专利名称：哺乳动物的配子募集和发育能力－通过抑制固醇从头生物合成和/或促进固醇外流的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过施用能够抑制固醇从头生物合成的化合物，由此建立改善至少一个哺乳动物生殖细胞、配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎发育和生存的细胞条件，提高它们的发育能力的方法。本发明也涉及通过施用能够促进固醇外流的化合物，在受精前提高至少一个哺乳动物卵巢、卵母细胞、雌配子或者卵母细胞周围的卵巢衍生细胞的固醇外流，由此降低细胞的磷脂/固醇比的方法。
背景技术：
在过去的十年间，不育的医学治疗经历了很长的历程，通过医学干预为低生育力或不育的夫妇提供了育儿的可能性。不过，大量的夫妇自本领域技术人员公知的系列不育治疗中未获得任何效益。因而，生育治疗的医学实践的选择过程通常是令人困惑和耗费情感的经历。
人类中所有不育的大约40％归因于女性，40％归因于男性，而在20％的病例中，配偶双方共同造成了这个问题。不育根据女性的年龄而被不同地定义。不育的标准定义是当女性低于35岁时，配偶无防护性交1年后不能实现妊娠。与此平行，生育力显示从大约34岁年龄开始下降，在超过42岁的女性中，除非使用供体卵，否则几乎跌至0。因而，需要治疗不育的改善方法，因为平均孕妇年龄在升高。
新哺乳动物的发育根本上起始于倾向于参与受精过程的可受精生殖细胞，即配子的发育。两个高度特化的细胞，即精子和卵母细胞接合产生受精卵，通过这个过程，可以依次产生新个体。在可能的受精前准备中，雄性和雌性生殖细胞系都经历包括核及胞质的许多变化。这些变化的目的是双重的1)将同源染色体对的染色体数目(如体细胞中所代表的)(二倍体)减半(单倍体)，以及2)改变准备受精的生殖细胞的形状和生物化学特征。
卵泡以及卵母细胞的个体发生雌性的生殖细胞先祖细胞是所谓的初级卵母细胞。初级卵母细胞复制其DNA并进入第一次减数分裂前期。此时细胞退化开始，许多初级卵母细胞闭锁并死亡。不过，所有存活的初级卵母细胞，进入第一次减数分裂前期，并且它们这时被一层上皮体细胞原始卵泡单独包围。
出生时，人类初级卵母细胞被阻抑在减数分裂前期，而不进入中期。在哺乳动物中，初级卵母细胞不继续减数分裂，直到青春期(图1)。只有稍微在青春期之前，部分原始卵泡才会发育，经由假定的激素(促性腺激素，即卵泡刺激素FSH和促黄体生成激素LH)独立阶段，到达促性腺激素依赖性阶段，自此进一步的发育依赖于激素刺激。在之后的促性腺激素依赖性生长中，多数哺乳动物(包括人类)的卵泡发展为充液腔，即所谓的卵泡腔，自此后卵泡被称之为窦状或格雷夫氏卵泡。稍后再次的促性腺激素(主要是LH)的循环高峰，引发卵母细胞继续减数分裂，自卵泡萌出并排卵。
只有某一数目的原始卵泡自静息库起始生长。大量的卵泡在从原始卵泡期向窦前期发育期间经历闭锁并死亡。即使从该阶段开始，绝大多数的窦状卵泡还会经历闭锁并死亡，导致显著的卵母细胞流失。这些选择过程共同确保排除不可育或误发育的生殖细胞。不过，卵巢内调控机制也决定了仅有一定数目的卵泡实现排卵。排出的卵子的平均数目是物种特异性的，并且与所讨论物种的繁殖策略有关，而与排除不可育或误发育的生殖细胞无关。确保足够数目的卵母细胞的机制据信与循环促性腺激素水平以及窦前卵泡中体细胞区室上促性腺激素受体的数目有关。
在所谓的卵泡期(期间小的窦状卵泡发育成排卵前卵泡)，用外源促性腺激素刺激成年雌性，导致可以从增加数目的排卵前卵泡收回增加数目的存活卵母细胞。基于此的临床治疗仍然是复杂的，且在许多病例中未完全成功。
在人类IVF治疗以及家畜育种期间，收回的活卵母细胞的数目依然常常是后面的怀孕成功的限制因素。此外，激素治疗有明显的缺陷，即，增加循环促性腺激素(尤其是LH)或者功能等同的人类绒毛膜促性腺激素hCG可能对女性造成副作用。
精子的个体发生雄性的生殖细胞先祖细胞是精原细胞。前精原细胞被体细胞包围，并且在出生前或出生后不久被包在所谓的睾丸索中。这代表了两性生殖细胞发育中主要的结构相似性。周围细胞被称之为支持细胞并行使滋养细胞的功能，用于生殖细胞的发育，类似于滋养卵母细胞的颗粒细胞。
雌性和雄性生殖细胞系的主要差别在于减数分裂循环的时间选择和进程。在雄性中，二倍体前精原细胞以某种方式分化为精原干细胞静息库和精原细胞的有丝分裂活跃库。后者的分裂产生仍能有丝分裂的A-精原细胞以及注定要进入减数分裂的B-精原细胞。雄性生殖细胞系减数分裂仅发生在青春期开始后，但不同于雌性生殖细胞系的双线期阻抑，其之后没有阻抑地继续发育直到从单个B-精原细胞产生4个单倍体生殖细胞(图1)。两次减数分裂的产物是精母细胞(1′和2′)，且第二精母细胞进一步分化为精子细胞并稍后分化为将释放到睾丸生精小管内腔中的游动精子。
释放到内腔中以后，精子进入附睾，在这里发生许多生物化学过程使得精子能够经历所谓的精子获能，这是精-卵融合及受精期间所谓的顶体反应的必要条件。在自然界中，精子获能发生在雌性的子宫道中，并且除其它可能的因素之外，还涉及细胞膜胆固醇向周围环境的丢失。
雄性生殖细胞的数目和质量取决于许多因素，包括激素、细胞加工、环境因子和胁迫。原理上，雄性生殖细胞的数目是无限的，因为存在精原干细胞，它将产生分裂的B-精原细胞以及后来的成熟精子。然而，实际上，睾丸中滋养雄性生殖细胞成熟的支持细胞的数目限制了该数目。
低数目的成熟精子导致雄性低生育力及不育、低质量的射出精子或两者兼而有之。“低精子质量”是一个广义的操作术语，可以覆盖遗传、生物化学和形态学成分，以及甚至是环境诱导的因素。
固醇生物合成固醇是所有后生动物细胞膜的重要组分。胆固醇是最普遍的固醇，以及哺乳动物固醇生物合成中的天然生物合成终点。固醇被定义为含环戊烷多氢菲四元环系统的物质，具有至少碳17(C17)取代的侧链和C3β-羟基取代基(图4)。在本发明上下文中，固醇的概念可限于与这些结构要求一致的结构，并在生理环境下表现为从羊毛甾醇到胆固醇的中间物(例如参见图2)。
哺乳动物的固醇生物合成根本上起始于碳源。乙酸是胆固醇从头生物合成的前体。不过，这不等同于乙酸仅可用于胆固醇生物合成的概念，因为乙酸代谢路径中存在许多分支，其中导致胆固醇生产的分支只是其中一个(见图3)。这些产物中任一个的生物合成程度都取决于生物合成路径的生理势能以及相对于其它分支会助长某些分支的优势的调控模式。具体地，多年来已认识到，在异戊烯化蛋白、长醇、辅酶Q、血红素a侧链以及胆固醇的生物合成中，3-羟基-3-甲基戊二酰转化为甲羟戊酸的步骤是限速步骤。该生物合成步骤由3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A-还原酶(HMG-CoA-还原酶)催化(图3)。乙酸和胆固醇间的生物合成路径涉及20多种不同的酶。HMG-CoA-还原酶在该路径早期出现，并是固醇及其它下游因子和代谢物合成的限速酶(Goldstein等，1990)。
生殖细胞中的固醇和固醇动力学固醇是生物膜的重要组分，并与磷脂共同构成了细胞中所有膜结构的大量脂质物质。固醇以游离形式，即非共价修饰的固醇出现在膜中，但以固醇-酯贮藏在亚细胞区室中。在哺乳动物中，胆固醇是占优势的固醇物质，且该固醇的定量出现决定了膜的重要物理性质。质膜中胆固醇与磷脂比率的变化影响膜透性、膜转运性能、细胞融合性、酶活性及膜流动性。
精子哺乳动物精子具有独特的固醇组成，正如在恒河猴精子中发现链甾醇而在仓鼠精子中发现链甾醇和胆甾基-7，24-二烯-3β-醇(Awano等，1989)，以及在人类精子中发现睾丸减数分裂激活固醇(T-MAS)那样(Baltsen等，1998)。总的来说，胆固醇似乎是哺乳动物精子中主要的固醇。不过，在某些物种的某些精子阶段，非胆固醇的固醇可能占高达90％的固醇总量(Awano等，1989)。
交配期间，精子在子宫和输卵管运输期间获能。生理学上，精子的顶体反应由细胞融合前精子与卵母细胞上的透明带(卵壳)结合以及(也是由输卵管中新近排卵排出的卵丘-卵母细胞复合体的卵丘细胞产生的)孕酮诱导。精子在体外可以通过暴露于使得胆固醇自膜中流失的药剂而获能，且外源胆固醇和链甾醇抑制顶体对孕酮的应答(Cross，1996)。固醇含量或与固醇保持均衡的分子的含量因而是雄性生殖细胞发育期间的关键参数。长久以来已知游离胆固醇和磷脂之间的比率在精子获能期间变化(Davis，1981)。已证明游离胆固醇对获能行使抑制作用，这与其酯化对应物相反(Davis，1980)。已经操作地证实胆固醇自质膜的流失对于精子使卵受精的能力是至关重要的。在某些物种中，精子顶体反应之前是精子质膜脂双层中固醇的去除。在实验上，精子中的固醇标记在精子通过附睾期间显著下降(Lopez等，1991)。并且，外源胆固醇抑制小鼠精子的获能(Go等，1985)。
通常认为虽然精子能够自乙酸从头合成胆固醇(Gunasegaram等，1995)，但其接收来自支持组织的胆固醇(Cross，1998)。然而，这种陈述未进行彻底研究，而且对雄性生殖细胞成熟中的实际固醇代谢知之甚少。长期用富含胆固醇的饮食处理兔子，与饲喂对照饮食的兔子相比，导致更低的精子计数和精子游动性(Yamamoto等，1999)。不过，长期用抑制素治疗高胆固醇血症的男子似乎不影响血浆睾酮、总精子计数、精子形态或精子游动性(Bernini等，1998)。因而不确定生殖道细胞中的固醇递送或固醇含量是否受干扰固醇动力学的药剂的系统治疗的影响。
已经证明精子膜的固醇含量决定了精-卵识别时重要的某些表面蛋白的表达程度(Benoff等1993a，b)。胆固醇释放也与精子蛋白酪氨酸磷酸化的增加和胞内pH的升高有关，这两者对顶体释放和受精后事件很重要。导致精子获能的体外精子中胆固醇释放可通过与许多已知结合胆固醇的物质温育来实现。
每个精子的胆固醇总量在个体之间可能变化不止10倍，但与胆固醇含量有关的受精能力似乎主要与射精后阶段的胆固醇丢失能力相关(Benhoff等，1993b)。精子的绝对固醇含量可能不如游离胆固醇和磷脂间的比率重要。与正常可育男子相比，不明的不育男子和精子活力不足的男子可能具有升高的游离胆固醇/磷脂(C/PL)比，但胆固醇水平的临床重要性似乎是不明确的(Sugkraroek等，1991；Huacuja等，1981)。用磷脂制剂处理人类精子，伴随着精子C/PL比的下降，精子与卵透明带的结合得以提高(Gamzu等，1987)。
精子的脂质含量与游动性参数相关(Connor等，1997)。而且，C/PL比与游动性(Hamamah等，1995)和精子融合性负相关。尽管C/PL比可能对于精子质量是重要的，固醇的绝对量仍然是未解决的问题。
卵母细胞目前未公开有关哺乳动物卵母细胞中胆固醇含量、胆固醇生物合成以及胆固醇动力学的任何内容。该事实很可能归因于只有低量的组织可用于分析。
抑制素抑制素是竞争性且可逆地抑制HMG-CoA-还原酶的化合物的通称。在体内施用时，抑制素通过抑制身体自身的胆固醇产量而介导血清低密度脂蛋白(LDL)的下降和血清高密度脂蛋白(HDL)的升高。在本申请中，术语抑制素覆盖了通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-Co-还原酶)而抑制胆固醇从头生物合成的任何化合物。
