专利名称：二苯乙烯甙在制备治疗缺血性脑血管疾病的药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物和药用盐的用途，具体说是在制备治疗缺血性脑血管疾病，例如脑血栓、脑梗死、脑栓塞、脑供血不足等的药物中的用途。
脑组织的急性或慢性缺血，会导致脑细胞缺氧、脑水肿，脂质过氧化，细胞内钙离子浓度增高等系列病理生理反应，脑水肿引起细胞缺氧，酸中毒，自由基增多，细胞功能减低；脂质过氧化是细胞膜和细胞器膜受到自由基的损伤，形成过氧化脂质，它可引起膜损伤、酶抑制、溶酶体释放、蛋白交联、DNA和RNA结构破坏等生化毒性，最终可导致细胞死亡；细胞内钙离子增多，出现钙超载，损伤神经细胞。
发明人经动物试验发现，二苯乙烯甙化合物能够减低急性脑缺血再灌注小鼠脑含水量，抑制脑缺血再灌注小鼠模型脑组织脂质过氧化，增强脑缺血再灌注小鼠模型脑组织超氧化物歧化酶活性，减低脑缺血再灌注小鼠模型脑片细胞内钙离子浓度，减低光化学诱导急性脑梗塞小鼠模型脑血管损伤，提高双侧颈总动脉夹闭致脑缺血沙土鼠模型学习记忆能力，该化合物同时具备脑保护剂、钙拮抗剂、抗氧化剂等的用途，从而能够有效地防治缺血性脑血管疾病。
本发明的另一个目的是提供含有上述化合物、其衍生物或药用盐的药物组合物作为缺血性脑血管疾病的治疗剂的应用。在该组合物中还可以含有载体(如赋型剂)和其它任选成分。在该组合物中，本发明的二苯乙烯甙占10-90wt％，优选占50-90wt％。载体包括赋型剂等，例如硬脂酸镁、淀粉、乳糖、纤维素等。任选成分例如是着色剂、甜味剂等。
本发明的化合物、其衍生物或药用盐可以制成任何一种适合于临床上应用的剂型，包括固体制剂，如胶囊、片剂、颗粒制剂等，液体制剂如口服液等，或者注射剂。本发明化合物、其衍生物或药用盐的日剂量例如可以是5-50mg/kg体重，可以分一次或多次使用。
该化合物可以从中药何首乌中提取。该化合物可以用何首乌根通过普通高压液相色谱法制备。例如在LIQ.CHROM.&TECHNOL.，21(18)，2897-2904(1998)(Xueli Cao等人)中公开了它的制备方法。上式化合物可以进行衍生化，例如用酸，使上述结构式的化合物上的3-、5-和4’-位上的羟基的氢被酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基等所取代，或与卤代烃反应，使3-、5-和4’-位上的羟基的氢用烃基取代，如用C1-6烃基取代。上式化合物也可以其药学可接受的盐的形式使用。
实施例1 二苯乙烯甙(TSG)提高双侧颈总动脉夹闭致脑缺血沙土鼠模型学习记忆能力1.实验目的急性全脑缺血可造成神经元功能减退，包括胆碱能神经，导致学习记忆功能降低。本实验旨在观察TSG对双侧颈总动脉夹闭致脑缺血沙土鼠模型学习记忆能力降低的影响。(注沙土鼠天生缺如椎动脉系统，双侧颈总动脉夹闭可造成严重全脑缺血)2.实验方法沙土鼠连续灌胃给TSG 7天。.第7天后行双侧颈总动脉夹闭10分钟，再灌注5天后进行Morris水迷宫实验，检测其学习记忆能力。
Morris水迷宫测定主要由由圆形水池和自动录象及分析系统两部分组成。实验当天各组给药60分钟后，每只动物第一天训练4次，入池位置为站台所队象限及所邻象限，于象限边1/2弧度处将动物头朝池壁入水，120S未找到站台者，将其引致站台，放置30S引导其学习与记忆。第2、3和4天重复测试，数据采集和处理均由有图像自动监视和处理系统完成。
3.实验结果TSG给药组水迷宫游出时间和游泳距离与模型组相比明显缩短(表1)，表明该药能提高脑缺血沙土鼠学习记忆能力。
表1. TSG对脑缺血再灌注沙土鼠Morris水迷宫游出时间和距离的影响组别N游出时间(秒) 游泳距离(厘米)对照组(假手术组)518.28±15.38*377.4±354.7*模型组(缺血再灌)436.45±36.91 687.5±610.3TSG 38mg/kg+缺血再灌337.10±41.11 593.5±41.1TSG 114mg/kg+缺血再灌 525.57±22.75 508.6±422.6TSG 342mg/kg+缺血再灌 412.04±9.89**311.4±319.6*M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，与缺血模型组比较。实施例2 TSG减低急性脑缺血再灌注小鼠脑含水量1.实验目的急性全脑缺血再灌注导致神经细胞缺氧，能量代谢不足，离子通道开放等，进一步引起脑水肿，可产生严重的后果。本实验旨在观察TSG对急性脑缺血再灌注小鼠脑含水量增高的影响。
