专利名称：反式二苯乙烯衍生物在预防或治疗肝纤维化中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及反式二苯乙烯衍生物在预防或治疗与肝纤维化有关疾病的新用途及含反式二苯乙烯衍生物的药物组合物。
肝纤维化是肝硬化的早期，是众多肝病缠绵难愈甚至恶变死亡的主要原因，也是阻止慢性肝病发展的关键环节。在我国导致肝纤维化的主要原因是感染肝炎病毒。据报道国内乙型肝炎病毒的感染率为42.4～80.77％，最近几年，由丙型、戊型、庚型等肝炎病毒引起肝炎的病例报道逐渐增多。由于由肝炎病毒引起的肝脏损伤缺乏有效的根除方法，常会缓慢发展成肝纤维化，最后发生肝硬化。可见由肝炎病毒感染导致肝纤维化的危害性。除肝炎病毒感染外，寄生虫感染、酒精、营养不良和辐射等均可导致肝纤维化。如在我国有饮白酒的习惯，酒精性肝纤维化病例比较多见。近几十年来人们一直在寻找治疗和/或预防肝纤维化的药物，并已开发出了一些治疗肝纤维化的药物，化学药物有秋水仙碱和氧化苦参碱等；中药有丹参注射液、软肝片等；生物制品有干扰素、促肝细胞生长素等。但这些药物由于副作用或使用效果不佳等原因，未达到令人满意的治疗效果。因此，研究和开发新型抗肝纤维化的药物十分需要。据国内外文献报道，二苯乙烯类化合物具有抗血小板聚集和抗肿瘤等作用。
本发明的目的是提供一类新的预防或治疗肝纤维化药物，其具有优良的疗效。
本发明人经过广泛深入的研究，在筛选抗肝损伤的药物过程中出人意料地发现反式二苯乙烯衍生物对肝炎病毒和酒精等引起的慢性肝病，尤其是肝纤维化有明显的预防和治疗作用。本发明基于上述发现得以完成。
本发明第一个目的涉及式I的反式三羟基二苯乙烯在制备用于预防或治疗与肝纤维化有关疾病的药物中用途。 本发明的第二个目的涉及式II新的反式二苯乙烯衍生物。 R1-R5、和R’1-R’7可相同或不同，分别为H、OH和甲氧基(OMe)。条件是R2、R4和R’3不能同时为OH。
本发明再一个目的涉及含式I或式II化合物及药用载体或赋形剂或添加剂的药物组合物，该药物组合物具有抗肝纤维化作用。根据本发明，该药物组合物中可加入有各种药用赋形剂、添加剂及载体。
根据本发明，本发明的式I或式II化合物或含式I或式II化合物的药物组合物可用于各种原因引起的肝纤维化。
根据本发明，本发明的药物组合物可按本领域已知方法配成肠道或非肠道给药的制剂，如片剂、胶囊、粒剂、注射液等。
根据本发明，本发明的式I或式II化合物，主要来自植物，如决明子。其中式II化合物可通过半合成法对式I化合物进行化学修饰或将其作为中间体合成得到。
根据本发明，反式三羟基二苯乙烯可从豆科植物决明子提取得到，该方法包括决明子先用50％甲醇水溶液提取，过滤后滤液真空干燥，所得醇提液再用乙酸乙脂萃取，有机相真空干燥后上硅胶柱梯度，洗脱液为氯仿∶甲醇。收集的组份进一步用HPLC处理，得到单体反式三羟基二苯乙烯。
下面将通过反式三羟基二苯乙烯(以下简称为化合物A)制备、反式二苯乙烯衍生物(2，3，4-三甲氧基二苯乙烯)的制备和在动物体内的抗纤维化作用来进一步阐明本发明。实施例1化合物A的制备决明子1.0kg，粉碎后室温下用50％甲醇水溶液浸提三次，每次3天。滤液合并过滤后真空干燥，得醇提取物100g，再用乙酸乙脂萃取三次(500ml/次)，有机相合并后真空干燥后得膏状物30.0g。膏状物再经硅胶柱层析，梯度洗脱，洗脱液为氯仿∶甲醇(50∶1～10∶1)。得10个组分，组分5(3.0g)进一步用C18柱HPLC分离，得到单体(100mg)。与标准品光谱比较确定为反式三羟基二苯乙烯。实施例2反式二苯乙烯衍生物(2，3，4-三甲氧基二苯乙烯)的制备反应式如下