流行病学研究已证明升高的血胆固醇水平，或者更具体地，升高的LDL-胆固醇水平原因性地与提高的冠心病危险有关。也有降低总的胆固醇水平和LDL-胆固醇水平会减少冠心病发生的大量证据。由于这种效果，过去10年的深入研究产生了多种能够抑制HMG-CoA-还原酶的化合物。一般认为这些化合物是安全和普遍无毒性的。仅有非常少的报道涉及抑制素对生殖的危害。一份有关人类毒性的报道引述到在每天口服接受40mg洛伐他汀计4个月的II型高脂蛋白血症患者中，与单独的饮食控制期间相比较，精子游动性具有小的但是统计学意义的下降(危险物质数据库，SigmaAldrich挪威)。
发明概述本发明提供了提高雌性和雄性生殖细胞以及由此类生殖细胞受精所产生的生物体的数目和发育能力的简单新方法。作为一个卓越的方法，其实现生育力的改善而没有目前大多数使用的方法中所应用的激素治疗的副作用。此外，本发明也能够与目前临床上所用的体外方法联合应用，例如体外成熟(IVM)及体外受精-胚胎转移(IFV-ET)技术，不同程度的外源促性腺激素刺激的应用和生殖细胞培养。与用于治疗低生育或不育的体外技术有关的时间进行顺序在图12中描绘。作为这些常规方法的补充，本方法降低可能的副作用。
本发明涉及提高哺乳动物配子和胚胎的数目及质量的方法。所述方法可以体内或体外应用，其或者抑制两种性别的生殖细胞及其相邻细胞的固醇从头生物合成，或者促进受精前固醇自雌性生殖细胞的外流，或者两方面兼而有之。预期可以由本发明所述物质操作的过程描述在图11中。工作机制被认为涉及降低哺乳动物生殖细胞和/或配子中游离(非衍生的)固醇和磷脂之间的比率，但可能也涉及到与甲羟戊酸及甲羟戊酸后面的产物的利用有关的其它机制。
在一个方面，本发明使用药理学方案通过施用或添加拮抗生殖细胞和生殖细胞支持组织中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的化合物在体内和/或在体外抑制内源胆固醇从头生物合成。不过，HMG-CoA-还原酶抑制剂的这种使用是以脉冲方式(pulsate manner)进行的，这与这些化合物用于动脉粥样硬化预防时的通常使用不同。而且，HMG-CoA-还原酶抑制剂的使用浓度可以比动脉粥样硬化预防时通常所用的浓度高相当多。该治疗介导胞内效应，挽救否则将不可育或不可受精的生殖细胞，并使得此类生殖细胞可育且易于受精。实际上，该治疗导致生殖细胞存活率升高，且促进生殖细胞成熟。并且，该治疗使得生殖细胞更易于成熟及参与影响受精和早期胚胎发育的成熟后事件，这很可能是通过影响固醇和磷脂之间的比率实现的。可用于稍后的受精的生殖细胞的数目由此得以提高，这导致受孕成功性提高，以及每个成年雌性每个生殖周期中后代的数目增加。
本发明涉及在卵泡期的非激素药理学治疗，其导致收回的卵母细胞数目增加，且就形态学和受精力而言卵母细胞质量得以改善。作为一项卓越的技术，可操作本发明的方法而没有常规激素治疗的可能的副作用危险。不过，当需要改良的方法增加收回的生殖细胞的数目和就生育力和受精力而言改善卵母细胞质量时，这种新的非激素药理学方法也可联合常规的女性IVF治疗方案以及家畜或动物育种中的一般应用技术，在体外技术施用的条件下应用。
发明详述在最广义的方面，本发明涉及抑制固醇从头生物合成的方法，其效果是降低生殖细胞的固醇含量，并有可能降低至少一个哺乳动物生殖细胞和/或配子中游离固醇和磷脂之间的比率，由此提高至少一个哺乳动物生殖细胞、配子、受精卵、早期胚胎、胚泡、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力，和/或哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡、胚胎和/或胎儿的数目，所述方法包括向需要此的哺乳动物施用能够抑制固醇从头生物合成的化合物。
在另一个方面，本发明涉及提高至少一个哺乳动物卵巢和/或一个哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的固醇外流的方法，由此提高所述至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的发育能力，所述方法包括施用能够在需要的哺乳动物中促进固醇外流的化合物或化合物组合。
在本发明的上下文中，术语“生殖细胞”涉及能够产生配子的任何哺乳动物细胞，而“配子”被定义为拥有单倍染色体组的成熟雄性或雌性生殖细胞，其通过与相对性别的配子融合能够起始新的二倍体个体的形成，该术语因而包括如次级精母细胞、精子细胞、精子、卵丘包围的卵母细胞(卵母细胞和卵丘细胞)以及分离的卵母细胞。
在本上下文中，术语“哺乳动物”涉及脊椎动物亚门最高等级的纲，包括用乳腺分泌的乳汁养育其幼子的所有动物，例如人类、马、牛、大鼠、小鼠、猪、绵羊、山羊、骆驼(llama)、狗、猫和貂。在优选的实施方案中，本发明涉及人类。在另一优选的实施方案中，本发明涉及由于人类农业和宠物产业而在工业上可用的哺乳动物，例如上文所述的动物。
本发明上下文中所用的术语“受精卵”是描述通过两个配子结合形成的细胞，其经历原核发生和原核融合发育，并起始首次细胞分裂，或者更广义地，是指由配子产生的发育中个体。术语“早期胚胎”在本上下文中被定义为自受精卵产生的、直到胚泡期的两细胞或多细胞生物体，胚泡被定义为出现了充液腔即囊胚腔的早期胚胎阶段。术语“植入的胚泡”在本上下文中涉及已开始由周围的卵壳即透明带孵出并且刚刚开始穿入养育母体的子宫内膜的胚泡。本上下文中的胚胎被定义为哺乳动物从植入过程终止以及生长和分化早期阶段开始起的发育阶段，以细胞分裂、基本组织的拟定以及原始器官和器官系统形成为特征。该术语尤其指从植入之时到受孕后8周结束时的发育中人类个体，这将胚胎与胎儿区分开。
自“生殖细胞”到“胎儿”的发育在本上下文中构成了哺乳动物发育的连续过程，不允许不适合上述定义之一的任何中间阶段发生。
术语“发育能力”被定义为发育成特定单细胞或多细胞期的能力，并且在本上下文中包括任何细胞分化、发育和成熟、受精，以及覆盖早期胚胎发育、胚泡形成、植入和胚胎及胎儿生长的受精后过程。
在本发明的方法的最优选的实施方案中，生殖细胞是人类生殖细胞，例如卵母细胞、通过抽吸窦前卵泡(pre-antral follicle)收回的未成熟卵母细胞、通过抽吸小的或中等大小的窦状卵泡(antral follicle)收回的未成熟卵母细胞和/或在培养至少一个处于原始卵泡期到窦前期的未成熟卵泡后获得的未成熟卵母细胞、射出的精子、自雄性生殖道收回的未成熟精子、精子细胞或精母细胞。术语“未成熟”涉及自然情况下在其目前的阶段不能够受孕的生殖细胞和配子。
待用于本发明的方法且能够抑制固醇从头生物合成的化合物优选选自拮抗3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的化合物类，例如与HMG-CoA竞争性或非竞争性地和HMG-CoA-还原酶可逆或不可逆结合、且降低每摩尔HMG-CoA-还原酶单位时间内产生的甲羟戊酸的摩尔量的任何物质。可利用一种或多种化合物，即化合物可以独立地使用，或者两种或多种化合物可联合使用。
本上下文中的相关HMG-CoA-还原酶抑制剂可通过涉及纯化溶解的HMG-CoA-还原酶、冷冻融化溶解的HMG-CoA-还原酶、由哺乳动物生殖腺或生殖腺细胞获得的微粒体级分的测试法来鉴定资格。此类细胞或亚细胞级分在下文被称之为“HMG-CoA-还原酶制品”。
在涉及游离浓度为20μM的HMG-CoA、温育介质中最高10mg/ml的“HMG-CoA-还原酶制品”的体外实验中，在于空气中平衡且添加了辅因子NADH和NADPH以及氧再生系统的生理缓冲液中于37℃温育，稳态期间每摩尔HMG-CoA-还原酶单位时间内产生的甲羟戊酸的摩尔量为对照值，Vc＝产生的甲羟戊酸摩尔数/mg酶制品/秒。
如果在相同的实验设置下添加一定浓度的抑制HMG-CoA-还原酶的物质使得产生游离浓度为100μM的该物质(游离浓度是自由扩散而不是结合到大分子实体上的物质的浓度)，则稳态下每摩尔HMG-CoA-还原酶单位时间内产生的甲羟戊酸的摩尔量为抑制值，Vi(100μM)＝产生的甲羟戊酸摩尔数/mg酶制品/秒。
如果Vi(100μM)≤0.9×Vc则该物质使每摩尔HMG-CoA-还原酶单位时间内产生的甲羟戊酸的摩尔量降至对照值的90％或更低，其中对照值是不施加抑制剂时的转化率。如果满足在添加100μM的物质时抑制至少10％的条件，该物质有资格作为本上下文的HMG-CoA-还原酶抑制剂。
优选地，所述量小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％。在优选的实施方案中，所述化合物在上述条件下导致3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A向甲羟戊酸的转化率几乎彻底地下降。
能够降低固醇从头生物合成的其它化合物可以是抑制参与起始于乙酰-CoA并终止于羊毛甾醇的固醇前生物合成路径的酶(图2和3)的任何化合物。待抑制的酶的实例有甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、二甲基烯丙基转移酶、牻牛儿基转移酶、角鲨烯合酶、角鲨烯单加氧酶、氧化鲨烯羊毛甾醇环化酶及羊毛甾醇合成酶。
此类药物的抑制潜力应当由它们在温育的生殖腺组织或组织块中，与潜在抑制剂不存在时的温育相比，降低每摩尔酶每单位时间内的酶产物量的能力评价。实验设置因此应当类似于上文所述的用于测试HMG-CoA-还原酶抑制剂物质的条件——除了用所讨论的酶的天然底物替代HMG-CoA之外，其中该底物应当以等于酶-底物反应的Km(米曼氏常数)的游离浓度使用。在类似于上述用于HMG-CoA-还原酶抑制作用的条件(即以100μM浓度施用物质)下，所述物质的抑制效果应当至少为10％，以便有资格作为固醇合成抑制剂。
此类列表将包括但不限于，zaragozic acid，重氮角鲨烯(azasqualene)、双膦酸盐(例如环庚基氨基亚甲基-1，1-双膦酸、(3-(1-吡咯烷基)-1-羟基亚丙基-1，1-双膦酸)和PHPBP(3-(1-哌啶子基)-1-羟基亚丙基-1，1-双膦酸))及其它squalestatin(角鲨烯合酶抑制剂)、咪唑类化合物、氨羟二膦酸盐、阿仑特罗(alendronate)及氧固醇类。
一般而言，本发明涉及应用在其与生殖腺组织相互作用期间会抑制固醇从头生物合成并由此导致哺乳动物附睾精子或卵母细胞及卵丘-卵母细胞复合体中游离固醇的含量下降，并可能最终导致生殖细胞支持细胞中固醇/磷脂比降低的任何化合物。本发明涉及化合物与施用方式的任何组合，该组合将通过与固醇前路径(即乙酸和羊毛甾醇之间的生物合成路径)中涉及的酶的抑制性相互作用，导致哺乳动物附睾精子或卵母细胞及卵丘-卵母细胞复合体中总游离固醇下降。
本发明涉及上述任何能导致与未接受此类处理的哺乳动物的情况相比，哺乳动物附睾精子或卵母细胞及卵丘-卵母细胞复合体中游离固醇下降至少10％(如至少5％)的方案。本发明也涉及固醇从头生物合成抑制方案与为在需要的哺乳动物中增殖生殖细胞而应用的公知技术，例如IVM和IVF-ET技术、用外源促性腺激素刺激和/或其它技术的任何组合。
在本上下文中，术语“促性腺激素”涉及由垂体或胎盘产生的含两个肽亚基α和β的哺乳动物肽激素，其中α亚基为它们共有，而β亚基具有不同的化学性质和生物学特征。迄今已知的促性腺激素包括促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。
