专利名称：一种可增强基因枪接种dna疫苗诱生细胞免疫应答的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种可增强基因枪接种DNA疫苗诱生的细胞免疫应答的新方法，及其用途。
背景技术：
DNA疫苗(DNA vaccine)又称基因疫苗(Gene vaccine)，其本质为将外源性蛋白编码基因片段克隆在真核质粒DNA表达载体上，直接接种后可在细胞内表达外源性蛋白并诱发机体产生特异性细胞和体液免疫从而达到预防和治疗疾病的目的。由于它可克服传统疫苗的部分缺陷、能同时诱发机体产生特异性细胞及体液免疫，并具有制备简单，性质稳定等优点，因而被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程疫苗亚单位疫苗之后的第三代疫苗，为未来疫苗的一个发展方向，近年来得到了广泛关注和深入研究。有研究报道，DNA疫苗在不同动物中诱生免疫应答的强度存在明显的差异，在小鼠模型中效果较为肯定，在大动物(如灵长目动物)和人体中免疫效果则不理想。研究DNA疫苗在不同种动物差异的机制及如何使DNA疫苗在大动物、人体内更有效已成为各国科学家研究的热点。
已知，增强DNA疫苗免疫效率的策略主要包括筛选高免疫原性表位或使用多价表位，优化表达载体、DNA疫苗的靶向导入、使用佐剂、寻找最佳接种方式等。其中DNA疫苗接种的方式对其诱生的免疫应答效果有着重要的影响。DNA疫苗接种方式按途径可分为肌肉接种，皮肤接种与粘膜接种；按DNA的处理形式可分为包裹金颗粒-基因枪轰击，盐水溶解-注射器注射以及减毒沙门/志贺菌或腺病毒等为载体口服或吸入等接种方式。
基因枪接种DNA疫苗是将质粒DNA包裹于金颗粒上，利用高压惰性气体的冲击将金颗粒直接轰入细胞内，因此它比注射器接种法有更高的转染效率。基因枪接种只需注射器接种DNA用量的1/100～1/1000即可诱生相当水平的抗体应答(Fynan EF et al.Proc Natl AcadSci USA，1993；9011478-82)。有鉴于此，一般认为基因枪接种方式能克服肌注接种DNA疫苗在大动物和人体中的低效，目前DNA疫苗在人体中的实验已采用基因枪接种的方法。
有研究表明基因枪接种DNA疫苗诱生的免疫应答类型以Th2型为主而Th1型免疫应答的水平极弱，而以注射器肌注或皮内注射则主要诱生Th1型免疫应答，(Pertmer TM et al.J Virol 1996；706119-25；Feltquate DM et al.J Immunol，1997；1582278-84)。而Th1型免疫应答在清除病毒持续性感染、抗胞内菌感染和抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，基因枪接种相应DNA疫苗诱生低水平Th1型免疫应答成为其应用的障碍。
“CpG结构”(CpG motif)为Krieg AM等提出的概念(Krieg AM，et al.Nature.1995，3746522546-549)即一些中间为未甲基化的CpG二核苷酸、两侧分别为两个嘌呤(5’侧)和两个嘧啶(3’侧)的特定寡核苷酸序列，如5’-AACGTT-3’、5’-GACGTC-3’、5’-AGCGCT-3’等。大量体外研究已发现，该特定结构对哺乳动物棉衣系统具有激活作用，能刺激Mφ，DC，NK，T及B淋巴细胞，并使之分泌IL-2、IL-6、IL-12及IFN-γ等，使免疫反应向Th1型转变(Stacey KJ，et al.J Immunol.1996，15752116-2122；Sparwasser T，et al.Eur J Immunol.1998，2862045-2054；Yamamoto S，et al.Jpn J Cancer Res.1998，797866-873；Bendigs S，et al.Eur J Immunol.1999，29(4)1209-1218)。Sato等(Sato Y，et al.Science.1996，2735273352-354)发现，卡那霉素抗性基因中不含有在氨苄青霉素抗性基因中存在的CpG结构，相应载体的免疫原性较弱，由此推测载体骨架中的CpG结构的存在与否决定了DNA疫苗的免疫原性。他们进一步在含有卡那抗性基因的载体中插入CpG结构发现可提高该载体的免疫效果。袁正宏等(中国专利公开号CN 1382492A)公开了在DNA疫苗载体中插入对人免疫系统有特异性刺激活性的CpG motifs能增强其特异性免疫原性。Weeratna等报道了接种蛋白疫苗HBsAg时使用CpG ODN作为佐剂比福氏不完全佐剂(FIA)和Titermax Gold等更强的诱生免疫应答而毒性更小，而且当CpG ODN与TH2型佐剂混合使用时能克服它们的TH2型佐剂的偏向。