以甲氧基钠为碱，在DMF中经化合物B(可从市售获得)与化合物C(可从市售获得)反应可得到反式三甲氧基二苯乙烯的衍生物。用10ml干燥的DMF溶解B(12mmol)，0℃条件加入到磁力搅拌器搅拌下的0.65g甲醇钠(溶解于10ml干燥的DMF中)，搅拌30min。用10ml干燥的DMF溶解苯甲醛(10mmol)，在0℃条件加入到上述反应体系中。反应体系放置于室温1.5小时，再在1小时内加热至95～100℃，在室温下过夜。反应物在碎冰中降温，沉淀过滤，水洗后干燥，乙酸乙脂-己烷中结晶，析出2，3，4-三甲氧基二苯乙烯(2.34g)。溶点79-82℃，IR(KBr)cm-13020，3000，2940，2840，1600，1510，1470，1420，1300，1260，1230，1090，1030，1000，980；1H NMR(CDCl3)δ7.60-7.50(m，2H)，7.40-7.20(m，5H)，6.90(d，J＝16.5HZ，1H)，6.70(d，J＝16.5HZ，1H)，3.91(s，3H)，3.90(s，3H)，3.89(s，3H)；CIMSm/z271(MH+，100)，C17H18O3。实施例3化合物A在动物体内的抗肝纤维化作用1药物和动物1.1受试药物药物名称反式三羟基二苯乙烯(化合物A)。
配制方法用0.1％羧甲基纤维素钠混匀悬浮。
保存条件4℃保存。1.2动物动物来源、品种、合格证采用军事医学科学院实验动物中心繁殖的Wistar大鼠，动物合格证编号为医动字01-3039。
体 重120-140g。
性 别雌雄各半，雌性动物无怀孕。
饲养条件共100只大鼠领取动物进入实验室后，适应性饲养1周，每笼1只，饲以军事医学科学院实验动物中心为大鼠制作的标准饲料，每天上下午定时饲食一次，自由饮水。实验室定时通风，光照良好，自然室温。动物实验条件合格证编号为医动字第01-2050。2肝纤维化模型与给药方案2.1大鼠肝纤维化模型依据文献资料，采用复合因素造模法。造模动物于实验第1天皮下注射40％CCl4液体石蜡溶液5ml/kg，以后每周两次皮下注射上述液体3ml/kg。配以高脂低蛋白食物，即以玉米面为饲料，加0.5％胆固醇，加20％的猪油。10％的酒精为饮用水。共6周。将上述造模动物分组并给予受试药物后各组动物均给以正常饲料。2.2剂量设置及分组于造模开始第43天，分别从造模动物中随机取3只动物和正常对照中取3只。观察血清肝功能指标和病理组织学检查，确认造模动物进入明显的肝纤维化状态。根据动物的一般状态和体重均衡的原则，随机分成4组模型对照组、化合物A的三个剂量组。每组10只动物。另设正常对照组。
根据预试验资料，化合物A设小剂量为10mg/kg，中剂量为30mg/kg，大剂量为90mg/kg。2.3给药方法和时间分组后当天开始，采用灌服给药途径，每100g体重为0.3ml。给药时间为30天。3观测指标3.1血清肝纤维化相关指标血清III型前胶原(PCIII)，采用放免试剂盒方法。肝组织羟脯氨酸(Hyp)水平采用氯胺T法检测。方法简述如下将称量后的肝组织剪碎，置于磨口试管中用6mol/L HCl水解(125℃)3小时后，稀释到10ml，过滤。取滤液0.1ml加蒸馏水到1.0ml，充分氧化，加入0.5ml柠檬酸缓冲液和1.0ml氯胺T溶液(0.01mol/L)后6分钟，用过氯酸终止反应。加入10％p-DMAB1.0ml，于80℃水浴中保温6分钟，显色完全后冷却，最后在波长560nm处比色，测吸光度(A)，用下式计算Hyp含量肝组织Hyp含量(mg/g)＝(0.5×A样品/A标准)/肝重量。