在本发明目前优选的实施方案中，用于抑制固醇从头生物合成的化合物为抑制素。抑制素存在几种普通名称，因而下述列表并不旨在限制本发明的范围。在优选的实施方案中，抑制素选自托伐他汀、西伐他汀、达伐他汀(RG 12561)、氟伐地汀、BAY W 62、普伐他汀、洛伐他汀(从前称之为美维诺林或美降脂K)、28、HR 780、普伐他汀、斯伐他汀、美伐他汀、甲基-美伐他汀、米法斯丁(从前称之为美伐他汀或ML-236B)、ML-236A、ML-236C、二氢美伐他汀、美降脂J、美降脂L、美降脂M、美降脂X、二氢美降脂L、美维诺林、3β-羟基美伐他汀酸单钠盐(普伐他汀，CS-514)、辛伐他汀、西伐他汀和制霉菌素/曲安奈德。
在本上下文中，能够促进固醇外流的化合物(SBTS＝固醇结合或转运物质)是在温育组织或细胞期间将导致固醇增加扩散到介质中、从而导致所述固醇从生物材料外流到最初未被固醇饱和的固醇受体，例如血清白蛋白或其它蛋白、碳水化合物或脂质材料上的任何物质。
固醇外流可通过在补充有3mg/mL(3‰w/v)人类血清白蛋白以及所关心的推断的固醇结合和转运物质的Eagle氏极限必需培养基中温育放射性标记的条件Fu5AH大鼠肝细胞瘤细胞来进行测定。细胞的条件培养和标记以及培养期间的细胞密度必需与Moya等(Moya etal.，1994，Arterioscler.Thromb.，14(7)1056-1065)的文献描述一致。如果Fu5AH大鼠肝细胞瘤细胞在这些条件下于37℃温育4小时，在温育后随后通过离心分离用过的培养基，在新培养基(补充有3mg/mL人类血清白蛋白的Eagle氏极限必需培养基)中洗涤细胞，并在这两个级分中测量放射性，则细胞中放射性＝RA细胞培养基中放射性＝RA培养基其中RA细胞代表细胞级分中的总放射性，而RA培养基代表了包括来自3次连续洗涤的培养基在内的培养基级分中的总放射性。如果培养中不存在除3mg/mL血清白蛋白之外的其它物质，则细胞中放射性(标准)＝RA细胞标准培养基中放射性(标准)＝RA培养基标准如果添加SBTS，则细胞中放射性(SBTS)＝RA细胞SBTS培养基中放射性(SBTS)＝RA培养基SBTS如果物质有资格作为本上下文中的SBTS，则在37℃温育4小时后，来自细胞的3H-胆固醇级分释放提高50％或更多，即(RA培养基SBTS)/(RA细胞SBTS)≥150％×(RA培养基标准)/(RA细胞标准)在优选的实施方案中，向培养基中添加的SBTS量导致培养基的摩尔渗透压浓度增加0.001-10％。在另一个优选的实施方案中，向培养基中添加的SBTS量在0.001-10mM的范围内。又在另一个优选的实施方案中，向培养基中添加的SBTS量在0.01-50‰(w/w)的范围内，例如但不限于0.5-4‰。
令人感兴趣的能够促进固醇外流的化合物可以是环糊精，化学修饰的环糊精，例如但不限于硫酸化环糊精，高密度脂蛋白(HDL)，来自HDL的脱辅基蛋白，固醇载体蛋白I和II或者能够溶解固醇的任何其它蛋白。
在一个实施方案中，能够促进固醇外流的化合物选自环糊精，化学修饰的环糊精，例如但不限于硫酸化环糊精，高密度脂蛋白(HDL)，来自HDL的脱辅基蛋白，以及固醇载体蛋白I和II。
在本发明最优选的实施方案中，能够促进固醇外流的化合物是环糊精。
在本上下文中，术语“环糊精”涉及通过环糊精葡聚糖转移酶对淀粉或相似底物的作用获得的由α-1，4键合的葡萄糖单位构成的一组环状葡聚糖同系物。环糊精与广泛种类的物质形成包函复合体，从而使得否则在水或缓冲液中不溶或低溶的物质共溶。环糊精彼此在结构上存在吡喃葡萄糖单位数目的差异。含6、7和8个吡喃葡萄糖单位的母体环糊精分别被称为阿尔法(α)、贝塔(β)和伽马(γ)环糊精。作为实例，图13显示了硫酸化环糊精的通用结构(R＝H)。如果R＝CH2CH(OH)CH3，则该结构代表下文实施例8中所用的羟丙基-β-环糊精。
应当向需要的哺乳动物施用的抑制素或能够抑制固醇从头生物合成的化合物的量取决于所选的特定抑制素和/或化合物，并且在每天每kg体重0.01-100mg之间，例如每天每kg体重0.05-90mg、每天每kg体重0.1-80mg、每天每kg体重1-50mg、每天每kg体重1-25mg、每天每kg体重1-10mg、每天每kg体重1.0-10mg、每天每kg体重2.0-10mg、每天每kg体重2.5-10mg、每天每kg体重3.0-10mg、每天每kg体重4.0-10mg、每天每kg体重5.0-10mg、每天每kg体重6.0-10mg、每天每kg体重7.0-10mg、每天每kg体重8.0-10mg、每天每kg体重9.0-10mg或者每天每kg体重1.0-9.0mg之间、每天每kg体重2.0-8.0mg、每天每kg体重2.5-7.5mg、每天每kg体重4.0-6.0mg或每天每kg体重4.5-5.5mg。
应当向需要的哺乳动物施用的能够促进固醇外流的化合物的量取决于所选的特定化合物，但可能在每天每kg体重0.01-1000mg之间，例如每天每kg体重0.5-900mg、每天每kg体重1-800mg、每天每kg体重10-500mg、每天每kg体重10-250mg、每天每kg体重10-100mg、每天每kg体重20-100mg、每天每kg体重25-100mg、每天每kg体重30-100mg、每天每kg体重40-100mg、每天每kg体重50-100mg、每天每kg体重600-100mg、每天每kg体重70-100mg、每天每kg体重80-100mg、每天每kg体重90-100mg或者每天每kg体重10-90mg之间、每天每kg体重20-80mg、每天每kg体重25-75mg、每天每kg体重40-60mg或每天每kg体重45-55mg。
雌性哺乳动物的生殖状态是循环的，下丘脑、垂体前叶和卵巢之间复杂的相互作用导致排卵过程。在人类中，该循环以平均周期为28天左右(范围21-35天)重复。第一阶段月经期持续3-5天。人类循环的第一天就是所述第一阶段的第一天，也就是月经流血的第一天。人类卵巢的第二卵泡期对应于子宫内膜的增生期，并且至少5-16天(即高度可变)。接着是排卵期(36小时)，最后是黄体期，它对应于子宫内膜的分泌期，并且通常更恒定，为14天左右。在本上下文中，排卵时刻就是卵子自卵巢释放的时间。
有必要使用本发明的治疗方案的时期在每个排卵周期内计算。排卵周期在哺乳动物各物种之间不同，因此需要施用的最佳时期应当优选就每一物种根据其排卵周期计算。在几种哺乳动物中，排卵周期的持续时间与人类周期高度不同。多种哺乳动物的平均排卵周期持续时间在下表1中给出表1
根据本发明的方法，向需要的雌性动物施用能够抑制固醇从头生物合成和/或促进固醇外流的化合物的时间在排卵前0小时-12天期间，例如排卵前0小时-11天、0小时-10天、0小时-9天、0小时-8天、0小时-7天、0小时-6天、0小时-5天、0小时-4天、0小时-3天、0小时-2天或0小时-24小时。
能够抑制固醇从头生物合成和/或促进固醇外流的化合物的施用可以延至排卵后不超过3天，例如排卵后1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。
本发明一个重要的方面涉及药物组合物，其包含能够抑制固醇从头生物合成的化合物与能够提高固醇外流的化合物的组合，以任选地药学上可接受的载体。
在本发明一个特别优选的实施方案中，由于对细胞固醇含量具有影响的两个不同过程在时间上同时发生，故可以获得抑制素和环糊精的协同效应，产生的效果超过两个方案单独使用的加和，优选地至少3倍。
优选的本发明组合物是包含抑制素和环糊精的组合。在另一实施方案中，本发明涉及将抑制素和环糊精连同药学上可接受的载体用于制备提高需要的哺乳动物的生育力的药物。
生长因子长久以来就用于临床，因而在优选的实施方案中，本发明涉及进一步包含生长因子的含抑制素和环糊精的组合物。此类生长因子可以是促性腺激素(FSH、LH、CG)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、生长激素、白介素或其它肽激素。
在优选的实施方案中，生长因子选自促性腺激素(FSH、LH、CG)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、生长激素、白介素及其它肽激素。
本发明另一个重要的方面涉及药物组合物，其包含能够抑制固醇从头生物合成的化合物与生长因子的组合。在优选的实施方案中，所述化合物为抑制素。
又在另一个重要的方面，本发明涉及药物组合物，其包含能够促进固醇外流的化合物与生长因子的组合。在优选的实施方案中，所述化合物为环糊精。
在本发明优选的实施方案中，一天向哺乳动物施用化合物和/或上文提及的任一组合物1-10次，例如一天1次、一天2次、一天3次、一天4次、一天5次、一天6次、一天7次、一天8次、一天9次或一天10次。
化合物和/或组合物也可以1次至几次施用，或者在该段时间通过组织泵送装置连续地施用。化合物和/或组合物可以在该段时间通过组织泵送装置连续地施用1次至几次。化合物和/或组合物可以以能延缓其体内释放的制剂形式施用。此类制剂使得可以在前述阶段之前一段时期比如说0-30天施用化合物和/或组合物，而通过体内缓释在非常相同的时间段上实现组织暴露。此类施用将藉此对生殖细胞的发育产生与导致立即体内释放的施用方案相似的期望效果。
本发明也涉及将上文提及的任一组合物用于制备本发明任一方法中使用的药物组合物。
本领域技术人员公知卵是经历染色体减少因而可准备受精的卵子，其采取相对大的非游动性配子的形式，提供了受精卵的大部分胞质。这些卵即使以成熟及准备受精的形式释放，在某种程度上仍可能缺失完成受精过程的能力，这可以通过添加能够抑制固醇从头生物合成的化合物而得到帮助。
在实施例中，证明Mevacor(通过抑制胆固醇从头生物合成的关键调控步骤HMG-CoA-还原酶起作用的抑制素类药物产品)导致血清胆固醇下降，并且如这里所证明的，影响器官象肝和卵巢中游离胆固醇的含量(实施例3)。与此相应，卵巢应答而产生大量可受精的卵母细胞和/或提高这些占优势的排出卵的发育能力——这通过在与正常(未处理)雄性小鼠交配后输卵管中2-细胞数目的增加得到证实(实施例1)。
抑制素对减数分裂成熟的改善通过实施例4证明，它表明向培养基添加抑制素(美伐他汀，Sigma)介导卵母细胞的体内减数分裂成熟。而且，该效果似乎可以与公知的促性腺激素(此处FSH)的减数分裂成熟效果累加。
此处包括了证明卵母细胞成熟和胆固醇从头生物合成之间相关性的代谢数据。在体外用美伐他汀替换Mevacor是必要的，因为Mevacor、洛伐他汀的活性成分只有在肝中生物转化后才有活性。与更为天然的排卵引发剂hCG相比，抑制素对胆固醇降低的增强作用通过实施例3证实。在激素诱导的小鼠卵母细胞发育和排卵期间游离胆固醇的总体下降通过实施例5提供的数据得到证实。
抑制素对受精的改善通过实施例7显示，它证明使用IVF时向IVM培养基中添加抑制素(美伐他汀，Sigma)改善卵母细胞的精子受精。已证明与对照温育及和FSH的温育相比，IVM期间美伐他汀的存在介导IVF后受精的卵母细胞数目的提高。退化的卵母细胞的比率保持相同(图8)。令人惊讶的是，与添加FSH相比，抑制素具有增强的效果。在图9中，结果表明与用于比较的上述两个组相比，用美维诺林处理的细胞在IVF后的72小时培养后到达更为前进的状态。美维诺林处理组中72小时培养后的退化比率与上述两个用于比较的组相比低，这可能与在存在美维诺林时培养的卵母细胞在IVM后表现出在显微镜检期间不可见的高度卵丘扩展的事实相符。卵丘扩展对于适当的卵母细胞成熟和受精准备是必要条件。