基因枪接种DNA用量仅为注射器接种用量的1/100乃至更少，前者含有的CpG motif的量也仅为后者的1/100乃至更少。这可能是导致基因枪接种DNA疫苗免疫应答为Th2型偏向的原因之一。目前尚无增强基因枪接种DNA疫苗佐剂的新方法。
有报道CpG的识别受体Toll样受体9(TLR9)位于细胞内，CpG-ODN需要入胞才能激活下游信号转导(Ahmad-Nejad P et al.EurJ Immunol，2002；321958-68)。倘若用注射器于轰击局部接种CpG-ODN则主要位于细胞外，尚需胞吞/胞饮等过程进入细胞内。在CpG-ODN与质粒DNA混合后用注射器接种的情形中，Weeratna等报道(Weeratna R et al.Antisense Nucleic Acid Drug Dev1998；8351-6)ODN与质粒DNA可能会互相竞争入胞受体，因而既可能导致表达的抗原量减少又可能使CpG作用受到抑制。
另外，CpG-ODN在基因枪接种DNA疫苗中的作用，也会因CpG-ODN与质粒DNA的比例不同而受影响。已有研究使用CpG-ODN与质粒DNA比例为50μg/1μg，但大量的CpG可强烈刺激细胞因子分泌而导致质粒中抗原基因表达受到抑制(Tan Y et al.Hum Gene Ther1999；102153-61)。
发明内容
本发明的目的是提供一种可增强基因枪接种DNA疫苗诱生的细胞免疫应答的新方法，一种能增强基因枪接种DNA疫苗诱生Th1免疫应答的方法，及其实际用途。
本发明是能增强基因枪接种DNA疫苗诱生Th1免疫应答的佐剂策略。
本发明的技术方案是在基因枪接种质粒DNA疫苗的同时导入一定比例的免疫刺激元件即合成的寡核苷酸CpG DNA(CpG ODN)作为佐剂。将质粒DNA与寡核苷酸CpG DNA共同包裹于金颗粒表面，利用高压惰性气体轰击，将其直接导入表皮层细胞内。
所述的CpG-ODN与质粒DNA比例为1∶1至10∶1。
为评价本发明即佐剂策略的效果，采用基因枪接种表达HBsAg的质粒DNA疫苗pYQF-2CpG/HBs加CpG ODN和小鼠体内免疫实验，验证了加用CpG ODN佐剂后的特异性的体液免疫(检测血清中抗HBsAg)和细胞免疫(抗原特异性的IFN-γ分泌能力和CTL活性)。结果表明，1)本发明在基因枪接种DNA疫苗的同时加用CpG ODN增加CpG motif的量能增强其诱生Th1型免疫应答水平。2)将CpG-ODN与质粒DNA共同沉淀在金颗粒上然后以基因枪轰击导入的方式比基因枪接种质粒DNA的同时局部用注射器接种CpG-ODN的方式或者CpG-ODN与质粒DNA混合后用注射器接种的方式效果好，本发明方法可使其直接进入细胞内，因而更容易激活下游信号转导，并避免了ODN与质粒DNA对入胞受体的竞争。
本发明通过下述方法和步骤实现本发明采用质粒pYQF/s-2CpG(CN 1382492A)，带有CMV启动子，含有BGH转录终止信号及卡那霉素抗性基因。在多克隆位点插入HBVs蛋白基因，并在框架上插入了两个合成的CpG结构(上海生工公司)。质粒用Qiagen Plasmid Maxi Kit大量制备、纯化，溶于生理盐水。所述CpG-ODN序列为5’-TCAAAACGTTGATG-3’，GpC-ODN对照序列为5’-TCAAAAGCTTGATG-3’。
本发明基因枪子弹采用亚精胺—氯化钙包裹法将DNA包裹在直径为1.0μm的金粉上(购自美国Bio-rad公司)。将质粒DNA与ODN混合，重量比可控制在5-10∶1或1∶1，或者质粒DNA单独溶于ddH2O，加入到含金颗粒的亚精胺中混匀，再加入CaCl2使DNA沉淀于金颗粒上。乙醇洗涤后，加入无水乙醇混匀，将金颗粒-DNA乙醇溶液吸到基因枪塑料管中，空气干燥制成子弹。
取6周龄BALB/c雌鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)动物免疫，分组，基因枪接种；肌注接种；皮内接种，初次免疫后4周加强免疫，方法同前。
观察基因枪轰击后3小时或轰击后立即皮肤活检标本其金颗粒的分布。
检测免疫后抗HBsAg抗体及亚类，ELISA法检测静脉血清其中抗体IgG及亚类IgG1、IgG2a，间接法ELISA检测IgG总血清滴度。
检测免疫后细胞免疫功能，采用IFN-γELISA定量检测试剂盒(购自上海茂元科技有限公司)检测IFN-γ水平。进行Calcein荧光标记CTL杀伤实验，荧光测量仪检测荧光值。按下述公式计算杀伤率和特异性杀伤率，杀伤率＝(试验组的FI-自发释放的FI)/(阳性对照的FI-自发释放的FI)×100％。
