
在近期，将开发大量表达和纯化的方案，从而能进行更广泛的动力学研究。需要提供更多的重组株来进行这些研究。需要纯化来确定此重组酶的特异性活性。一旦克服了这些困难，可更完整的确定此酶的动力学参数比活力、转换数(kcat)和专一性(kcat/Km)。
已知O-乙酰水解酶是至少4种酶的复合物的一部分，它们一起起作用完全降解GXM。今后的另一个目标是最终完全纯化其它三种酶，并最终建立所有四种重组酶的工作复合物。该复合物在某天不仅能用作研究新型隐球菌及其荚膜多糖致病性的工具，还能为患有隐球性脑膜炎的患者提供治疗剂。
本文引用了下列文献。
1. Adachi等，1995，Biochem.Biophys.Acta.214180-187。
2. Adachi等，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.23310-13。
3. Albrecht等，1996，Dev.Biol.180579-593。
4. Avery等，1930，Science 72151。
5. Avery等，1931，J.Exp.Med.5473-89。
6. Bennett等，1977，Am.J.Epidemiol.105582-586。
7. Bollag等，1996，Protein Methods.p57-79，Wisley-Liss，Inc.New York。
8. Bottone等，1987.J.Infect.Dis.156242。
9. Breen等，1982，Infect.Immun.3647-51。
10. Bulmer等，1967，J.Bacteriol.941480-1483。
11. Bulmer等，1968，J.Bacteriol.955-8。
12. Bulmer等，1967，J.Bacteriol.941475-1479。
13. Casadevall等，1998，新型隐球菌，American Society forMicrobiology，Washington，D.C.
14. Cherniak等，1998，Clin Diagn Lab Immunol 5(2)146-159。
15. Dubos等，1931，J.Exp.Med.5451-71。
16. Fromtling等，1982，Mycopathologia 7923-29。
17. Gadebusch，1960a，J.Infect.Dis.107402-405。
18. Gadebusch，1960b，J.Infect.Dis.107406-409。
19. Gadebusch等，1960，Naturwissenchaften 47329-340。
20. Gadebusch等，1961，Can.J.Microbiol.753-60。
21. Hattori等，1995，J.Biol.Chem.27031345-31352。
22. Hattori等，1994，J.Biol.Chem.26923150-23155。
23. Hirano等，1964c，Arch.Neurol.11386-397。
24. Hirano等，1964a，Am.J.Pathol.451-19。
25. Hirano等，1964b，Am.J.Clin.Pathol.45195-207。
26. Hirano等，Arch.Neurol.12189-196。
27. Hirano等，1965b，J.Neuropathol.Exp.Neurol.24386-397。
28. Ho，等，1997，Nature 38589-93。
29. Kabat等，1967，Experimental Biochemistry p.493-495，Charles C.Thomas，Springfield。
30. Karlin等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268。
31. Karlin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877。
32a. Kozel.T.R.1977 Infect.Immun.1699-106。
32b. Muchmore等，1982，Mycopathologia 7841-45。
32c. Bennett等，1965，J.Immunol.94916-920。
32d. Eng等，1983，Infection 11132-136。
33. Kozel，T.R.1989，新型隐球菌荚膜多糖的抗原结构，p63-86，于E.Kurstak，G.Marquis，P.Auger，L.de Repentigny和S.Montplaisir编，Immunology of Fungal Diseases，Marcel Dekker，Inc.，New York。
34. Kozel.T.R.1995 Trends in Microbiology 3295-299。
35. Kozel等，1971，Infect.Immun.3287-294。
36. Kozel等，1977，Infect.Immun.18701-707。
37. Kozel等，1976，Infect.Immun.1462-67。
38. Kwon-Chung等，1986，Infect.Immun.51218-223。
39. Levine，S.1963，Science 139605-606。
40. Levine等，1963，J.Pathol.4297-117。
41. McGeoch，1985，Virus Res.3271-286。
42. McPherson等，1995，PCR2A Practical Approach.Oxford UniversityPress，New York。
43. Mody等，1993，Infect.Immun.61464-469。
44. Murphy等，1972，Infect.Immun.5896-901。
45. Norris等，1993，Infections in Med.35-39。
46. Otteson等，1994，J.Biol.Chem.2691858-1864。
47. Pettoello-Mantovani等，1992，Lancet 33921-23。
48. Price等，1989 Fundamentals of Enzymology.Oxford University Press，New York。
49. Rinaldi等，1986，J.Infect.Dis.153642。
50. Sambrook等，1989，Molecular Cloning.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor。
51. Sickles等，1934，J.Bacteriol.28415-431。
52. Sickles等，1935，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.32857-858。