以羟丙基-β-环糊精为例，固醇结合和转运物质对受精的改善通过实施例8证明，它表明向IVM培养基中施加羟丙基-β-环糊精改善卵母细胞在使用IVF时的精子受精，如图10所示。卵母细胞退化比率不受本范围内的环糊精的影响。
本发明的背景是有关游离固醇自质膜的流失是哺乳动物精子最终正确成熟的必要条件的现有知识。不过，本发明以三个新的主要思想为基础。
1)膜固醇下降是同样发生在卵母细胞最终受精前成熟期间的生物化学过程。迄今尚无有关卵巢或卵母细胞在受精前流失固醇的认识发表在科学文献或别处。
2)固醇的流失和/或与胞内固醇含量降低有关的过程，可通过施加固醇从头生物合成路径的抑制剂在两种性别的生殖细胞中得以增强。这种抑制不会导致生殖细胞或生殖细胞环境，例如通过提高脂蛋白摄入或提高固醇酯水解来进行完全的固醇补偿。这很可能是因为接近受精之前的生殖细胞环境中绝大多数固醇是在天然条件下原位产生的。固醇生物合成抑制作用将导致膜固醇含量的显著下降，这可以取代激素刺激的天然固醇流失。而且，天然固醇流失将通过固醇从头生物合成的抑制得以增强。
3)对固醇从头生物合成的抑制不仅介导重要的成熟过程本身如减数分裂成熟，而且是一种除介导精子获能之外还介导生殖细胞发育的关键步骤的机制。并且，膜固醇流失介导重要的成熟过程。
本申请提供了利用抑制素以负操纵卵母细胞和卵母细胞环境中的游离固醇水平的实验。与本发明有关的实验证明在最终卵母细胞成熟期间增强天然固醇流失导致卵母细胞生存力和受精能力的提高，这很可能是通过拯救许多否则会变得闭锁从而在激素依赖性生长期流失的“边缘”卵母细胞来实现的。而且，可以考虑向雄性小鼠体内给予抑制素导致附睾游动细胞(正常精子)中固醇从头生物合成下降和/或磷脂/固醇比下降。
本发明证明(图5)用激素刺激和抑制素处理青春期前雌性小鼠比单独用激素刺激相同小鼠，产生多平均大约70％的2-细胞。我们认为通过调整抑制素剂量和处理周期可获得甚至更高的百分比。该实例证明向雌性哺乳动物施加抑制素可以提高其配子的发育能力。
本发明证明可在卵泡成熟的卵泡期期间体内施用抑制素，达到增强成熟事件的效果。该效果很可能有赖于与发生固醇从头生物合成的动物相比，生殖细胞中总游离固醇含量的下降，这导致质膜中固醇与磷脂比率的下降，从而使生殖细胞更倾向于参与受精过程。而且，体外卵母细胞成熟和受精也将得益于抑制固醇从头生物合成的处理，导致减数分裂速率的提高和减数分裂后成熟的增强。
已知的精子体内或体外获能期间的固醇流失过程从未与胞内固醇从头合成联系起来。胆固醇存在于细胞内部和外部膜中，并且根据胞外环境的性质，在所有细胞中发生胆固醇向胞外间隙的稳定流失。而且，胆固醇被用作为合成例如胆汁酸和类固醇的底物。在另一方面，细胞自内部胆固醇-酯储藏、外部脂蛋白来源以及从头合成获得游离胆固醇。抑制这些过程之一通常导致其它过程之一增强，以获得恒定的细胞膜和细胞器固醇水平。
这些过程共同确保细胞中胆固醇的稳态，并且不可想象抑制单个胆固醇递送过程会改变胆固醇稳态的总体图像以及依赖于胆固醇利用的过程。例如，如本发明实施例3所例示的那样，雌性生殖腺中进行的类固醇生产不受完全阻断固醇从头生产的影响。因此，同样可能预期，阻断固醇从头合成路径对稳态的贡献将提高胆固醇摄入(脂蛋白摄取和游离胆固醇释放)和胞内动员(胆固醇-酯水解)。然而，本实施例3和6证明在卵巢和附睾(雄性成熟精子的储藏部位)的能动细胞级分中结果是每重量单位或磷脂单位的下降。实施例1和9证明这种固醇下降伴随着生殖细胞发育和/或质量的改善。
在另一方面，即使可以想到阻断固醇从头生物合成将导致其它生物化学过程中的固醇使用下降，引起如类固醇的产出下降，但由于这会干预类固醇产出和有赖于类固醇的生殖细胞成熟过程，故将严重削弱本发明方法在提高生育力方面的潜在治疗用途。本方法证明了药理学阻遏固醇从头生物合成可以导致雌性生殖细胞质量提高这一令人惊讶的发现。该方案不负面地影响类固醇生成，也就是有赖于胆固醇使用的过程。因而在雌性生殖细胞和/或生殖细胞环境中固醇以二分方式使用，这使得细胞可以通过降低一个细胞和/或生物化学区室中的固醇产出，并在同时保留另一个区室在固醇的使用和/或存在方面不受影响而作出应当。
本发明涉及利用已知的一般化合物通过抑制从头固醇生成来改善哺乳动物生育力。引起此经证明的生育力改善的潜在机制可能是固醇/磷脂比的调整。本发明证明通过药理学干预降低哺乳动物固醇从头生物合成可以产生具有改善的发育能力的雌性生殖细胞。此固醇降低机制在相反性别方面已经引导出雄性生殖细胞也将得益于建立在受精前的固醇抑制作用上的方案。
本领域技术人员公知导致妊娠的性交时间选择在不同物种间变化。因此本发明涉及哺乳动物生产后代有困难的情形，例如雌性哺乳动物在超过一天的无防护性交，例如2天、3天、4天、5天、10天、15天、20天、30天、1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、15年、20年或多于60年的无防护性交后不能够实现妊娠的情形。
上文所述的无防护性交的时间选择已知与哺乳动物规律地为受孕目的进行性交的时期有关。
由于本发明公开了新的和令人惊讶的抑制固醇从头生物合成可以改善哺乳动物生殖细胞成熟的观察结果，本发明也涉及无不育之苦但仅希望获得更高的受孕机会从而加速受孕的哺乳动物，特别是年龄从28到42岁的人类女性，其受孕水平随年龄成比例下降。本发明也涉及可以受益于该治疗获得双胞胎或三胞胎的人类女性。一般而言，本方法涉及可受益于此从而每次妊娠生产胎儿的数目提高的家畜及其它经济上有价值的哺乳动物。
不育的病灶当然不仅仅只基于雌性。在本发明中，对雌性生殖细胞成熟的影响推测也可以反映在雄性生殖细胞上。因而，在另一个实施方案中，本发明涉及抑制至少一个哺乳动物生殖细胞和/或配子中的固醇从头合成，由此提高至少一个哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力和/或哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的数目的方法，该方法包括在射精前0小时-12天向雄性施用能够抑制固醇从头生物合成的化合物，例如射精前0小时-11天、0小时-10天、0小时-9天、0小时-8天、0小时-7天、0小时-6天、0小时-5天、0小时-4天、0小时-3天、0小时-2天以及0小时-24小时。术语射精在本上下文中涉及从雄性输精管的任何精液释放。
本发明的一个重要方面涉及在体外提高至少一个哺乳动物生殖细胞和/或配子的数目和发育能力，由此提高至少一个哺乳动物配子的受精能力和/或所得受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力和/或哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的数目的方法，该方法包括向培养基中添加能够抑制细胞中固醇从头生物合成的物质。
本发明的另一个方面涉及提高至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的固醇外流，由此提高所述至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的发育能力的方法，所述方法包括向培养基中添加能够促进任何上述细胞或组织的固醇外流的化合物或化合物组合。
本发明优选的实施方案的目的在于提供各种细胞培养基，其包含能够通过提高固醇外流和/或抑制固醇从头生物合成而降低磷脂/固醇比的多种不同化合物。因而在一个优选的实施方案中，本发明涉及包含环糊精的细胞培养基。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及包含抑制素的细胞培养基。在最优选的实施方案中，本发明涉及包含抑制素和环糊精的细胞培养基。
存在多种商业上可获得的培养基，其可以支持配子呼吸和/或成熟，并且也能够培养哺乳动物受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎，例如但不限于Ham′s F10、Menezo B2、Medi-Cult Universal IVF培养基、Dulbecco′s改良eagle培养基(DMEM)、McCoy氏5A、Waymouth′s培养基、TCM-199、MEM、RPMI-1640及Leibovitz L-15。
在本上下文中，体外培养基被定义为支持至少一个卵母细胞单独地或者在其体细胞环境中和/或至少一个精子进行呼吸和/或成熟的介质，所述介质可以包括支持体外受精(IVF)方案和/或支持配子体外存活及成熟的细胞培养基。可以为可能用于体外受精(IVF)方案和/或支持配子存活及成熟的培养基建立多个参数以限定所述培养基。首要地，进行培养基培养时的pH、摩尔渗透压浓度以及缓冲空气的内容具有高度重要性。因而，在本上下文中，体外培养基优选具有240到320mOsm/l之间的摩尔渗透压浓度、7到7.8的pH、并在3-7％CO2的大气或者53-7％CO2、1-5％O2和88-96％N2下由CO2缓冲。
200到370mOsm/l之间的摩尔渗透压浓度可以更具体地涉及例如250到310mOsm/l、260到300mOsm/l、270到290mOsm/l、275到285mOsm/l、276到284mOsm/l、277到283mOsm/l、278到282mOsm/l或279到281mOsm/l的水平。在目前优选的实施方案中，摩尔渗透压浓度为大约280mOsm/l。
在本上下文中，7到7.8之间的pH可以更具体地涉及例如7.1到7.7、7.2到7.6、7.3到7.5、7.35到7.45、7.36到7.44、7.37到7.43、7.38到7.42例如7.39到7.41的pH水平。在优选的实施方案中，pH为大约7.4。
并不旨在限制本发明的范围，IVF-培养基的其它一般特征可以是所述培养基包含111到171mEq/l Na+、2.1到6.1mEq/l K+、96到146mEq/l Cl-、22.6到26.6mEq/l HCO3-、0.3到1.2mM Ca++、29到69mg/l磷、0.56到1.56g/l葡萄糖、0-50000IU/l青霉素、0-50000IU/l链霉素、0.1到10.0g/l白蛋白、0-75IU/l FSH、0-250IU/l LH和0-6g/l总蛋白。其它可能的添加剂包括胎牛血清、人血清例如母体血清、抗氧化剂例如生育酚和/或抗坏血酸、激素、Mg++、丙酮酸盐、乳酸盐、酚红、嘌呤、嘧啶、氨基酸和胆固醇。通常，培养基在37℃(+/-1℃)培养。
在本发明优选的实施方案中，细胞培养基涉及化学成分确定的细胞培养基。术语“化学成分确定的培养基”用于指没有生物学提取的血清物质的培养基，且其中所有组分和其浓度是已知的且有描述。如果需要向培养基中添加激素或血清来源物质，优选重组激素或血清来源物质。在替代的实施方案中，培养基含有通过重组方法获得的BSA或HSA，从而消除了与哺乳动物血清间的接触。在非常优选的实施方案中，未成熟人类配子在化学成分确定的培养基中培养而不添加血清直接来源的产品或患者自身的血清或任何其它直接来源于哺乳动物(例如人类或牛)的血清产品。
生长因子例如但不限于促性腺激素目前用于IVM治疗中。因而，上文描述的任何培养基的优选实施方案进一步涉及还包含至少一种生长因子的细胞培养基，其中所述生长因子选自促性腺激素(FSH，LH，CG)、IGF、EGF、胰岛素、生长激素、白介素或其它肽。
