专利名称：林蛙卵油注射液及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种林蛙卵油注射液及其制备工艺。
林蛙(Rana Temporaria Chensinensis David)也称哈士蟆为脊索动物门，两牺纲，无尾目，蛙科，蛙亚科，林蛙属，中国林蛙种等十几个种。林蛙是我国传统名贵补品和滋补性中药材，史料最早见于《饮片新参》，记载林蛙及其输卵管(蛤蟆油)补而不燥，润肺生津，入肾，清肺润喉。历代医书均作为补品将其著录，其产品为哈士蟆油(林蛙输卵管)及哈士蟆即林蛙的干燥全体。
近年，我国学者李成义对林蛙卵进行溶剂提取并分析证明林蛙卵中含有丰富的氨基酸，三十多种微量元素，多种不饱和脂肪酸，维生素D、E，雌激素和孕激素等多种生物活性物质(中药及天然药物1994；29712)。中国专利CN1066590A公开了活取哈士蟆油及卵的方法；CN1117352A公开了中华雪哈精(活取的哈士蟆油及卵)及其组合物制成保健食品的方法。中国专利CN1212140公开了促钙吸收作用的林蛙卵组合物，这些方法揭示林蛙卵含有丰富的营养物质，对机体具有多方面的调节作用。
本发明采用了CO2超临界萃取技术提取林蛙卵油(专利申请号0012306.8)，并将其制成软胶囊，发现其具有显著降血脂作用。进一步研究发现林蛙卵油注射给予动物后具有强大抗惊厥作用。因此，本发明将不同方式提取出的林蛙卵油制成注射液，以注射用药途径发挥其中枢抑制作用。经多种渠道检索，未发现林蛙卵油注射液为人们所知的证据。
林蛙卵油注射液采用林蛙为原料，将提取出的林蛙卵油制成注射液。其中林蛙卵油采用CO2超临界萃取，溶剂提取或物理压榨提取。注射液含有林蛙卵油作为构成成分，还有其他成分和制剂辅料，如稀释剂、乳化剂、助溶剂、抗氧剂等，其他有助于制剂成型和稳定的注射剂辅料也可应用。
在辅料中稀释剂可以包括橄榄油、花生油、豆油、玉米油、油酸、注射用水等。乳化剂可以包括磷脂类、司盘类、吐温类等；高PC值大豆磷脂、司盘80、吐温80是优选的乳化剂。助溶剂可以包括磷脂类、甘油等。抗氧剂可以包括维生素E、维生素C等。
林蛙卵油注射液配方中各成分的配比为林蛙卵油5～70％，豆油0～80％，磷脂0～90％，司盘80 0～1％，吐温80 0～1％，甘油0～30％，维生素E 0～5％，注射用水40～70％。
和以往的发明相比，本发明有以下改进一、将林蛙卵提取物制成注射液。
二、林蛙卵油给动物注射具有显著抗惊厥作用。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。
1、林蛙卵的超临界提取1.1受试物林蛙卵由辽宁省清原县南山城镇大北岔村北岔沟林蛙管理场提供，产地是柳河的源头，约北纬42度3分，东经125度23分。受试物为林蛙的干燥卵，呈黑色颗粒状，鱼腥味固体。
1.2仪器设备250升超临界萃取装置由大连光明化工研究设计院研制。
1.3实验方法取去掉输卵管后的林蛙，令其充分阴干，将干燥的卵小心剥出，收集在一起，拣净杂质，将卵粉碎成粗粉，称取200公斤，装入250升CO2超临界萃取罐内，加入10公斤乙醇作为夹带剂，用CO2超临界萃取装置压力逐渐升高到35MPa、温度33℃条件下萃取180分钟，CO2流量39.8，分离罐1的压力为8MPa，分离罐2的压力为4Mpa，然后在分离罐中分离油，将卵油静置后过滤并减压回收乙醇，得提取物25kg。收率为12.5％。
2、林蛙卵油注射液的制备2.1最佳配方的筛选为使林蛙卵油制成制剂后稳定，考察林蛙卵油与其它一些辅料的互溶情况。
2.1.1单因素试验2.1.1.1林蛙卵油与司盘类表面活性剂的互溶性比较将林蛙卵油分别与司盘(Span)60、65、80、85按10∶1和10∶0.5两个比例混合，所得处方记为A、B、C、D、E、F、G、H，同时配制两份，一份于30℃加热混合，另一份于45℃加热混合，考查混溶速度和程度。结果C、D两样品即Span80较好，45℃时混溶时间仅需1分钟，其中D仅需40秒。30℃时混溶较慢。