2.实验方法雄性昆明小鼠，体重22-28克，动物随机分组，实验前各组连续灌胃给药7天，假手术组及缺血模型组分别给予自来水。手术当日小鼠空腹给药后1小时，麻醉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉15分钟，再灌注15分钟后迅速断头取脑，去掉小脑，采用干—湿重方法计算脑水分含量，将分离的脑组织立即在分析天平称取湿脑重量，然后放入恒温干燥箱(110C±2)24小时烘干至恒重，称取干脑重量，根据湿脑重量和干脑重量差，计算出脑标本水分含水量值。
计算公式脑水分％＝(脑湿重量-干脑重量)/湿脑重量*100％3.实验结果TSG灌胃给药可降低急性脑缺血再灌注小鼠脑含水量(表2)，表明该药有利于防治脑缺血所致的脑水肿。
表2. TSG对急性脑缺血再灌注小鼠脑含水量的影响组别N脑含水量(％)对照组(假手术组)90.7796±0.0134*模型组(缺血再灌)90.7899±0.0041海得琴0.75mg/kg+缺血再灌10 0.7838±0.0116TSG 38mg/kg+缺血再灌10 0.7833±0.0119TSG 114mg/kg+缺血再灌 10 0.7801±0.0130*TSG 342mg/kg+缺血再灌 10 0.7830±0.0134M±SD；*P＜0.05，与缺血模型组比较实施例3 TSG抑制脑缺血再灌注小鼠模型脑组织脂质过氧化1.实验目的脑缺血后产生脂质过氧化增高，过氧化脂质增多。过氧化脂质是生物膜和细胞中磷质所含多元不饱和脂肪酸被自由基损伤、氧化而成的过氧化产物。它可引起膜损伤、酶抑制、溶酶体释放、蛋白交联、DNA和RNA结构破坏等生化毒性，最终可导致细胞死亡。本实验旨在观察TSG对脑缺血再灌注小鼠模型脑组织脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量增高的影响。
2.实验方法雄性昆明小鼠，体重22-28克，动物随机分组，实验前各组连续灌胃给药7天，假手术组及缺血模型组分别给予自来水。手术当日空腹给药后1h，于小鼠麻醉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉15分钟，再灌注15分钟后迅速断头取脑，去掉小脑。脑组织称重，1∶10加入0.2M磷酸盐缓冲液匀浆，3000转/分离心10分钟，取上清0.5ml，用硫代巴比妥酸(TAB)法测定脑组织中MDA含量。
3.实验结果TSG灌服可降低急性脑缺血再灌注小鼠脑组织MDA含量(表3)，表明该药可抑制脂质过氧化，其机理可能为减少自由基生成或增强自由基清除。
表3. TSG对急性脑缺血再灌注小鼠脑组织MDA含量的影响组别N MDA(nmol/mg蛋白)对照组(假手术组)101.093±0.151*模型组(缺血再灌)9 1.180±0.190海得琴0.75mg/kg+缺血再灌101.111±0.116TSG 38mg/kg+缺血再灌101.158±0.150TSG 114mg/kg+缺血再灌 101.002±0.147**TSG 342mg/kg+缺血再灌 101.030±0.131**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01与缺血模型组比较实施例4 TSG增强脑缺血再灌注小鼠模型脑组织超氧化物歧化酶活性1.实验目的超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基(O-2)，保护细胞免受损伤。本实验旨在观察TSG对脑缺血再灌注小鼠模型脑组织SOD活性降低的影响，探讨TSG抑制脑缺血小鼠模型脂质过氧化的机理。
2.实验方法雄性昆明小鼠，体重22-28克，动物随机分组，实验前各组连续灌胃给药7天，假手术组及缺血模型组分别给予自来水。手术当日空腹给药后1h，于小鼠麻醉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉15分钟，再灌注15分钟后迅速断头取脑，去掉小脑。脑组织称重，1∶10加入0.2M磷酸盐缓冲液匀浆，3000转/分离心10分钟，取上清0.1ml，用亚硝酸盐法测定脑组织中SOD活性。