本发明的方法将优选起始于未成熟或未完全成熟的雌配子。在女性中，未成熟卵母细胞可作为具有紧密卵丘物质、无极体或可见生发泡的卵母细胞而被识别。这些卵母细胞容易被参与常规IVF-治疗的人员识别为未成熟卵母细胞，因而一个实施方案中，本发明涉及使从原始卵泡阶段到窦前阶段获得的未成熟卵母细胞成熟的方法，包括在如上文所述的细胞培养基中培养所述未成熟卵母细胞。
在优选的实施方案中，向体外培养基中施加抑制素的量取决于特定的抑制素，并且为0.01-1000μM、0.05-1000μM、0.1-1000μM、0.5-1000μM、1-1000μM、5-1000μM、10-1000μM、20-1000μM、25-1000μM、30-1000μM、50-1000μM、75-1000μM、100-1000μM、200-1000μM、300-1000μM、400-1000μM、500-1000μM、750-1000μM或者10-900μM之间、25-750μM、50-500μM、100-400μM、200-300μM、0.01-20μM、0.01-15μM、0.05-15μM、0.1-10μM或1-10μM。
可以通过如下方式优化根据本发明方法进行的至少一个卵母细胞在体外培养基中的培养，以抑制固醇从头生物合成和/或促进固醇外流和/或降低游离固醇与磷脂之间的比率在体外培养基中培养单独的或处于其体细胞环境中的至少一个卵母细胞1秒至15天，例如1秒到14天，1秒到13天，1秒到12天、1秒到10天、1秒到9天、1秒到8天、1秒到7天、1秒到6天、1秒到5天、1秒到4天、1秒到3天、1秒到2天、1秒到1天、1秒到23小时、1秒到22小时、1秒到21小时、1秒到21小时、1秒到20小时、1秒到19小时、1秒到18小时、1秒到15小时、1秒到12小时、1秒到11小时、1秒到10小时，例如1秒到5小时。
根据本发明的方法在体外培养基中进行的精子培养可以通过在体外培养基中培养精子1秒到8天，例如1秒到7天、1秒到6天、1秒到6天、1秒到4天、1秒到3天、1秒到2天、1秒到1天、1秒到23小时、1秒到22小时、1秒到21小时、1秒到21小时、1秒到20小时、1秒到19小时、1秒到18小时、1秒到15小时、1秒到12小时、1秒到11小时、1秒到10小时，例如1秒到5小时而优化，以抑制固醇从头生物合成和/或促进固醇外流。
IVF治疗一般包括对需要治疗的雌性哺乳动物实施激素治疗。虽然激素治疗确实具有许多副作用，但它仍然是当今不育最有效的治疗方法之一。不育夫妇的标准IVF治疗通常包括用外源激素治疗后从女性收集成熟卵样本。此方案通常意味着女性用促性腺激素释放素激动剂或拮抗剂处理，它们均导致垂体释放促性腺激素的程度实质性地下降。随后由肌内或腹膜内注射提供外源促性腺激素，它确保许多卵母细胞生长并成熟。此类治疗后面的理论在于女性循环促性腺激素的确切量可任意调控，结果是优化随后可用于受精的卵母细胞数目，并且在任何情况下该数目将超过未治疗(自发循环)女性中准备受精的卵母细胞数目(通常仅一个)。在普通方案中，该治疗包括在施用的促性腺激素引发卵子从卵巢释放到输卵管之前通过抽吸从女性获取卵母细胞。
与促性腺激素或本领域技术人员公知用于IVF治疗的其它激素联合施用能够抑制固醇从头生物合成的化合物和/或能够促进固醇外流的化合物，这种累加的且可能地协同的效应是本发明优选的实施方案。
在雌性哺乳动物中，能够抑制固醇从头生物合成的化合物和/或能够促进固醇外流的化合物的体内治疗联合外源促性腺激素、促性腺激素释放激素(gnrh)或gnrh激动剂和/或拮抗剂的体内治疗，提供了累积/协同效应，与标准IVF治疗相比，提高了准备体内或体外受精的成熟卵子的数目，和/或总数卵子中受精的卵子的数目，和/或受精的卵子中胚泡的数目，和/或发育胚泡中植入胚泡的数目，和/或每个生殖周期中递送的子代的数目。
并且，在激素刺激的抽吸前阶段向女性施用固醇从头生物合成抑制剂和/或能够促进固醇外流的化合物将可能导致节省用于获得一定数目的成熟卵母细胞、受精的卵子、胚泡、植入和/或随后的妊娠的外源促性腺激素的量。此激素节省方案将成为可替代单独利用外源激素的一种副作用降低且费用降低的替代方案，并且这构成了本发明的又一个重要范围。在不期望的副作用中有卵巢过刺激综合症(OHSS)和多囊卵巢综合症(PCO)。在体内刺激卵巢期间利用抑制素作为助剂将导致体内所用的促性腺激素剂量的减少和随后这些副作用发生率的降低。
在本上下文中，术语“促性腺激素释放激素”或“gnrh”涉及由下丘脑产生的刺激垂体或其它器官或组织释放促性腺激素的内源哺乳动物肽激素。该类激素的其它名称包括促黄体生成激素释放因子和黄体生成激素释放激素。
在本上下文中，术语“促性腺激素释放激素激动剂”涉及刺激哺乳动物垂体或别处的促性腺激素释放激素受体产生第二信使的任何物质，所述第二信使正常地参与gnrh-受体与gnrh结合和促性腺激素生成和/或促性腺激素从垂体或别处的释放之间的信号传导。
在本上下文中，术语“促性腺激素释放激素拮抗剂”涉及抑制gnrh与gnrh-受体结合和/或抑制正常地参与gnrh-结合的信号传导，从而阻碍携带gnrh-受体的细胞在与gnrh接触后产生和/或释放促性腺激素的任何物质。
标准IVF治疗包括雄性通过手淫或电刺激射精递送精液样品。在获得用于IVF治疗的精液样品前施用能够抑制固醇从头生物合成的化合物和/或能够促进固醇外流的化合物的协同作用同样是本发明优选的实施方案。在雄性哺乳动物中，能够抑制固醇从头生物合成的化合物和/或能够促进固醇外流的化合物的体内联合治疗，提供了累积协同效应，与标准IVF治疗相比，提高了准备体内或体外受精的成熟精子的数目，和/或总数卵子中受精的卵子的数目，和/或受精的卵子中胚泡的数目，和/或发育胚泡中植入胚泡的数目，和/或每个生殖周期中递送的子代的数目。
IVF治疗的概念也包括在从雄性或雌性收回生殖细胞后，在许多精子与至少一个卵母细胞混合的适当条件下培养这些生殖细胞。本发明的又一个优选的实施方案是利用固醇从头生物合成抑制剂和/或能够促进固醇外流的化合物在混合精子和卵子前添加到温育卵子和/或精子的培养基中以及添加到温育精子和卵子的培养基中，以便获得受精的卵子。此类添加将导致与标准IVF治疗相比，提高准备体内或体外受精的成熟卵子的数目，和/或总数卵子中受精的卵子的数目，和/或受精的卵子中胚泡的数目，和/或发育胚泡中植入胚泡的数目，和/或每个生殖周期中递送的后代的数目。
应当理解上文讨论的有关根据本发明的方法的任何特征和/或方面适用于根据本发明的类似用途。
图1哺乳动物雌性和雄性生殖细胞发育的二分图。雄性和雌性生殖细胞发育的一个主要区别由静息阶段显示。雄性生殖细胞在减数分裂阶段前静息，而卵母细胞在减数分裂阶段(前期)静息。静息阶段是胚胎发育或出生后生命早期与青春期之间的阶段，其中生殖细胞是不分裂的。雄性和雌性生殖细胞发育的另一个主要区别表现为雄性生殖细胞群通过干细胞有丝分裂而更新，这与雌性生殖细胞群数目固定相反。
图2哺乳动物从头固醇前和固醇生物合成路径。固醇前生物合成根本上起始于乙酸与辅酶A缩合形成乙酰-辅酶A。乙酰-辅酶A在多酶促步骤中加工，可以导致产生角鲨烯。角鲨烯通过两个酶转化成羊毛甾醇，它是固醇生物合成途径的基础。哺乳动物内质网中的固醇生物合成至少包括所示的7个酶，但可能与此平行还包括许多具有相似催化特征的酶。酶以斜体在灰色背景中标出，而固醇中间物以普通字母表示，上标指示相关C-C双键和非胆固醇甲基取代基。双向箭头表示酶促步骤是可逆的。24-烯(左手图)与侧链饱和固醇(右手图)之间的虚线箭头表示固醇Δ24还原酶可能具有多种固醇底物。
图3固醇前生物合成路径的分支。上图2所示的固醇代谢仅仅是HMG-CoA-还原酶介导的甲羟戊酸生成的许多可能的结果之一。代谢物之间的两个箭头表示多步酶促转化。
图4环戊烷多氢菲环结构中的结构、碳编号及环命名。C-编号依据IUPAC约定。
图5促性腺激素刺激的青春期前雌性小鼠在用Mevacor处理后输卵管中的2-细胞数目。平均值的标准误差由误差条表示。该图代表5个独立的实验。所有实验的平均值在右侧显示。
图6在FSH和抑制素(美伐他汀)中培养后小鼠卵丘卵母细胞复合体(COC)的减数成熟率。GVBD代表在光学显微镜下无可见生发泡的卵母细胞，这表明卵母细胞重新开始减数分裂。PB/GVBD表示在培养期间重新开始减数分裂的卵母细胞中极体形成的比率。每个实验平行进行一式四份，并且每个实验代表30-40个COC。误差条表示平均值的标准误差。条上方不同的字母表示在95％置信度的统计学差异。
图7图6中所示的COC培养20小时后从乙酸进入游离胆固醇中的3H的放射性跟踪。纵轴上的DPM表示在由HPLC方法矫正计数效率和纯化效率后通过闪烁探测器测量的放射性。N表示提取后用于通过HPLC分离胆固醇的COC的总数。
图8和9与对照和FSH相比，用抑制素(美维诺林)体外成熟的卵母细胞的受精率。与存在7.5I.U./L FSH下培养的CEO和对照CEO相比，受精的卵母细胞(PB2-卵母细胞到4+细胞)的百分数通过向CEO的IVM-培养基中添加抑制素美维诺林而提高。而且，(未显示)美维诺林处理的卵母细胞在IVM培养期后相对于对照卵母细胞表现出广泛的卵丘扩展。FSH-处理的卵母细胞在这方面介于这两组之间。退化程度在组间无差别。并且在胚胎培养72小时之后，与两个对照组相比，美维诺林处理组中的发育到达更为前进的状态。
图10用环糊精(羟丙基-β-环糊精)体外成熟的卵母细胞与对照相比的受精率。与对照NO相比，受精的卵母细胞(PB2-卵母细胞到4+细胞)的百分数通过向NO的IVM-培养基中添加固醇结合及转运物质羟丙基-环糊精而提高。退化率不受IVM-培养基中环糊精存在的影响。
图11
由本发明操纵的发育进程的综览。本发明涉及体内及体外的成熟和受精过程而不涉及任何胚胎发育。与固醇从头生物合成抑制有关的概念对雄性和雌性都适用，而与使用固醇结合及转运物质有关的概念仅在雌性的成熟期间适用。
图12本发明描述的体外发育过程的综览。
图13硫酸化环糊精的通式。如果R＝CH2CH(OH)CH3，则该结构代表下文实施例8中所用的羟丙基-β-环糊精。
实施例实施例1向雌性小鼠施用抑制素对受精后体内2-细胞数目的影响青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麦)通过腹膜内注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麦)被刺激超数排卵(0天上午11点)。该促性腺激素制品就生物学活性而言含50％人类FSH和50％人类LH。半数小鼠通过将含40mg洛伐他汀的Mevacor(Merck Sharp and Dohme，NL)片溶解到5ml PBS中，并从0天起连续3天腹膜内注射所得200μL浆液而额外接受1.6mg洛伐他汀注射。另一半(对照小鼠)注射类似体积的PBS。在第2天下午1点，向动物给予排卵剂量的10IU hCG(Ferring，丹麦)。1小时后小鼠各自与相同株系和供应商的成熟雄性小鼠(每只雌性1只雄性)一起独立笼养。雌性和雄性小鼠在第3天上午9点分开，雌性再单独留置48小时。在处死雌性小鼠和解剖输卵管后，通过将玻璃吸量管放置在分离的输卵管一端，并用嘴通过过滤器吹气，将2-细胞冲到具有培养基的塑料盘中(见后面)。之后计数从每只小鼠冲出的2-细胞总数。所述2-细胞随后在通用IVF-培养基(Medicult，丹麦)上于孵育器(37℃，95％空气，5％CO2)中在4孔板(Nunclon 176740，Nunc，丹麦)上培养。培养4天后，利用显微镜对孔评分并确定桑椹胚、胚泡或退化实体的数目。
