专利名称：作为用于治疗恶性肿瘤的药剂的异种寡或/和多核糖核苷酸的制作方法
描述本发明涉及异种寡或/和多核糖核苷酸作为制剂用于治疗恶性肿瘤。本发明还涉及异种寡或/和多核糖核苷酸在生产用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
在60年代末和70年代初，在移植研究范围内发现用异种异源核酸预处理的组织或弱抗原在多种不同的免疫学测试方法中显示出基本上增加的抗滴度。这些结果用多种抗原在体外和体内研究中进行了进一步的确认。可是，没有迹象表明异种来源的核酸尤其是寡或/和多核糖核苷酸可能适合于治疗恶性肿瘤。
首先在USA，同时用指定的合成的多和寡核苷酸(尤其是核糖核苷酸)进行了实验，可是其由于体内的高毒性而不再继续研究。
因此本发明的目的是生产适合于治疗恶性肿瘤的药物。根据本发明，恶性肿瘤不包括恶性皮肤疾病。
本发明的目的是通过生产用于治疗恶性肿瘤的药物的方法来实现的，该药物含有异种寡或/和多核糖核苷酸作为活性物质，并优选地以它们与待治疗肿瘤的细胞的共轭物形式。
根据本发明，“异种的”表示核糖核酸来源自与将用其治疗的生物体不同的生物体，也就是这样的寡或/和多核糖核苷酸，即它们不来源自药物将施于的同一个生物体。根据本发明而使用的异种寡或/和多核糖核苷酸优选地为那些来自动物组织(例如牛组织，胎牛组织)、植物和单细胞生物体(优选地来自酵母细胞，尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的核糖核苷酸。优选地使用在进化上离待测试的生物体尽可能远的生物体的寡或/和多核糖核苷酸。因此，优选地在用于人的药物中使用来自动物组织的RNA，或者特别优选地使用来自植物或单细胞生物体如酵母的RNA。
根据本发明所使用的寡或/和多核糖核苷酸为无毒的和它们单独时不是抗原。
可以有效地使用总RNA及其盐和化合物的制备物。tRNA是特别优选的。获得可根据本发明而使用的RNA的特别优选方法为苯酚提取，特别是此处标明为方法I和II的方法。
此外，发现异种核糖核酸(RNA)联合肽、多肽和蛋白质可增加其抗原性。基于这些观察，不仅在体外和而且在体内用异种RNA处理相关患者的肿瘤组织。优选地在体外用异种RNA处理患者的肿瘤组织细胞，优选地用tRNA。然后将该混合物全身性地施用于该患者。在浅层恶性肿瘤的情况下，RNA也可以合适的盖仑氏制剂形式进行局部应用。
除了用本发明的异种寡或/和多核糖核苷酸治疗人以外，也可以这种方式治疗温血动物如马、牛、绵羊等等。
下面的实施例和实验结果进一步说明了本发明。
实施例实施例1根据本发明可用的寡或/和多核糖核苷酸的获得相关的文献描述了大量的获取核酸、核苷酸和核苷的方法，其对于任何具有相关经验的人员来说是已知的。这里优选地应用两种具有小修改的方法，它们都基于苯酚处理，方法I用于获得总RNA(Georgiev，G.P.和Mantieva，V.L.，Biochim.Biophys.acta 61，153(1962))，和方法II用于获得tRNA(Bauer，S.等人，Biotechnology andBioengineering 15，1081(1973))。这两个方法都适合于较大量的提取。
方法I将酿酒酵母于缓冲液(A)(0.001M EDTA，0.01M Tris-HCl缓冲液(pH5-6)，25％蔗糖，0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)，0.3％脱氧胆酸钠)中的15％悬浮液在韦林氏搅切器中并于10℃和3000rpm进行匀浆3分钟。将匀浆物与相同体积的溶液(B)(于缓冲液(A)中的80％重结晶的苯酚，0.1％8-羟基喹啉，1.2％焦碳酸二乙酯)混和，然后于60℃缓慢搅拌30分钟。所有的缓冲溶液用去离子水制备，该去离子水预先用皂土进行搅动。然后将苯酚处理的匀浆物于室温(大约20℃)用10,000g离心15分钟。移去水相，并将酚和中间相丢弃。将水相与相同体积的溶液(B)和氯仿/异戊醇(96∶4)的1∶1混合物进行混和，并按上面的描述进行提取。水相用一半体积的乙醚提取3次以除去剩余的苯酚。将溶液调整至2％的乙酸钠，并用2.5体积的无水乙醇沉淀RNA。
通过于0℃和5,000rpm离心来移除沉淀的RNA，并将其溶解在冰冷的0.01M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和0.001M MgCl2中。通过向溶液中添加电泳纯的胰DNA酶(4μg/ml)并于22℃温育3小时来降解可能存在的DNA。然后将蛋白质剩余物即DNA酶和RNA酶用链霉蛋白酶(10μg/ml)于37℃消化3小时。在这期间，链霉蛋白酶也通过自身消化而被破坏。按照上面的描述用溶液(B)于60℃温和地搅拌20分钟来提取RNA溶液，通过离心来分离相，移除水相并用乙醚提取。在添加乙酸钠(最终浓度为2％)之后，用2.5体积的乙醇沉淀RNA并通过离心将其移除。将沉淀物溶解在冷的2％乙酸钠中，然后用2.5体积的乙醇沉淀，并让其于-20℃留在醇混合物中过夜。然后通过离心移除沉淀，并用75％乙醇洗涤两次，用无水乙醇洗涤两次，和用乙醚洗涤两次。在烘箱中干燥之后，可获得疏松干燥的RNA，将其于室温贮存在黑色玻璃容器中。
