专利名称：东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法
技术领域：
本发明涉及一种生物的分子鉴别方法，主要针对东北林蛙动物种及其产 品卵油的分子鉴别方法。
背景技术：
东北林蛙具有重要经济意义和医疗保健价值。雌蛙输卵管干制品入药， 称为林蛙油或哈士蟆油，为名贵的动物药材。该药材鉴定目前仍主要依据性 状特点、显微特征、理化性质等，但由于该药材缺乏明显的形态鉴别特征和 特殊的化学成分，实践中对林蛙卵油的鉴定仍感到十分困难。
发明内容
针对东北林蛙和林蛙卵油在生产经营实践中难以从性状特点、显微特征、 理化性质等方面进行鉴定的问题，本发明应用分子生物学技术解决林蛙卵油 及其药源动物东北林蛙的分子鉴定，提供了一种以PCR技术为基础，筛选特 异引物进行扩增，从而达到对东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，具体实现 步骤为
(1)基因组DNA提取
① 称取组织样品100 ~ 500 mg，剪碎，放入灭菌的1. 5ml的EP管中；
② 加入600ju 1 1 xSET液、20y 1蛋白酶K (10mg/ffll)、 25 y 1 SDS，温 度在55。C的条件下，空气浴2小时；
③ 加500 nl Tris饱和酚和200 yl TE上下颠倒10分钟；④ 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；
⑤ 加入等体积的酚氯仿异戊醇(24: 23: 1 ),再补加200 |a 1 TE混合10 分钟；
以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；
⑦ 加入等体积的氯仿异戊醇(23: 1 )，再补加200 n 1 TE混合10分钟；
⑧ 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；
⑨ 加入2倍体积的无水乙醇(-20。C预冷)，水平摇动30次，用枪头挑出 白色DNA沉淀；
⑩ 加入700 |i 1 70 %的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙 醇，自然干燥；
加入TE溶液50 100n 1，置于55。C水浴3~4小时； 在4。C下保存。 (2 )基因组DNA检测与浓度测定
用紫外分光光度计测定DM浓度根据记录的OD260/28G比值，估测DNA 质量，OD260/280在1. 6~ 1. 8之间，可以满足试验要求；根据记录的OD260 数值及测试液稀释倍数，换算出DNA的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以 50ng/iul分装，作为工作液4'C保存使用。 (3 ) PCR扩增
采用特异引物(F: 5' - GCC TTT CTA CCG CAA ATA - 3'; R: 5' - AGG TGC TTT TTT TCT GGG -)于PCR仪中进行扩增。 (4)特异扩增产物鉴别
扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，IOOV恒压，EB染色；在凝胶图谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在lOOObp 处扩增出特异条带，无性别和个体差异，作为东北林蛙及卯油鉴别的特征谱带。
本发明的特点及有益效果
本发明从分子生物学基本理论出发，应用现代分子标记技术对东北林蛙 和卵油进行分子鉴别，具有理论基础科学可信，技术手段和实现步骤先进合 理，以及检测结果可靠等特点。本发明中，PCR扩增引物的筛选和琼脂糖凝胶 电泳特征谱带的检测是中心环节，多次反复检测试验证明，所筛选引物特异 性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带(1000bp)稳定性高，在实际应用中能够获 得可靠而有益的效果。
图1林蛙样本特异引物DNA扩增图谱
具体实施例方式
东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，该方法是一种以PCR技术为基础， 筛选特异引物进行扩增，实现对东北林蛙和卵油的分子鉴别，具体实现步骤 为
(1)基因组DNA提取
① 称取组织样品100 ~ 500 mg,剪石卒，》史入灭菌的1. 5ml的EP管中；
② 加入600 pl lxSET液、20yl蛋白酶K (10mg/ml)、 25 n 1 SDS,温 度在55'C的条件下，空气浴2小时；
③ 加入S00jal Tris饱和酚和200jal TE上下颠倒10分钟； 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑤加入等体积的酚氯仿异戊醇(24: 23: 1 )，再补加200 ja 1 TE混合10 分钟；
以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；
⑦ 加入等体积的氯仿异戊醇(23: 1 ),再补加200 y 1 TE混合10分钟；
⑧ 以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水，相下层去掉；
⑨ 加入2倍体积的无水乙醇(-20。C预冷)，水平摇动30次，用^T头挑出 白色DNA沉淀；
⑩ 加入700ial 70%的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙 醇，自然干燥；