3.实验结果TSG灌胃口服可增高急性脑缺血再灌注小鼠脑组织SOD活性(表4)，表明该药具有增强机体清除自由基的作用，这可能是其抑制脂质过氧化的机理。
表4. TSG对急性脑缺血再灌注小鼠脑组织SOD活性的影响组别N SOD(NU/mg蛋白)对照组(假手术组)105.219±0.051*模型组(缺血再灌)9 4.913±0.051海得琴0.75mg/kg+缺血再灌104.779±0.034TSG 38mg/kg+缺血再灌105.152±0.049TSG 114mg/kg+缺血再灌 105.111±0.074TSG 342mg/kg+缺血再灌 105.317±0.060**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，与缺血模型组比较实施例5 TSG减低脑缺血再灌注小鼠模型脑片细胞内钙离子浓度
1.实验目的脑缺血再灌注后，出现神经细胞内钙离子浓度升高，导致随后的钙超载、氧应激等损伤，最终可导致细胞死亡。本实验旨在观察TSG对脑缺血再灌注小鼠模型脑片细胞内钙离子浓度增高的影响。
2.实验方法雄性昆明小鼠，体重22-28克，动物随机分组，实验前各组连续灌胃给药7天，假手术组及缺血模型组分别给予自来水。手术当日空腹给药后1h，于小鼠麻醉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉15分钟，再灌注15分钟后迅速断头取出全脑，放入通有95％的CO2和5％O2的预冷的人工脑脊液中，在振动切片机上切出400um的脑片，放入CO2培养箱中，37℃孵育30min，加入5uM的Fluo-3AM 500ul，在CO2培养箱中负载1h后，冲洗数次，在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)上进行光学切片，观察荧光强度。
光学切片(光切)是激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)的特色之一，可以实现对离体活脑片进行连续无损切割，又称为“显微CT”，光切可以获得样品表面的和深层的信息，通过三维重建技术，可以获得三维图象和立体结构信息。钙荧光指示剂Fluo-3AM是一种脂溶性试剂，本身无荧光，穿过细胞膜后，在膜内酶的作用下，脱去酯基(AM)，与胞内游离钙结合后，出现荧光，利用激光扫描共聚焦显微镜测定荧光强度可以检测细胞内游离钙的水平。
图象处理利用LaserSharp图象处理系统，测定左右海马区、皮层区的面积或体积和总的荧光强度，以单位面积或单位体积荧光强度及荧光强度分布中值(即Mean，系统给出)为指标，观察海马、皮层的细胞内游离钙的水平。
统计方法实验数据均采用均值±标准差(x±s)表示，组间差异的显著性用t检验。
3.实验结果TSG灌胃口服可降低脑缺血再灌注小鼠模型大脑皮层和海马区神经细胞内钙离子浓度(表5)，这对于保护神经细胞具有重要意义。
表5. TSG对脑缺血再灌注小鼠模型神经细胞内钙离子的影响组别 N 细胞内钙离子荧光值皮层(Pix/um2)海马(Pix/um2)对照(假手术组) 3 0.6039±0.6350* 0.4718±0.4104*模型(缺血再灌组) 3 1.0439±0.26360.8385±0.2849海得琴0.75mg/kg+缺血再灌 3 0.3719±0.1379* 0.4406±0.2073*TSG 38mg/kg+缺血再灌 3 0.4476±0.1095** 0.4371±0.1013*TSG 114mg/kg+缺血再灌3 0.4735±0.2651** 0.6536±0.3179TSG 342mg/kg+缺血再灌3 0.5927±0.3140* 0.6607±0.3926M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，与模型组比较实施例6 TSG减低光化学诱导急性脑梗塞小鼠模型脑血管损伤1.实验目的造模原理将光敏物质(玫瑰红)注入小鼠尾静脉，以560nm波长的冷光源照射小鼠颅部，发生光化学反应，生成大量氧自由基，引起血管内皮细胞损伤，血小板聚集，在照射区内形成血栓，局部皮层缺血坏死。