当小鼠在卵泡期成熟期间用3×1.6mg抑制素处理时，每只动物的2-细胞数目显著升高(图4)。这代表了胆固醇降低治疗在生殖方面的主要结果与对照动物相比，排出的和受精的卵母细胞数目升高。2-细胞在体外培养，并以和对照无区别的恢复速率发育成胚泡。
实施例2利用不同方案向雌性小鼠施用抑制素对受精后体内2-细胞数目的影响青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麦)如实施例1中那样处理，但有些许变化。在实验A中，抑制素剂量降至100μg/动物，并在hCG-注射前15分钟作为单次注射给予。在实验B中，抑制素剂量降至3×100μg/动物，并如实施例1中那样施用。在实验C中，抑制素剂量在9月龄小鼠的hCG-注射前15分钟作为单次注射给予。在实验D中，促性腺激素剂量逐渐降低，而抑制素剂量如实施例中那样施用。
整体而言，该实验表明抑制素剂量可以降至实施例1中所用剂量的十分之一。并且，与卵泡期阶段较宽的时间窗口中的应用不同，合适浓度的抑制素可在hCG的排卵刺激前作为单次注射给予。实验D证实了一个附加概念，即，降低的促性腺激素施用可部分地通过共施用抑制素补偿。不过，在就这些方面作出结论之前，本实施例中的所有实验尚需要定量地具体化。
表2施用外源促性腺激素和抑制素(Mevacor)之后C57黑色×DBA 2 F1小鼠中的2-细胞数目实验 动物阶段 GnrhhCG 抑制素治疗 施用方案 交配动物中的 交配 交配编号(I.U.) (I.U.)2-细胞数目 数目 频率- 22.0±8.933/4A青春期前 1210 100μg Mevacor单次27.5±3.522/4排卵期1000μg Mevacor 单次15.3±7.344/4排卵期- 9.5±2.2 44/4B青春期前 1210 100μg Mevacor单次19.3±4.144/6排卵期3×100μg Mevacor 多次6.5±1.0 44/5卵泡期- 25.2±7.155/8C成熟周期 1510 1.0mg Mevacor 单次16.8±3.455/8排卵期12-123×1.0mg Mevacor 多次11.4±2.966/8卵泡期4 - 7.2±1.4 66/8D青春期前 4 5 3×1.0mg Mevacor 多次511/4卵泡期1.2 - 111/41.2 3×1.0mg Mevacor 多次 00/4卵泡期00/4实施例3刺激青春期前小鼠生殖腺后施用抑制素增强LH/hCG诱导的卵巢中游离胆固醇组织密度的下降青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麦)通过腹膜内注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麦)被刺激超数排卵(0天上午11点)。半数小鼠通过将含40mg洛伐他汀的Mevacor(Merck Sharp and Dohme，NL)片溶解到5ml PBS中，并从0天起连续3天腹膜内注射所得200μL浆液而额外被给予1.6mg洛伐他汀注射(如实施例1中那样)。另一半(对照小鼠)注射类似体积的PBS。在第2天下午1点，向动物给予排卵剂量的10IU hCG(Ferring，丹麦)并于6小时后处死，制备卵巢提取物并进行HPLC-分析。卵巢成对分离，称重，冻干，再次称重，且随后在1.0ml(v/v)75％正庚烷∶25％异丙醇中提取。有机提取物在流动相中重构，进行直相(straight-phase，SP)HPLC分离(ChromSpherSi，5μm，250×4.6mm HPLC柱，在(v/v)99.5％正庚烷(Fischer，Leicestershire，U.K.)∶0.5％异丙醇(Baker，NL)中以1.00ml/分跑样)。洗脱物通过200-300nm之间的紫外光吸收检测。在HPLC分析之前，含胆固醇、FF-MAS和孕酮(P4)的标准混合物跑样三次，以确定标准品响应因子的稳定性。胆固醇(Steraloids C6760)和P4(Sigma P-0130)标准品由商业上获得，而所用的FF-MAS标准品如以前所述(Baltsen等，1999)在实验室中制备。所有标准曲线在全部样品值范围内是线性的。
表3用hCG和抑制素刺激的促性腺激素致敏的青春期前小鼠卵巢中的游离胆固醇(C)、卵泡液减数分裂激活固醇(FF-MAS)和孕酮(P4)。不同后缀字母(粗体)代表t-检验的统计学差异。
刺激组hCG+抑制素 hCG -N 13 66小鼠称重(g) 14.6±0.2A 15.3±0.3A 14.6±0.3AN 5 53卵巢称重(mg) 2.3±0.1A 2.2±0.2AB 1.9±0.1BC，卵巢(mg/g湿重) 2.2±0.1A 2.7±0.1B3.0±0.2BC，卵巢(mg/g干重) 10.5±0.6A§11.0±0.4A§12.1±0.5AC，肝脏(mg/g湿重) 1.7±0.1A#(未测)2.9±0.3BC，肝脏(mg/g干重) 6.5±0.5A#(未测)7.1±0.4AFF-MAS(μg/g湿重) 0.13±0.05A3.0±0.5B 0.76±0.66AP4(μg/g湿重) 14.9±0.9A 13.0±0.5A1.3±0.7B#)N＝3§)显著性边界线(P＝0.055，备择假设″hCG+抑制素″＜″对照″)。显著性边界线(P＝0.061，备择假设″hCG″＜″对照″)。
排卵前小鼠卵巢中游离胆固醇的组织密度下降。hCG刺激后卵巢中游离胆固醇组织密度的下降趋势因抑制素处理而明显。所述下降不能完全由产生类固醇的hCG激素的肿胀效应解释，因为当基于干组织重量评价时胆固醇组织密度也下降。施加HCG以模拟天然排卵前的LH高峰。重点指出的是孕酮(类固醇)产生的程度不受抑制素处理的影响。并且，应当注意抑制素完全阻断LH/hCG诱导的胆固醇前代谢物FF-MAS的累积，并使卵巢中FF-MAS的水平低于未用hCG刺激的小鼠。而且，与对照和hCG刺激的小鼠卵巢的比较揭示就组织密度而言，胆固醇的绝对下降是FF-MAS升高的100倍以上。
实施例4HMG-CoA-还原酶抑制剂在体外刺激卵丘包围的卵母细胞的成熟并在体外增强促性腺激素刺激的卵丘包围的卵母细胞的成熟青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麦)如实施例1和2中那样，通过腹膜内注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麦)被刺激超数排卵(0天上午11点)。46小时后，将卵巢浸泡在补充有4mM次黄嘌呤的培养基(α-MEM 22571-020，Gibco BRL，苏格兰)(见下文)中，通过用0.20mm的针穿刺卵巢中排卵前的卵泡，从卵巢收回来自排卵前卵泡的卵母细胞。通过制备性显微镜鉴定并随后用装有膜的开口吸量管吸取收集卵丘-卵母细胞复合体(COC)，并在α-MEM中于孵育器(37℃，95％空气∶5％CO2)中在4孔板(Nunc，丹麦)上培养。培养基补充有4mM次黄嘌呤(HX)(Sigma H-9377，Sigma-Aldrich，丹麦)、200mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，苏格兰)、20000IU/L青霉素(Gibco BRL，苏格兰)、20000IU/L链霉素(Gibco BRL，苏格兰)和3mg/ml BSA(SigmaA-7030，Sigma-Aldrich，丹麦)。所有温育添加25mCi3H-乙酸盐(NEN，U.S.A.)以便在温育后通过闪烁测量胆固醇的从头合成。添加50mM处于DMSO(所有设置(包括对照)中培养基DMSO终浓度为1％v/v)中的抑制素美伐他汀(Sigma，Sigma-Aldrich，丹麦)，并添加7.5IU/L终浓度的重组人类卵泡刺激激素(Gonal-F，Serono，DK)。培养22小时后，评价卵母细胞中生发泡(GV)的存在、生发泡的破裂(GVB)以及极体(PB)的存在。这3个状态代表卵母细胞成熟的进程。
胆固醇降低方案本身具有减数分裂成熟效果，此效果似乎可以累积到公知的FSH成熟效果上(图4)。将四份平行实验的细胞汇合，并测量自乙酸代谢的3H的量，证实胆固醇的从头生物合成确实通过添加抑制素而下降(图5)。美伐他汀的效果显著，而FSH在抑制胆固醇从头生物合成方面的作用不太有效。该实验证明利用抑制素抑制胆固醇从头生物合成增强由促性腺激素导致的体外天然成熟事件，且同时增强对胆固醇从头合成的阻断。
实施例5hCG在体外介导小鼠卵巢中胆固醇从头生物合成的停止青春期前的C57黑色×DBA 2F1雌性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麦)如实施例1-4中那样，通过腹膜内注射于200μL H2O中的12IU Menogon(Ferring，丹麦)被刺激超数排卵(0天)。46小时后如实施例4中那样分离卵巢并在0.25mCi3H-乙酸(NEN，U.S.A.)的存在下于α-MEM(Gibco BRL，苏格兰)中培养。培养物中添加0(对照)或5IU/ml hCG与0(对照)或20％FCS的组合。2个卵巢在1.0ml培养基中共同温育。22小时后，终止培养，冲洗卵巢，并如实施例3所阐释的那样提取。提取的固醇用HPLC柱分离ChromSpherSi 250×4.6mm，5μm；流动相99.65％正庚烷(Fisher，Leicester，U.K.)∶0.35％异丙醇(Baker，Deventer，NL)(vol.∶vol.))、再生90％正庚烷∶10％异丙醇。在直相样品分析前，对含角鲨烯、4，4-二甲基固醇、7-脱氢胆固醇、链甾醇、胆固醇和P4的标准品进行连续3次跑样，以便对收集的时间窗口进行制表。收集含角鲨烯的窗口1(2′50″-4′00″)、含4，4-二甲基固醇的窗口2(10′30″-14′00″)、含胆固醇和链甾醇的窗口3(25′00″-29′00″)、含5，7-烯的窗口4(29′30″-33′00″)和窗口5(含P4)，干燥并置于反相LiChrospher RP-8.5μm，250×4.6mm HPLC柱在(v/v)92.5％乙腈∶7.5％水中以1.00ml/分于40℃跑样。分析物通过200-300nm之间的UV光吸收鉴定。角鲨烯(Merck S21362)、羊毛甾醇(Sigma L5768)、酵母甾醇(Steraloids C3200)、7-烯胆甾烷醇(Steraloids C7400)，7-脱氢胆固醇(Steraloids C3000)、羊毛甾醇(steraloids C7400)、7-脱氢胆固醇(steraloids C3000)、链甾醇(Steraloids C3150)、胆固醇(Steraloids C6760)和P4(Sigma P-0130)由商业上获得，而FF-MAS和T-MAS标准品在实验室制备。所有下文所列的分析物在反相分离中作为均质单峰洗脱。收集峰，在闪烁瓶中与3.0ml闪烁液(Packard，NL)混合。在Beckman LS 1801液闪计数器中进行计数。针对计数效率和样品注射校正CPM值。
表4存在3H乙酸时体外温育小鼠卵巢后通过HPLC分离的分析物的闪烁数据分析物 对照/hCG P 对照/FCS P角鲨烯 80±9％0.099 136±20％0.139n.s.