加入TE溶液50 100ili1,置于55。C水浴3 4小时； 在4。C下保存。 (2 )基因组DNA检测与浓度测定
用紫外分光光度计测定DNA浓度根据记录的OD260/280比值，估测DNA 质量， 一般0D2 6 0/280在1. 6 ~ 1. 8之间，可以满足试—睑要求；根据记录的0D26 0 数值及测试液稀释倍数，换算出DM的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以 50ng/jil分装，作为工作液4。C保存使用，DM原液置于-20。C保存。 (3 ) PCR扩增
用引物(F: 5' — GCC TTT CTA CCG CAA ATA - 3'; R: 5' - AGG TGC TTT TTT TCT GGG-3')于PCR仪中进行特异扩增反应； PCR扩增反应体系组成
10xPCR buffer为2. 1， 10mmol/LdNTP为2. 0 n 1 ， Primer( F )10pmo1/ p 1为1. 0 i-i 1 ， Primer ( R ) lOpmol/ ju 1为1. 0 n 1, Taq DNA polymerase为0. 2jj 1 (1U), Template为2. 0ja l( 50ng/ p 1 )， Autoclaved， distilled water 为16. 3 m 1。总体积为25ul。 PCR扩增反应程序
在94. (TC预变性7min，然后进入如下循环94. O'C变性50s、 56. 9'C复 性lmin、 72. (TC延伸lmin,循环35次，循环结束后72. (TC再延伸lOmin。 (4)特异扩增产物鉴别
扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测，IOOV恒压，EB染色；在凝胶图 谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在lOOObp 处扩增出特异条带，无性别和个体差异，可以作为东北林蛙及卵油鉴别的特 征谱带。 实施例
对采购自吉林长白山地区的东北林蛙和卵油真伪作鉴别对象。 东北林蛙和卵油样本各取3个。具体操作步骤如下 (1)基因组DNA提取
① 用电子天平(FA1604N，上海精密科学仪器厂)称取样本组织200mg (东 北林蛙样本取肌肉组织)，用70%酒精清洗，灭菌剪刀剪碎，放入1.5ml的 EP管中，自然风干30 ~ 60分钟使酒精挥发；
② 向EP管中加入600jal lxSET液、20 n 1蛋白酶K (10mg/ml )、 25 u 1 SDS,用空气浴振荡器(CHA-S,深圳天南海北有限^^司)55。C下空气浴2小
时；
③ 向EP管中加入500 |a 1 Tris饱和酚和200 ja 1 TE上下颠倒10分钟；
④ 用高速离心机(Biofuge primo R,德国SORVALL公司)以10000转/分钟，离心10分钟，吸取上层水相，下层去掉；
⑤ 加入等体积的酚氯仿异戊醇(24:23:1 )，再补加200 |al TE液混合
io分钟；
⑥ 用高速离心^^以10000转/分钟，离心10分钟，吸取上层水相，下层
去掉；
⑦ 加入等体积的氯仿异戊醇(23: 1 )，再补加200 ja 1 TE液混合10分钟；
⑧ 用高速离心机以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去
掉；
⑨ 加入2倍体积的无水乙醇(-2(TC预冷)，水平摇动30次，用枪头挑出 白色DNA沉淀；
⑩ 加入700jul 70%的冷乙醇，用高速离心^L以8000转/分钟，离心5 分钟，倒掉乙醇，自然干燥；
@加入TE溶液50 iu 1,用电子恒温水浴锅(WB14，亿博科技发展有限公司) 55'C水浴3小时；
在4。C下保存。 (2 )基因组DNA检测与浓度测定
用紫外分光光度计(OPTIZEN 2120UV,韩国美卡希斯)测定MA浓度测 定的OD260/280比值在1.70 1. 80之间，说明DNA质量较好，可以满足试验 要求；根据OD260的数值计算出DNA浓度为U0ng/ ja 1。稀释成50ng/ m 1分 装，作为工作液4。C保存使用。 (3 ) PCR扩增
用引物(F: 5' - GCCTTTCTACCGCAAATA-3'; R: 5' - AGG TGC TTT TTTTCT GGG - 3' X北京六合华大基因科技公司合成)于PClHWMyCycler Thermal Cycler, Bio-rad)中进行特异扩增反应； PCR扩增反应体系组成
10 x PCR buffer为2. 5jul， lOmmol/L dNTP为2. 0 n 1, Primer( F )10pmol/ iu 1为1. 0 |n 1， Primer (R) lOpmol/ n 1为1. 0 ju 1, Taq DNA polymerase为 0.2jul (IU)， Template为2. Oyl (50ng/jul)，灭菌双蒸水(Myl 1 i-Q Biocel 超纯水一f义自制)16. 3|al。总体积为25ul。 PCR buffer、 dNTP和Taq DNA polymerase购自Generay Biotech (Shanghai) Co. Ltd。 PCR扩增反应程序
在94. (TC预变性7min，然后进入如下循环94. (TC变性50s、 56. 9'C复 性lmin、 72. (TC延伸lmin，循环35次，循环结束后72. (TC再延伸lOmin。 (4)特异扩增产物鉴别