2.1.1.2林蛙卵油与植物油混溶比较将林蛙卵油分别与橄榄油、花生油、豆油、玉米油和油酸按10∶1、10∶2、10∶3三个比例混合，所得处方记为a、b、c、d、e、f、g、h、I、j、k、I、m、n、o，于45℃混合，结果均能成为澄清透明的液体，但放至室温24小时后，橄榄油、花生油、豆油组均有少量沉淀，玉米油和油酸组较好。
2.1.1.3林蛙卵油与玉米油、油酸和Span60混合比例筛选按林蛙卵油玉米油Span60和林蛙卵油油酸Span60为10∶1∶0.5和10∶2∶0比例混合，结果所得溶液放置1周后有分层现象并有析出物。在此处方中加入10％维生素E未能解决。
2.1.1.4林蛙卵油与玉米油、油酸和磷脂混合将上述“2.1.1.2”配方中的Span换成不同规格的磷脂(包括德国进口和国产的注射级和口服磷脂)，比例不变，分别记为a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2、e1、e2、f1、f2，实验发现，口服磷脂与林蛙卵油不能混溶，注射级的磷脂可以与林蛙卵油、玉米油、油酸混溶，考虑油酸易氧化，将来的配方中不采用；国产磷脂价廉，将来配方中采用。
林蛙卵油与玉米油、豆油和国产磷脂混合将林蛙卵油与玉米油、豆油和磷脂按10∶2∶2、10∶2∶4、10∶4∶2、10∶4∶4混合制备8个配方，分别记为1、2、3、4、5、6、7、8，结果所有配方中以林蛙卵油、豆油、磷脂的比例为10∶4∶2和10∶4∶4较优，室温放置二周末见变化，外观仍澄清透明，但放至第三周时，有少许分层。
2.1.1.6林蛙卵油与豆油、磷脂、乙醇；林蛙卵油与豆油、磷脂、丙二醇；林蛙卵油与豆油、磷脂、聚乙二醇分别按10∶4∶4∶1，10∶4∶4∶2两种比例制备6个配方，记为11、22、33、44、55、66，结果配方11、22最佳，余者放置一周后有少量分层，但从流动性方面均要优于以前配方。
2.1.1.7考查tween80、20对配方的影响在上述处方中分别加入5％、10％tween80和tween20，结果在配制的24个配方中，所有溶液外观均较未加tween的溶液优。考虑tween80常用，故选择tween80为随后的配方组分。
2.1.1.8联合Span80和tween80将上述配方中tween80用Span80和tween80的混合物(1∶1)代替，制备12个配方，结果含有聚乙二醇的配方较差，其它配方较好。在较好的6个配方中加入抗氧剂维生素E和BHT(加入量为0.5％)，未对溶液的外观有影响，所有配方放置一月后，仍然较好。
2.1.2正交试验在上述百余个配方基础上，筛选出5个对配方外观有较大影响的因素，即林蛙卵油、豆油、磷脂、Span80和tween80，将每个因素划分4个水平，采用L16(45)正交表安排试验，进行配方优化。林蛙卵的四个水平分别为40g、50g、60g、70g；豆油的四个水平为60g、50g、40g、30g；磷脂的四个水平为40g、30g、20g、10g；Span80四个水平为1g、0.75g、0.5g、0.25g；tween80的四个水平为0.25g、0.5g、0.75g、1g。按此正交表安排实验。
结果配方1、2、7、10、13外观最优，为澄清透明液体，长期放置未有改变。由此确定最佳比例范围为林蛙卵油∶豆油∶磷脂∶span80∶tween80＝40～60∶30～50∶20～40∶0.5～1∶0.25～0.75。为了降低成本，有必要减少磷脂用量，同时，应采用高浓度药物的配方，故而最后选择林蛙卵油∶豆油∶磷脂∶span80∶tween80＝60∶30∶20∶0.5∶0.5。用此处方重复配制三次，所得溶液的外观均澄清透明。
2.2林蛙卵油注射液配方2.2.1乳化剂用量将林蛙卵油与磷脂按10∶1～10∶5制备乳剂，结果当受试物与磷脂的重量比为10∶1时，难以制成乳剂，而重量比为10∶2～10∶5时，可制成乳剂，将所制成的乳剂用均质机进行均质化后，所得乳剂一月内稳定。2.2.2注射用油用量将林蛙卵油与注射用豆油按10∶5～10∶50混合后，加入上述配方量的磷脂，制备乳剂，结果林蛙卵油与注射用豆油比例为10∶10以上的配方可制成乳剂，用均质机进行均质化，所得乳剂粒度均匀，长期放置不分层。