羊毛甾醇22±7％0.000074331±98％0.065n.s.
FF-MAS 72±16％ 0.133 63±11％ 0.021**T-MAS 43±5％0.00005996±13％ 0.76n.s.
5，7-烯 35±4％0.000071161±33％0.142n.s.
链甾醇 58±7％0.0041 91±13％ 0.55n.s.
胆固醇 226±39％ 0.032*111±32％0.75n.s.
孕酮13±5％0.000085-n.c.***P值得自于6+6个样品的成对检验，假定对照值不等于测试值。*)添加hCG后下降。**)随着FCS添加而增加。***)由于低闪烁数值而未比较。N.s.代表不显著。
该实验证实在hCG处理后，小鼠卵巢中胆固醇从头生物合成下降，而从头产生的胆固醇前固醇的累积增加。并且，与孕酮(hCG/LH处理后卵巢中产生的主要类固醇)相关的放射活性量下降。这揭示当卵巢被刺激排卵时，起源于从头产生的胆固醇的底物总量下降。事实上，掺入到各种固醇级分中的放射活性量独立于脂蛋白(FCS)的补充，这表明排卵刺激后卵巢中胆固醇降低的生物学机制不受通常的胆固醇稳态机制的影响。
实施例6通过事先施用抑制素改变小鼠附睾游动细胞级分中的胆固醇与磷脂比(C/PL-比)使用青春期后的C57黑色×DBA 2F1雄性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麦)。按每30g体重1.0mg洛伐他汀给予4只小鼠3次腹膜内注射，具体为将含40mg洛伐他汀的Mevacor(Merck Sharp and Dohme，NL)片溶解到8ml PBS中，并将附睾精子收集日记作0天，于-6、-3和-1天下午1点腹膜内注射所得200μL浆液。4只其它小鼠(对照小鼠)注射相似体积的PBS。在0天上午10点处死所有小鼠，并在生理盐水中制备附睾。之后，将附睾转移到含MEM(Gibco BRL，苏格兰)的1-mL培养孔中，其中MEM中补充有2.3mM丙酮酸、200mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，苏格兰)、20000IU/L青霉素(Gibco BRL，苏格兰)、20000IU/L链霉素(Gibco BRL，苏格兰)和0.2mg/ml BSA(Sigma A-7030，Sigma-Aldrich，丹麦)，然后将附睾置于孵育器(37℃，95％空气∶5％CO2)中。
温育1.5小时后，上层液相吸出，并转移到新的玻璃瓶中并离心。离心后，弃上清，将沉淀冻干，之后由50％甲醇∶50％氯仿(vol./vol.)提取。随后将提取物分成两等份。一半如上文实施例中所指出的进行固醇分析，并计算由胆固醇、链甾醇、胆甾-7，24-二烯-3β-醇、T-MAS和羊毛甾醇组成的总固醇含量。另一半根据Bartlett(Bartlett，1958)的方法进行磷脂测定。计算每一个体动物的C/PL-比。
认为抑制素处理组中的C/PL-比率比对照组中的C/PL-比率低。
实施例7IVM期间施加抑制素提高IVF后小鼠卵丘包围的卵母细胞(CEO)的受精率小鼠卵母细胞根据实施例3中的描述分离并培养，但有一处变化，即IVM培养基还补充有1mg/mL胎球蛋白(Sigma F-3385，Sigma，U.S.A.)。将CEO分成3组，并在含添加了如下成分的培养基的板中培养1％(v/v)乙醇(对照)、浓度7.5IU/L的重组人类卵泡刺激激素(Gonal-F，Serono，DK)连同1％(v/v)乙醇(FSH)或10μM美伐他汀(美维诺林M2147，Sigma-Aldrich，丹麦)连同1％(v/v)乙醇(美维诺林)。为了在培养基中溶解美维诺林，乙醇是必需的。在体外成熟22小时后，将卵母细胞转移到由极限必需培养基(MEM)(21090-022，Gibco BRL，苏格兰)、200mM L-谷氨酰胺(Gibco BRL，苏格兰)、20000IU/L青霉素(Gibco BRL，苏格兰)、20000IU/L链霉素(Gibco BRL，苏格兰)、3mg/ml BSA(Sigma A-7030，Sigma-Aldrich，丹麦)、2.3mM丙酮酸钠(S-8636，Sigma)、10mM乙二胺四乙酸(EDTA，Merck 1.08418.0250)和1mg/mL胎球蛋白(Sigma F-3385，Sigma，U.S.A.)组成的受精培养基中，在将卵母细胞转移到受精培养基之前，以下列方式获得用于IVF的小鼠精子处死6-9月龄的C57黑色×DBA 2F1雄性小鼠(M & B A/S，Ry，丹麦)，并在生理盐水中制备附睾。之后，将附睾切成小块，并将成块的材料转移到4个含800uL上文所述IVF-培养基的1-mL培养孔中，随后置于孵育器(37℃，95％空气∶5％CO2)中。温育1.5小时后，4个孔之每一的300μL上层液相被吸出，并转移到新的玻璃瓶中。所得的游动精子库在计数室中计数，并向每个卵母细胞培养物中添加50000个游动精子细胞。IVF培养物在孵育器中于37℃，95％空气∶5％CO2温育20小时，之后将卵母细胞转移到在相同条件下平衡的新鲜IVF培养基中。使这些卵母细胞留置另外48小时，随后根据卵母细胞的成熟状态或者受精卵的进程计数，所述进程也就是GV-卵母细胞、GVBD-卵母细胞、PB-卵母细胞、PB2-卵母细胞(具有可见的第二极体的卵母细胞)、2-细胞、3-4细胞、4+细胞(具有多于4个分裂球的受精卵)以及退化细胞(通常是颗粒化的，或者具有广泛的质膜皱折的细胞)。
实施例8IVM期间施加环糊精提高IVF后裸鼠卵母细胞(NO)的受精率小鼠卵母细胞根据实施例？？所述分离并培养，将NO分成三组，并在含有添加了0‰、0.5‰、2.0‰或5‰羟丙基-环糊精(ICN 153540，ICNOhio，美国)的培养基的板中培养。IVM和IVF条件与实施例6中相同。
实施例9通过事先施用抑制素提高小鼠精子质量实验设置包括与实施例6中相同的动物和抑制素施用。通过为评价受精潜力和精子质量而建立的方法分析动物。认为与对照动物相比，抑制素处理的动物具有受精优势。
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Yamamoto等，1999，Hum Reprod，14(6)1516-1521。
权利要求
1.抑制哺乳动物生殖腺细胞和/或至少一个哺乳动物生殖细胞和/或配子和/或以固醇支持生殖细胞的生殖腺来源细胞中固醇从头生物合成，由此提高至少一个哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力，和/或提高具有受精能力的哺乳动物配子的数目，导致交配后雌性每个生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的数目增加的方法，所述方法包括向需要此方法的哺乳动物施用能够抑制固醇从头生物合成的化合物或化合物组合。
2.提高至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的固醇外流的方法，由此提高所述至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的发育能力的方法，所述方法包括向需要此方法的哺乳动物施用能够促进固醇外流的化合物或化合物组合。
3.根据权利要求1或2的方法，其中需要所述方法的哺乳动物是雌性，并且抑制作用和/或外流发生在排卵前0-12天和/或排卵后0-3天的一段时期内。
4.根据权利要求1的方法，其中需要所述方法的哺乳动物是雄性，并且抑制发生在射精前0-12天的一段时期内。
5.提高至少一个哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力和/或提高具有受精能力的哺乳动物配子的数目，从而导致雌性每个生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的数目增加的方法，所述方法包括向支持至少一个卵母细胞和/或至少一个精子呼吸和/或成熟的体外培养基中添加能够抑制所述至少一个哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎中固醇从头生物合成的化合物或化合物组合。
6.提高至少一个哺乳动物卵巢、卵母细胞、雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的固醇外流，由此提高所述至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的发育能力的方法，所述方法包括向支持至少一个卵母细胞呼吸和/或成熟的体外培养基中添加能够促进固醇外流的化合物或化合物组合。
7.根据权利要求1和3-5中任一项的方法，其中的化合物是拮抗一种或多种参与乙酰辅酶A和羊毛甾醇之间的生物合成路径的哺乳动物酶的物质或物质组合，所述酶为HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、二甲基烯丙基转移酶、牻牛儿基转移酶、角鲨烯合成酶、角鲨烯单加氧酶、氧化鲨烯羊毛甾醇环化酶及羊毛甾醇合成酶。
8.根据权利要求1、3-5和7中任一项的方法，其中的化合物是拮抗3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的物质或物质组合。
9.根据权利要求1、3-5和7-8中任一项的方法，其中的化合物是一种抑制素或多种抑制素的组合。
10.根据权利要求1、3-5和7-9中任一项的方法，其中的抑制素选自托伐他汀、西伐他汀、氟伐地汀、BAY W 62、普伐他汀、洛伐他汀(从前称之为美维诺林或美降脂K)、28、HR 780、普伐他汀、斯伐他汀、美伐他汀、甲基-美伐他汀、米法斯丁(从前称之为美伐他汀或ML-236B)、ML-236A、ML-236C、二氢美伐他汀、美降脂J、美降脂L、美降脂M、美降脂X、二氢美降脂L、美维诺林、3β-羟基美伐他汀酸单钠盐(普伐他汀，CS-514)、辛伐他汀、西伐他汀和制霉菌素/曲安奈德。
11.根据权利要求2-3和6中任一项的方法，其中能够促进固醇外流的化合物或化合物组合选自环糊精、化学修饰的环糊精、高密度脂蛋白(HDL)、来自HDL的脱辅基蛋白以及固醇载体蛋白I和II。
12.根据权利要求2-3、6和11中任一项的方法，其中的化合物是环糊精。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中抑制素和/或能够促进固醇外流的化合物的施用量为每天每kg体重0.01-100mg之间。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中向体外培养基中施用的抑制素和/或能够促进固醇外流的化合物的量为0.01-1000μM。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中至少一个卵母细胞在体外培养基中培养1秒到15天。
16.根据权利要求1、3-5、7-10和13-15中任一项的方法，其中精子在体外培养基中培养1秒到8天。