3.2肝组织病理学检查肝大体形态和肝组织HE染色和胶原纤维染色(Masson氏三合染色)后光镜下检查。大体观察内容有是否肿大、颜色、表面、边缘、质地等。取三块肝组织置10％中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，染色后光镜下检查。HE染色后检查包括肝小叶结构、纤维增生情况以及间隔是否形成和汇管区是否扩大、肝细胞索排列、肝细胞变性和坏死、间质炎细胞浸润和肝细胞再生情况，纤维化程度分级(0-4级)打分。肝组织内胶原纤维定量分析采用Quantimet970图像分析仪进行，测定有单位目标面积、面密度和积分光密度。4统计与分析各组结果用算术平均数±标准差表示。根据《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》的有关新药药效研究中统计处理的指导原则，计数资料用Fisher精确检验，计量资料选择方差分析，用Student t检验进行各组均数差异显著性检验。5试验结果5.1肝纤维化模型的形成大鼠皮下注射含40％CCl4的液体石蜡后，喂饲高脂低蛋白食物以及饮含10％酒精的水后，第1周大鼠即出现活动减少，食欲减退，表现为所剩饲料和水增多。第2周动物体毛失去光泽。第3周体毛蓬松明显，活动少，剩余饲料和水较多，有6只动物死亡。第4周死亡动物8只。至第6周共有20只大鼠死亡。
从同批正常动物和饲以特制饲料的造模型动物中各随机取3只，肝组织切片观察发现，造模动物肝细胞脂肪变性、肿胀和坏死等明显，汇管区有大量纤维组织增生，呈带状。结果表明，造模动物已进入明显的肝纤维化状态。5.2血清III型前胶原、肝组织羟脯氨酸给药1月后，用药组大鼠血清中III型前胶原水平明显降低，其中以受试药大剂量组最为显著(表1)。肝组织中羟脯氨酸水平可反映胶原纤维的代谢状况。给药后大鼠肝脏中Hyp水平下降，其中以大剂量组的效果最明显。
表1灌服化合物A后大鼠PCIII和Hyp水平的变化组 别 PCIII(μg/L) Hyp(mg/g)正常对照组 80.56±15.22### 0.15±0.04###模型对照组 173.61±12.89 0.61±0.13化合物A 10mg/kg 162.00±9.59* 0.57±0.18化合物A 30mg/kg 150.21±7.30*** 0.55±0.09化合物A 90mg/kg 109.20±3.32*** 0.44±0.08**注正常对照组与模型对照组比较，###P＜0.001用药组与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.0 1，***P＜0.0015.3肝脏胶原纤维的图象分析为客观评价受试药对大鼠肝纤维程度的影响，采用计算机图像分析仪器计算肝组织中胶原纤维所占面积。结果从表2可见，与模型对照组比较，用药组大鼠肝组织单位目标面积减少，面密度和积分光密度降低，尤其是受试药大剂量组的积分光密度下降明显，结果说明用药组大鼠肝组织内胶原纤维面积减少。
表2灌服化合物A后大鼠肝胶原纤维病理图像分析结果组 别单位目标面积(μm2/个) 面密度 积分光密度正常对照组26.50±12.47## 0.01342±0.00626###5.15±2.51##模型对照组60.61±25.94 0.04463±0.01639 3.56±9.78化合物A 10mg/kg 41.61±13.68 0.02632±0.00700** 14.78±8.72化合物A 30mg/kg 41.45±20.51 0.02737±0.01308* 13.68±6.96化合物A 90mg/kg 37.55±22.46 0.02547±0.00668***11.89±7.59*注正常对照组与模型对照组比较，##P＜0.01，###P＜0.001用药组与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0015.4病理组织学检查于给药1月麻醉大鼠取肝脏组织块，固定和常规H.E.