方法II该方法也适合于提取大量的酵母(千克的量)。
将给定重量的酵母在冷室中用4倍量的缓冲液(A)(见上面的方法I)进行匀浆。向匀浆物中加入40％v/v的苯酚溶液(B)和5％w/v由去离子水构成的冰块，然后将混合物搅拌30分钟。通过抽吸移除上清液，然后按方法I的描述用苯酚再处理两次。将含水的上清液收集在一个容器中，该容器含有相当于所收集的上清液一半体积的DEAE-纤维素悬浮液(大约10％w/v，Whatman DE-22)。DEAE悬浮液通过搅拌保持悬浮状态30分钟。然后让DEAE沉积1小时。通过抽吸移除上清液。在这期间，将中间相和酚相用等分量的溶液(C)(83％去离子水，15％w/v冰块，2％乙酸镁浓缩物(0.5M乙酸镁于0.25巯基乙醇中))再搅拌两次各30分钟，然后让其分离70-80分钟。将含水的上清液转移至含有DEAE的容器中，然后再次搅拌并让其沉积。通过抽吸移除上清液，再如上所述洗涤DEAE，首先用溶液C洗涤两次，然后再用溶液(D)(2体积的乙酸镁浓缩物，2体积的NaCl浓缩物(3.75M NaCl的水溶液)，0.2体积的Tris-HCl浓缩物(2.5M Tris-HCl水溶液，pH7.5，96体积的水))洗涤一次。
然后将DEAE-纤维素装入在底部封闭的柱中。所有的进一步步骤在4℃的冷室中进行。柱用12倍柱容量的溶液(D)进行洗涤，流速为1.4L/h，(只通过重力)。然后用溶液E(2体积的乙酸镁浓缩物，0.2体积的Tris-HCl浓缩物，14体积的NaCl浓缩物和84体积的水，最终NaCl浓度为0.525M)洗脱tRNA，流速为3L/h。合并含有高于35A260nm单位/毫升的部分，并用1.5体积的乙醇沉淀。进一步的程序与方法I一致。
可选择地，最终的沉淀物可以溶解在水中和可以冻干。
该方法的一个变体为起始材料的通常的苯酚处理用异丙醇从上层相中沉淀出粗制的tRNA。在离心之后，用乙酸钠缓冲液提取沉淀物并在DEAE-纤维素上进行色谱法。用乙酸钠/氯化钠梯度进行洗脱，这对于该方面有经验的生物化学家来说是已知的。通过商数测量来确定合适的部分(见上)，并将其合并。用乙醇沉淀tRNA，将沉淀物如上溶解，优选地进行冻干。
下面的测试是用于分析总RNA和tRNA的纯度并用于表征它们蛋白质根据Lowry，O.H.等人的方法(J.Biol.Chem.193，265(1951))和通过A260/A280≈2进行测定，DNA根据Dische的方法(Mikrochemie 8，4(1930))进行测定，总RNA根据Mejbaum的方法(Physiol.Chem.258，117(1939))进行测定，tRNA和氨基酸结合的定量测定根据Sprinzl和Sternbach的方法(Methods inEnzymology 59，182(1979))来进行，毒性根据M.Nldner的方法(个人通信)进行测定，致热原的缺乏在体外根据DAB 1997(LAL测试)来确定和在体内根据Ph.Eur./DAB 1997来确定。
分析结果(总RNA和tRNA的特性，来自10个测试的平均值)吸收A260/A280≈1.94-2.0C、H、N分析C 32.67 32.42H 5.22 5.20N 2.29 2.00用多种总RNA和tRNA的相应值。
UV和IR光谱UV和IR光谱相应于生物物质而变化，它们几乎相同，但不同一。分子量来自酵母的总RNA和tRNA≈22,000-27,000道尔顿平均值，对于不同的制备物而变化；蛋白质 DNA(总含量)2.3％neg.酿酒酵母细胞的总RNA1.9％neg.酿酒酵母细胞的tRNA0.9％neg.牛来源的总RNA平均值，一般通常的质量。经提高的纯度不会导致显著改善的治疗作用，而同时导致不相称的较高成本。
对于tRNA的氨基酸结合，10个分析的平均值赖氨酸 69-85pmol/A260单位苯丙氨酸 41-55丝氨酸 39-50缬氨酸 77-90这些平均值在不同批次的酵母中于规定的范围内变化。
毒性小鼠中急性毒性测试动物 NMRI小鼠，雄性，Fa.Janvier，法国施用 以静脉内方式进入尾静脉观察期间 24小时随机样品的数目n＝10，以最高浓度测试物质 a.牛总RNAb.来自醇酒酵母细胞的tRNA溶剂 0.9％NaCl的水(p.i.)溶液结果直至1g/kg/10ml i.v.的最大剂量，测试动物在24小时的观察期间内丝毫没有显示出显著的特征。
致热原的缺乏A.如已描述的，总RNA和tRNA的致热原含量根据DAB 1997(LAL测试)用对于内毒素的体外测试来测定，和根据Ph.Eur./DAB 1997在兔上进行测定。
1.总RNA内毒素标准EC 5变形细胞溶解产物-公布的灵敏度0.06 EU/ml-测得的灵敏度0.06 EU/ml测试溶液100mg RNA溶解在20ml水-LAL(0.5％)中结果用水-LAL作0.5％1∶5稀释的测试溶液的内毒素含量＜0.03EU/ml。