2.2.3制备方法取蛙油50g、注射用豆油100g混合后得到油相，备用；另将磷脂20g与甘油50g分散在500ml注射用水中，制得水相。将油相加入水相中，进行乳化，并用均质机进行均质化，用注射用水加至1000ml，即得林蛙卵油注射液。
3林蛙卵油注射液的药理研究3.1动物昆明种小鼠，由沈阳药科大学动物室提供，鼠龄6周，体重18～21g，随机分组后置于温度20～24℃，恒温(55±5％)，12小时光照(08∶00—20∶00)，12小时黑暗，隔音的动物室内，自由摄食，饮水，适应上述环境一周后用于实验。
3.2试剂硝酸士的宁由上海禾丰制药有限公司提供，批号000601。
3.3方法取小鼠随机分为5组，第一组为模型对照组，腹腔注射(ip)空白注射液10ml/kg；第2到5组注射林蛙卵油0.11，0.42，1.68mg/kg；第5组ip戊巴比妥钠2.5mg/kg。注射林蛙卵油等5分钟后，小鼠腹腔注射硝酸士的宁1.5mg/kg，尔后计数发生惊厥的动物数。
3.4统计各组数据的组间比较用X2检验统计。
3.5结果小鼠接受士的宁注射后很快发生惊厥，对照组小鼠惊厥发生率达到84％，林蛙卵油三个剂量组惊厥发生率分别为69％，43％和33％。其中，低剂量组与对照组比没有统计显著性，中、高剂量组则可显著降低惊厥发生动物数，戊巴比妥钠亦显著降低惊厥发生率(60.4％)。
表1林蛙卵油的抗惊厥作用(X±SD)组别剂量(mg/kg) 动物数(只) 惊厥动物数(只) 死亡数(只)模型对照 - 4941 30林蛙卵油 0.114833 24林蛙卵油 0.424921*10*林蛙卵油 1.684816*12*戊巴比妥钠 2.505329*7*和模型对照组比*p＜0.0权利要求
1.一种林蛙卵油注射液，其特征在于该注射液是以林蛙卵油为主要成分配以制剂辅料组成，制剂辅料包括稀释剂、乳化剂、助溶剂、抗氧剂等，其他有助于制剂成型和稳定的注射剂辅料也可应用。
2.根据权利要求1所述的林蛙卵油注射液，其特征在于该注射液辅料中的注射用稀释剂可以包括橄榄油、花生油、豆油、玉米油、油酸、注射用水等。
3.根据权利要求1所述的林蛙卵油注射液，其特征在于该注射液的乳化剂可以包括磷脂类、司盘类、吐温类等；高PC值大豆磷脂、司盘80、吐温80是优选的乳化剂。
4.根据权利要求1所述的林蛙卵油注射液，其特征在于该注射液的助溶剂可以包括磷脂类、甘油等。
5.根据权利要求1所述的林蛙卵油注射液，其特征在于该注射液辅料中的抗氧剂可以包括维生素E、维生素C等。
6.根据权利要求1所述的林蛙卵油注射液，其特征在于林蛙卵油与配方中各成分的配比为林蛙卵油5～70％，豆油0～80％，磷脂0-90％，司盘80 0～1％，吐温80 0～1％，甘油0～30％，维生素E 0～5％，注射用水40～70％。
7.一种如权利要求1所述的林蛙卵油注射液的制备工艺，其特征在于按林蛙卵油，注射用豆油，磷脂，甘油，注射用水的重量比为5∶10∶2∶5∶50的比例取林蛙卵油、注射用豆油混合后得到油相，备用；另将磷脂与甘油分散在注射用水中，制得水相；将油相加入水相中，进行乳化，并用均质机进行均质化，最后用注射用水补充至原水量的两倍，过滤，用1ml安瓶罐装，灭菌，检查，印字，包装。
8.根据权利要求1所述的林蛙卵油注射液，其特征在于该注射液可用于制备具有抗惊厥作用的药物中。
全文摘要
本发明是一种林蛙卵油注射液及其制备工艺,它是将林蛙卵油制成注射液,可以注射用药途径给药,它是以中国林蛙卵为原料,配以制剂辅料组成,制剂辅料包括稀释剂、乳化剂、助溶剂、抗氧剂等。配方中各成分的配比为:林蛙卵油5～70%,豆油0～80%,磷脂0～90%,司盘80 0～1%,吐温80 0～1%,甘油0～30%,维生素E 0～5%,注射用水40～70%,乳化后进行均质化。该注射液具有中枢抑制和抗惊厥作用。
文档编号A61K35/56GK1343496SQ01114070
公开日2002年4月10日 申请日期2001年6月15日 优先权日2001年6月15日
发明者徐峰, 邓意辉, 彭飞 申请人:沈阳药科大学