染色。经光镜观察并按孙克伟所报道的肝纤维化分级标准(分为0、1、2、3四级)，对各肝脏形态打分结果如下正常对照组所有10只动物肝脏均未见门脉区有纤维组织增生。打分结果雄0、0、0、0、0；雌0、0、0、0、0；平均0分。
模型对照组雌、雄鼠各有1只其门脉区增生的纤维组织已向边缘延伸，但尚未在肝小叶周围尚未形成完整的纤维组织包绕外，其余各鼠均已形成明显的包绕。打分结果雄3、3、3、3和2；雌3、3、3、3和2；平均2.8分。
小剂量组雄、雌性鼠各有1只肝小叶周围尚未形成完整的纤维组织包绕，另1只雄鼠门脉区增生的纤维组织甚至尚未向小叶周围延伸，其余各鼠肝小叶周围均已形成完整的纤维组织包绕。打分结果雄3、3、3、2和1；雌3、3、3、3和2；平均2.6分。
中剂量组有2只雄鼠及3只雌鼠肝小叶周围尚未形成完整的纤维组织包绕，另有雌、雄各1只鼠门脉区增生的纤维组织尚未向肝小叶周围延伸。其余3只鼠肝小叶周围已有完整的纤维组织包绕。打分结果雄3、3、2、2和1；雌3、2、2、2和1；平均2.1分。
大剂量组有2只雄鼠及3只雌鼠肝小叶周围尚未形成完整的纤维组织包绕，另有雄、雌各1只鼠门脉区增生的纤维组织尚未向肝小叶周围延伸，其余3只鼠肝小叶周围已有完整的纤维组织包绕。打分结果雄3、3、2、2和1；雌3、2、2、3和1；平均2.1分。
结果发现，化合物A各剂量组对治疗肝纤维化均有抑制及减轻作用，其中中剂量和大剂量组效果明显。
表3灌服化合物A后大鼠肝组织纤维化程度组 别 动物数 纤维化程度(分数)正常对照组 10 0模型对照组 10 2.8±0.4化合物A 10mg/kg10 2.6±0.7化合物A 30mg/kg10 2.1±0.7*化合物A 90mg/kg10 2.1±0.7*阳性药组 10 2.2±0.6*注用药组与模型对照组比较，*P＜0.056结论上述结果表明，受试药化合物A对肝纤维化有明显的抑制及减轻作用。
权利要求
1.下式的反式三羟基二苯乙烯在制备用于预防或治疗与肝纤维化有关疾病的药物中的用途。
2.下式的反式二苯乙烯衍生物 其中R1-R5、和R’1-R’7可相同或不同，分别为H、OH和甲氧基(OMe)。条件是R2、R4和R’3不能同时为OH。
3.一种用于预防或治疗与肝纤维化有关疾病的药物组合物，其包括作为活性成份的权利要求1的反式三羟基二苯乙烯或权利要求2所要求的反式二苯乙烯衍生物及药用赋形剂或载体。
4.根据权利要求3的药物组合物，其中作为活性成份的权利要求1的反式三羟基二苯乙烯或下式的反式3，4’，5三羟基二苯乙烯。
5.权利要求2的反式二苯乙烯衍生物在制备用于预防或治疗各种原因引起的肝纤维化疾病的药物中用途。
6.权利要求3的药物组合物，其中所述药物组合物可被制成片剂、胶囊、注射液或其它适宜剂型。
全文摘要
本发明涉及反式三羟基二苯乙烯在预防或治疗与肝纤维化有关疾病上的新用途，新的反式二苯乙烯衍生物及含反式三羟基二苯乙烯或新反式二苯乙烯衍生物的药物组合物。
文档编号A61K31/09GK1401316SQ0112456
公开日2003年3月12日 申请日期2001年8月10日 优先权日2001年8月10日
发明者吕秋军, 郭绍明, 温利青, 董俊兴 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所