17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述施用和/或添加与促性腺激素的施用和/或添加联合。
18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述施用和/或添加与哺乳动物生长因子的施用和/或添加联合。
19.根据权利要求17的方法，其中促性腺激素在体外的施用量为0-1000 IU/L之间。
20.根据权利要求17的方法，其中促性腺激素在体内的施用量为每天每kg体重0-5 IU FSH和每天每kg体重0-200IU LH。
21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物选自人、马、牛、大鼠、小鼠、猪、绵羊、山羊、骆驼、狗、猫和貂。
22.根据前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物生殖腺细胞是以固醇支持生殖细胞的人类细胞或分离的生殖细胞。
23.根据前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物生殖腺细胞是卵丘包围的卵母细胞或分离的卵母细胞。
24.根据权利要求1、3-5、7-10和13-23中任一项的方法，其中生殖细胞是射出的精子。
25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物生殖腺细胞是自大的窦状卵泡收回的具有粘附的卵丘细胞的未成熟卵母细胞和/或分离的未成熟卵母细胞或者自窦前卵泡、小的或中等大小的窦状卵泡收回的具有粘附的卵丘细胞的卵母细胞和/或未成熟卵母细胞，小的人类窦状卵泡直径0.4-＜5mm，中等大小的人类窦状卵泡是5-＜15mm，而大的人类窦状卵泡直径在15mm或以上。
26.根据前述权利要求中任一项的方法，其中生殖腺细胞是在培养来自原始卵泡期至窦前期间阶段的至少一个未成熟卵泡之后获得的未成熟或成熟的卵母细胞。
27.细胞培养基，其包含抑制素或抑制素组合。
28.细胞培养基，其包含能够促进固醇外流的化合物或化合物组合，例如环糊精。
29.细胞培养基，其包含抑制素和环糊精。
30.根据权利要求27-29中任一项的细胞培养基，其中所述培养基是化学成分确定的细胞培养基。
31.根据权利要求27-30中任一项的细胞培养基，其进一步包含至少一种生长因子。
32.根据权利要求27-31中任一项的细胞培养基，其中所述生长因子选自促性腺激素(FSH、LH、CG)、IGF、EGF、胰岛素、生长激素、白介素及其它肽因子。
33.使由原始卵泡期和窦前期之间阶段获得的未成熟卵母细胞成熟的方法，包括在根据权利要求27-32中任一项的细胞培养基中培养所述的未成熟卵母细胞。
34.药物组合物，其包含能够抑制固醇从头生物合成的化合物与能够提高固醇外流的化合物的组合以及药学上可接受的载体。
35.根据权利要求34的药物组合物，其中所述化合物是抑制素和环糊精。
36.根据权利要求34-35中任一项的药物组合物，其进一步包含生长因子。
37.根据权利要求36的药物组合物，其中所述生长因子选自促性腺激素(FSH、LH、CG)、IGF、EGF、胰岛素、生长激素、白介素及其它肽因子。
38.药物组合物，其包含能够抑制固醇从头生物合成的化合物与生长因子的组合。
39.根据权利要求38的药物组合物，其中所述化合物为抑制素。
40.药物组合物，其包含能够促进固醇外流的化合物与生长因子的组合。
41.根据权利要求40的药物组合物，其中所述化合物为环糊精。
42.根据权利要求38或40的药物组合物，其中所述生长因子选自促性腺激素(FSH、LH、CG)、IGF、EGF、胰岛素、生长激素、白介素及其它肽因子。
43.能够抑制哺乳动物生殖腺和/或至少一个哺乳动物生殖细胞和/或配子和/或生殖腺来源细胞中的固醇从头生物合成的化合物或化合物组合在制备药物中的用途，所述药物用于抑制至少一个哺乳动物生殖细胞和/或配子和/或以固醇支持生殖细胞的生殖腺来源细胞中的固醇从头生物合成，由此提高至少一个哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力，和/或用于提高具有受精能力的哺乳动物配子的数目，导致交配后雌性每个生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的数目增加。
44.能够促进至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的固醇外流的化合物或化合物组合在制备药物中的用途，所述药物用于促进至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的固醇外流，由此提高所述至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的发育能力。
45.根据权利要求43或44的用途，其中哺乳动物是雌性的，并且抑制作用发生在排卵前0-12天和/或排卵后0-3天的一段时期内。
46.根据权利要求43的用途，其中哺乳动物是雄性的，并且抑制作用发生在射精前0-12天的一段时期内。
47.能够抑制固醇从头生物合成的化合物或化合物组合在制备支持至少一个卵母细胞和/或至少一个精子呼吸和/或成熟的体外培养基中的用途，所述培养基用于提高至少一个哺乳动物配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力，和/或用于提高具有受精能力的哺乳动物配子的数目，导致雌性每个生殖周期中受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的数目增加。
48.能够促进固醇外流的化合物或化合物组合在制备支持至少一个卵母细胞呼吸和/或成熟的体外培养基中的用途，所述培养基用于提高至少一个哺乳动物卵巢和/或哺乳动物卵母细胞和/或哺乳动物雌配子和/或卵母细胞周围的卵巢来源细胞的发育能力。
49.根据权利要求43和45-47中任一项的用途，其中的化合物是拮抗一种或多种参与乙酰辅酶A和羊毛甾醇之间的生物合成路径的哺乳动物酶的物质或物质组合，所述酶为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、二甲基烯丙基转移酶、牻牛儿基转移酶、角鲨烯合成酶、角鲨烯单加氧酶、氧化鲨烯羊毛甾醇环化酶及羊毛甾醇合成酶。
50.根据权利要求43、45-47和49中任一项的用途，其中的化合物是拮抗3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的物质或物质组合。
51.根据权利要求43、45-47和49-50中任一项的用途，其中的化合物是抑制素或抑制素组合。
52.根据权利要求43、45-47和49-51中任一项的用途，其中的抑制素选自托伐他汀、西伐他汀、氟伐地汀、BAY W 62、普伐他汀、洛伐他汀(从前称之为美维诺林或美降脂K)、28、HR 780、普伐他汀、斯伐他汀、美伐他汀、甲基-美伐他汀、米法斯丁(从前称之为美伐他汀或ML-236B)、ML-236A、ML-236C、二氢美伐他汀、美降脂J、美降脂L、美降脂M、美降脂X、二氢美降脂L、美维诺林、3β-羟基美伐他汀酸单钠盐(普伐他汀，CS-514)、辛伐他汀、西伐他汀和制霉菌素/曲安奈德。
53.根据权利要求44-45和48中任一项的用途，其中能够促进固醇外流的化合物或化合物组合选自环糊精、化学修饰的环糊精、高密度脂蛋白(HDL)、来自HDL的脱辅基蛋白以及固醇载体蛋白I和II。
54.根据权利要求44-45、48和53中任一项的用途，其中的化合物是环糊精。
55.根据前述权利要求中任一项的用途，其中抑制素的施用量为每天每kg体重0.01-100mg之间。
56.根据前述权利要求中任一项的用途，其中向体外培养基中施用的抑制素和/或能够促进固醇外流的化合物的量为0.01-1000μM。
57.根据前述权利要求中任一项的用途，其中至少一个卵母细胞在体外培养基中培养1秒到15天。
58.根据权利要求43、45-47、49-52和55-57中任一项的用途，其中精子在体外培养基中培养1秒到8天。
59.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述施用和/或添加与促性腺激素的施用和/或添加联合。
60.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述施用和/或添加与哺乳动物生长因子的施用和/或添加联合。
61.根据权利要求59的用途，其中促性腺激素的体外施用量为0-1000IU/L。
62.根据权利要求59的用途，其中促性腺激素的体内施用量为每天每kg体重0-5 IU FSH和每天每kg体重0-200IU LH。
63.根据前述权利要求中任一项的用途，其中哺乳动物选自人、马、牛、大鼠、小鼠、猪、绵羊、山羊、骆驼、狗、猫和貂。
64.根据前述权利要求中任一项的用途，其中哺乳动物生殖腺细胞是以固醇支持生殖细胞的人类细胞或分离的生殖细胞。
65.根据前述权利要求中任一项的用途，其中哺乳动物生殖腺细胞是卵丘包围的卵母细胞或分离的卵母细胞。
66.根据权利要求43、4547、49-52和55-65中任一项的用途，其中生殖细胞是射出的精子。
67.根据前述权利要求中任一项的用途，其中生殖细胞是卵母细胞。
68.根据前述权利要求中任一项的用途，其中生殖细胞是通过抽吸收回的未成熟卵母细胞或通过抽吸小的或中等大小的窦状卵泡收回的未成熟卵母细胞。
69.根据前述权利要求中任一项的用途，其中生殖细胞是在培养处于原始卵泡期至窦前期的至少一个未成熟卵泡之后获得的未成熟卵母细胞。
70.根据前述权利要求中任一项的用途，其中哺乳动物生殖腺细胞是自大的窦状卵泡收回的具有粘附的卵丘细胞的未成熟卵母细胞和/或分离的未成熟卵母细胞，或者自窦前卵泡、小的或中等大小的窦状卵泡收回的具有粘附的卵丘细胞的卵母细胞和/或未成熟卵母细胞，小的人类窦状卵泡直径0.4-＜5mm，中等大小的人类窦状卵泡是5-＜15mm，而大的人类窦状卵泡直径在15mm或以上。
71.根据前述权利要求中任一项的用途，其中生殖腺细胞是在培养来自原始卵泡期至窦前期间阶段的至少一个未成熟卵泡之后获得的未成熟或成熟的卵母细胞。
全文摘要
本申请涉及通过施用能够抑制固醇从头生物合成的化合物并由此建立改善细胞发育和存活的细胞条件，提高至少一个哺乳动物生殖细胞、配子、受精卵、早期胚胎、植入的胚泡和/或胚胎的发育能力的方法。本发明也涉及在受精前提高至少一个哺乳动物卵巢、卵母细胞、雌配子或者卵母细胞周围的卵巢来源细胞的固醇外流的方法，该方法通过施用能够促进固醇外流的化合物并由此降低所述细胞的磷脂/固醇比来实现。
文档编号A61K31/225GK1620499SQ02828079
公开日2005年5月25日 申请日期2002年12月20日 优先权日2001年12月21日
发明者M·巴尔特森 申请人:哥本哈根大学医院