本实验旨在观察TSG对光化学诱导急性脑梗塞小鼠模型脑血管损伤及缺血半暗区的影响。
2.实验方法给小鼠灌服不同剂量TSG，15天后造模。将光敏物质(玫瑰红)注入小鼠尾静脉，以560nm波长的冷光源照射小鼠颅部。在造模后3小时经舌静脉注入伊文斯兰染料，1小时后处死动物。处死后取脑组织制成匀浆，并以比色法测定平均脑组织的光密度。梗塞严重者，染色深，光密度大，缺血半暗区面积大。
3.实验结果实验发现灌服TSG可降低模型小鼠脑组织伊文斯兰的光密度，表明减轻了脑血管损伤和脑梗塞程度；TSG可减少模型小鼠缺血半暗区的面积(见表6)。
表6. TSG对光化学诱导脑梗塞小鼠模型的影响组别 n伊文斯兰(OD值)缺血半暗带面积模型组60.1333±0.0759++++海得琴(1mg/kg)70.1121±0.0441* +TSG(33mg/kg) 60.1067±0.0452* ++TSG(100mg/kg) 90.1039±0.0843* +TSG(300mg/kg) 70.0805±0.0385* +M±SD；*p＜0.05，与模型组相比缺血半暗带+，++，+++，++++代表面积依次由小到大。实施例7 化合物的制备在超声破碎下，何首乌根的干燥粉末用氯仿萃取三次，除去蒽醌，然后残留物以类似方式用乙醇萃取3次。合并乙醇萃取物并浓缩干燥。干燥的萃取物溶解在HSCCC(高速逆流液相色谱法)分离的流动相中。HSCCC用北京新技术应用研究所制造的GS10A2多层盘旋行星式离心机进行。
在各分离中，盘旋柱首先完全填充上层有机固定相。然后仪器在800rpm下旋转，同时下层含水流动相泵入到柱中。在流动相前面出现和体系建立稳定状态的流体动力平衡之后，样品溶液经注射阀注入。来自柱的出口的流出物用在254nm的UV检测器连续监控。峰级分根据色谱图收集，产物纯度为96％。
上述化合物125mg，乳糖80mg，羧甲基淀粉40mg和硬脂酸镁5mg，按常规方法压片制成片剂。
权利要求
1.下式的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或药用盐在制备治疗缺血性脑血管疾病的药物中的用途 其中R为-O-β-D-葡萄糖。
2.权利要求1的用途，其中所述缺血性脑血管疾病是脑血栓。
3.权利要求1的用途，其中所述缺血性脑血管疾病是脑梗死。
4.权利要求1的用途，其中所述缺血性脑血管疾病是短暂性脑缺血发作。
5.权利要求1的用途，其中所述缺血性脑血管疾病是脑栓塞。
6.权利要求1的用途，其中所述缺血性脑血管疾病是脑供血不足。
7.一种治疗缺血性脑血管疾病的药物组合物，其特征在于含有权利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或药用盐的组合物。
8.根据权利要求7的药物组合物，它可以是固体制剂，如片剂、胶囊、颗粒制剂，液体制剂如口服液，或者注射剂。
9.根据权利要求7的组合物，其中所述缺血性脑血管疾病是脑血栓、脑梗死、脑栓塞、短暂性脑缺血发作或脑供血不足。
10.权利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或药用盐在制备脑保护剂中的应用。
11.权利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或药用盐在制备抗氧化剂或钙拮抗剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物或药用盐在制备治疗缺血性脑血管疾病的药物中的用途。经动物试验证实,二苯乙烯甙化合物能够减低急性脑缺血再灌注小鼠脑含水量,抑制脑缺血再灌注小鼠模型脑组织脂质过氧化,增强脑缺血再灌注小鼠模型脑组织超氧化物歧化酶活性,减低脑缺血再灌注小鼠模型脑片细胞内钙离子浓度,减低光化学诱导急性脑梗塞小鼠模型脑血管损伤,以及提高双侧颈总动脉夹闭致脑缺血沙土鼠模型学习记忆能力。
文档编号A61K31/7034GK1347698SQ0113428
公开日2002年5月8日 申请日期2001年10月30日 优先权日2001年10月30日
发明者李林 申请人:首都医科大学宣武医院