扩增产物用EC250-90 (美国热电公司)电泳仪电泳;f企测。琼脂糖凝胶浓 度1. 2 % ，将6个样本的PCR扩增产物和DM分子量标记(DNA Marker DL2000 购自Shanghai Generay Biotech Co. Ltd)分另'J力口入力口才羊孑L内，同曰于i殳定一个 阴性对照，IOOV恒压电泳，EB染色。参看图1，在凝胶成像分析系统(440CF, 美国柯达公司)上观察结果，林蛙样本1、 2和卵油样本5、 6基因组DNA在 lOOObp处扩增出清晰条带，可以认定所^r测样本确为东北林蛙和卵油真品； 而林蛙样本3和卵油样本4则在lOOObp处无特征谱带，认定所检测样本为东 北林蛙和卵油伪品。图1中7为阴性对照，M是DNA Marker。
权利要求
1、东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，其特征在于该方法是一种以PCR技术为基础，筛选特异引物进行扩增，实现对东北林蛙和卵油的分子鉴别，具体实现步骤为(1)基因组DNA提取①称取组织样品100～500mg，剪碎，放入灭菌的1.5ml的EP管中；②加入600μl 1×SET液、浓度为10mg/ml的蛋白酶K20μl、25μl SDS，温度在55℃的条件下，空气浴2小时；③加500μl Tris饱和酚和200μl TE上下颠倒10分钟；④以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑤加入等体积的酚:氯仿:异戊醇＝24:23:1，再补加200μl TE混合10分钟；⑥以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑦加入等体积的氯仿:异戊醇＝23:1，再补加200μl TE混合10分钟；⑧以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑨在-20℃温度下预冷，加入2倍体积的无水乙醇，水平摇动30次，用枪头挑出白色DNA沉淀；⑩加入700μl 70％的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；加入TE溶液50～100μl，置于55℃水浴3～4小时；在4℃下保存。(2)基因组DNA检测与浓度测定用紫外分光光度计测定DNA浓度根据记录的OD260/280比值，估测DNA质量，OD260/280在1.6～1.8之间，可以满足试验要求；根据记录的OD260数值及测试液稀释倍数，换算出DNA的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以50ng/μl分装，作为工作液4℃保存使用。(3)PCR扩增采用特异引物(F5′-GCC TTT CTA CCG CAA ATA-3′；R5′-AGG TGCTTT TTT TCT GGG-3′)于PCR仪中进行扩增。(4)特异扩增产物鉴别扩增产物经1. 2％琼脂糖凝胶电泳检测，100V恒压，EB染色；在凝胶图谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在1000bp处扩增出特异条带，无性别和个体差异，作为东北林蛙及卵油鉴别的特征谱带。
2、 根据权利要求l所述的东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，其特征在 于所述PCR扩增反应总体积为25ul，其中包括以下各組分10 x PCR buffer 为2. 5)il， 10麵1/L d證为2. 0|il, Primer (F) lOpmol/pl为1. 0|al， Primer (R) lOpmol/ ja 1为1. 0 u 1, Taq DNA polymerase为0. 2 p 1 (1U ), Template为2. 0 ja 1 ( 50ng/|u 1), Autoclaved， dis t i 1 led water为16. 3 ja 1。
3、 根据权利要求1所述的东北林蛙及其卵油的分子鉴別方法，其特征在 于所述PCR扩增反应程序为，在94.G。C预变性7min,然后进入如下循环 94. (TC变性50s、 56. 9。C复性lmin、 72. (TC延伸lmin，循环35次，循环结束 后72. (TC再延伸10min。
全文摘要
东北林蛙和卵油的分子鉴别方法，是为了解决对东北林蛙及其产品卵油的鉴定，目前仍主要依据性状特点、显微特征、理化性质等，这些依据由于缺乏明显的形态鉴别特征和特殊的化学成分，实践中对卵油的鉴定仍感到十分困难的技术问题而设计的。该鉴别方法是一种以PCR技术为基础，筛选特异引物进行扩增，从而达到对东北林蛙和卵油的分子鉴别。具体实现步骤为(1)基因组DNA提取；(2)基因组DNA检测与浓度测定；(3)PCR扩增；(4)PCR扩增产物鉴别。特点及有益效果从分子生物学基本理论出发，应用现代分子标记技术对东北林蛙和卵油进行分子鉴别，具有理论基础科学可信，技术手段和实现步骤先进合理，及检测结果可靠等特点。以及所筛选引物特异性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带稳定性高，在实际应用中能够获得可靠而有益的效果。
文档编号C12Q1/68GK101434995SQ200810229620
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者杨宝田 申请人:沈阳师范大学