2.tRNA内毒素标准EC 5变形细胞溶解产物-公布的灵敏度0.06 EU/ml-测得的灵敏度0.06 EU/ml测试溶液100mg RNA溶解在20ml水-LAL(0.5％)中结果用水-LAL作0.5％1∶10稀释的测试溶液的内毒素含量＜0.03EU/ml。
B.根据DAB/Ph.Eub.(2000标准)的致热原缺乏的测试。
1.总RNA1％的测试物质于无致热原的水(p.i.)中的测试溶液剂量1.0ml/动物动物3只兔，根据DAB/Ph.Eub.(2000标准)结果3只兔的温度差异总和为1.05℃，因此不能检测到致热原。
2.tRNA1％的测试物质于无致热原的水(p.i.)中的测试溶液剂量 1.0ml/动物动物 2次各6只兔，根据DAB/Ph.Eub.(2000标准)结果a.6只兔的温度差异总和1.02℃b.6只兔的温度差异总和1.06℃，不能检测到致热原。
实施例2本发明物质的肿瘤效应的证明10名患各种癌的患者已做过外科手术，他们的身体已被许多的转移侵袭并不再对于化疗作出响应，治疗他们的肿瘤学家判断他们的生命只能持续几个星期，用tRNA/肿瘤细胞共轭物(温育大约30分钟)全身性地治疗这些患者，即将6×106肿瘤细胞与50-100mg tRNA，在14天内进行2次。
在这样治疗之后，一位女性患者还用温和的化疗进行支持性治疗几个星期。在差不多2年之后，她死于无关的基本疾病。
所有其他经治疗的患者在无化疗的情况下存活了＞1-2年，并且具有无副作用的良好生存质量。
这些结果证明在患者中使用这种RNA是适当的，特别是因为他们不幸地不再对于化疗作出响应，而且在延长的生存期间丝毫没有观察到负作用或毒性效应。
权利要求
1.生产用于治疗恶性肿瘤的药物的方法，其特征在于，异种寡或/和多核糖核苷酸被转化成可全身性施用的形式。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，异种寡或/和多核糖核苷酸以它们与待治疗肿瘤的细胞的共轭物形式进行使用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于异种寡或/和多核糖核苷酸在体外与待治疗肿瘤的细胞进行温育，并将获得的经温育的材料作为活性物质使用。
4.根据前述的权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，加入生理上可接受的赋形剂、辅助剂、稀释剂或/和添加剂。
5.根据前述的权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，活性物质包括来自动物组织、植物或/和单细胞生物体的寡或/和多核糖核苷酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，活性物质包括来自酵母细胞的寡或/和多核糖核苷酸。
7.根据前述的权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，活性物质包括异种tRNA。
8.根据前述的权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，活性物质包括通过苯酚提取获得的异种寡或/和多核糖核苷酸。
9.根据前述的权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于，异种寡或/和多核糖核苷酸来源于在进化上远离待治疗的生物体的生物体。
10.异种寡或/和多核糖核苷酸用于治疗恶性肿瘤的用途。
11.异种寡或/和多核糖核苷酸以与待治疗肿瘤的细胞的共轭物形式的用途，以实现权利要求10的目的。
12.根据权利要求11所述的使用，其特征在于，使用已在体外与待治疗的恶性肿瘤的细胞进行温育的异种寡或/和多核糖核苷酸。
13.治疗恶性肿瘤的方法，其特征在于，将异种寡或/和多核糖核苷酸以50-100mg tRNA的有效量全身性地施用于需要如此治疗的患者或动物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，tRNA以与待治疗肿瘤的肿瘤细胞的共轭物形式进行施用。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，105-108肿瘤细胞与50-100mg tRNA在体外温育的混合物一次或几次全身性地进行施用。
全文摘要
本发明涉及异种寡或/和多核糖核苷酸作为制剂用于治疗恶性肿瘤。本发明还涉及异种寡或/和多核糖核苷酸在生产用于治疗恶性肿瘤的药物中的用途。
文档编号A61K35/12GK1520304SQ02812860
公开日2004年8月11日 申请日期2002年6月26日 优先权日2001年6月28日
发明者B·梅斯里姆勒, B 梅斯里姆勒 申请人:I·P·L·国际制药有限公司, I P L 国际制药有限公司