53. Sundstorm等，1993.Infect.Immun.611340-1345。
54. von Heijne，1986，Nucleic Acids Res.144683-4690。
55. von Heijne，1989 Protein Eng.2531-534。
56. Watanabe等，1998a，Biochem.Biophys.Acta.140173-79。
57. Watanabe等，1998b，Biochem.Biophys.Acta.140173-79。
58. Yamaguchi等，1998 Cell 53423-432。
本说明书中提到的任何专利或出版物表明了本发明涉及领域中技术人员的水平。这些专利和出版物引入本文以供参考，其程度与各单独的出版物分别和单独引入相同以供参考。
本领域技术人员不难理解本发明非常适于实施其目的并获得本发明固有的那些提到的结果和优点。本文所述的实施例、方法、过程、处理、分子和特定的化合物是优选例的代表，是示范性的，不意味着对本发明范围的限制。本领域技术人员可对其进行改变和其它用途，但均在权利要求的范围所限定的本发明的精神之内。
权利要求
1.一种编码葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的DNA，其特征在于，所述DNA选自(a)编码葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的分离的DNA；(b)能与(a)的分离的DNA杂交，并编码葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的分离的DNA；和(c)由于遗传密码的简并性，与(a)和(b)的分离的DNA密码子序列不同，并编码葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的分离的DNA。
2.如权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述DNA具有SEQ ID NO.30所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
4.一种能表达权利要求1所述的DNA的载体，其特征在于，该载体适应在重组细胞中表达和具有在所述细胞中表达DNA所需的调控元件。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述DNA编码具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列的葡糖醛木甘聚糖-O-乙酸水解酶。
6.一种用权利要求4所述的载体转染的宿主细胞，其特征在于，该载体表达葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述细菌细胞是大肠杆菌。
9.一种用于在培养物中PCR筛选权利要求1所述的DNA的简并性N-末端引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO.7和9。
10.一种用于在培养物中PCR筛选权利要求1所述的DNA的简并性反向内部引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO.12、15、18和21。
11.一种用于反向PCR以获得权利要求1所述的DNA的起始和终止密码子的简并引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO.24和26。
12.一种用于将权利要求1所述的DNA克隆入表达载体的引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO.40和47。
13.由选自(a)编码葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的分离的DNA；(b)能与(a)的分离的DNA杂交并编码葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的分离的DNA；和(c)由于遗传密码的简并性，与(a)和(b)的分离的DNA密码子序列不同，并编码葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的分离的DNA编码的分离和纯化的葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶。
14.如权利要求13所述的分离和纯化的葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶，其特征在于，该酶具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
15.一种具有SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列的重组葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶。
16.如权利要求15所述的重组葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶，其特征在于，所述葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶是由SEQ ID NO.30所示序列的核酸片段编码的。
17.一种产生权利要求15所述的重组葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤获得一种载体，所述载体含有一表达区，此表达区含有编码与启动子可操纵性连接的SEQ ID No.31所示的氨基酸序列的(DNA)序列；将所述载体转染入细胞；和在有效表达所述表达区的条件下培养所述细胞。
18.一种治疗需要治疗的个体的隐球菌病的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤将权利要求13所述的分离和纯化的葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶给予所述个体。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述个体患有一种或多种隐球菌性脑膜炎并发症。
20.一种含有纯化的葡糖醛木甘聚糖-O-乙酰水解酶的药盒。
全文摘要
本发明提供了一种能对新型隐球菌的葡糖醛木甘聚糖脱O－乙酰基的新酶和编码该酶的基因。还提供了这种酶在治疗隐球菌病中的应用。
文档编号A61K38/46GK1373801SQ00812747
公开日2002年10月9日 申请日期2000年8月4日 优先权日1999年8月9日
发明者T·R·科泽尔, S·L·布卢默, A·C·萨瓦 申请人:研究发展基金会