特异性杀伤率为P815-s的值减去P815的值。
经方差分析和t检验统计处理，结果证实本发明基因枪轰击可使包裹DNA的金颗粒直接进入上皮层细胞内，在小鼠体内证实基因枪接种质粒DNA疫苗的同时共同导入CpG ODN/质粒DNA比例为5-10/1的CpG ODN的佐剂策略能增强基因枪接种DNA疫苗的Th1型免疫应答水平，包括总IgG，IgG2a，特异性CTL活性，抗原特异的IFN-γ产生能力。本发明方法有利于克服基因枪接种DNA疫苗产生Th1型免疫应答水平低下的缺陷，是一种人体应用基因枪接种DNA疫苗时有潜力的佐剂策略。
图1为本发明实施实例所用DNA疫苗pYQF-CpG/HBs质粒载体示意图及全硫代修饰CpG-ODN与GpC-ODN对照序列。
图2为基因枪轰击后金颗粒在皮肤组织的分布其中，a、组织切片H&E染色光镜观察(放大240倍)；b、透射电镜观察(放大2850倍)。
图3为基因枪轰击后金颗粒在细胞的位置
其中，a、放大6500倍；b、放大11000倍。
图4为免疫接种后抗HBs抗体应答反应其中，a.ELISA检测免疫后8周血清(1∶100)中IgG、IgG1和IgG2a；b.免疫后小鼠IgG抗体滴度水平。
图5为免疫接种后HBsAg特异性细胞免疫反应其中，a、加强免疫后四周HBsAg特异性CTL反应。b、免疫接种后小鼠脾细胞经HBsAg体外刺激IFN-γ释放水平(pg/ml)。
具体实施例方式
实施例1采用亚精胺—氯化钙包裹法将DNA包裹在直径为1.0μm的金粉上，制备基因枪子弹。将10μg质粒DNA与100μg或10μg ODN，重量比可控制在5-10∶1或1∶1，混合或者10μg质粒DNA单独溶于100μl ddH2O，加入到含5mg金颗粒的100μl 0.1M亚精胺中混匀，再加入200μl 2.5M CaCl2使DNA沉淀于金颗粒上。乙醇充分洗涤后，加入100μl无水乙醇混匀，每10μl为一颗子弹。将金颗粒-DNA乙醇溶液吸到基因枪专用塑料管中，空气干燥后即制成子弹。其中，每颗子弹携有0.5mg金颗粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)，10μg ODN(2.2×10-3μmol)；或0.5mg金颗粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)，1μg ODN(2.2×10-4μmol)；或0.5mg金颗粒，1μg DNA(8.34×10-7μmol)。
取6周龄BALB/c雌鼠动物免疫，随机分为九组，每组6只小鼠。1)基因枪接种腹皮毛剃净，用基因枪(新芝科技有限公司)以2.5MPa的压力轰击将金颗粒-DNA或金颗粒-DNA-CpG ODN导入小鼠腹部皮肤，局部可见2cm2左右的轰击范围。2)肌注接种戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉后，用100u胰岛素注射器于双侧胫前肌进针，缓慢注入质粒DNA生理盐水溶液，每侧25μg/50ul。)皮内接种小鼠背尾端皮毛剃净，戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉后，用100u胰岛素注射器与脊柱平行进针皮肤，皮内可见鼓起皮丘。初次免疫后4周，用上述方法加强免疫，表1为实验分组、免疫方式与接种材料。
表1组别 接种方靶位接种材料A 基因枪皮内、腹部皮肤1μg质粒+1μg CpG-B 基因枪皮内、腹部皮肤1μg质粒+1μgC 基因枪皮内、腹部皮肤1μg质粒+10μgD 基因枪皮内、腹部皮肤1μg质粒+10μgE 基因枪皮内、腹部皮肤1μg质粒F 注射器肌注小腿胫外侧1μg质粒G 注射器肌注小腿胫外侧50μg质粒H 注射器皮内、背部皮肤50μg质粒I 注射器肌注小腿胫外侧生理盐水其中，每组6只BALB/c小鼠。质粒DNA为PYQF-2CpG。1μg质粒DNA含8.34×10-7mol分子；50μg质粒DNA含4.17×10-5μmol分子；1μg ODN DNA含2.2×10-4μmol分子；10μg ODN DNA含2.2×10-3μmol分子。
观察基因枪轰击后金颗粒的分布轰击后3小时局部皮肤活检取材，10％福尔马林固定，石蜡包埋，组织切片(6μm)，H&E染色，光镜放大240倍下拍照。或轰击后立即活检取材制备成电镜标本，超薄切片(70-90nm)，uranyl acetate和lead citrate染色，透射电镜观察。
图2、图3显示了基因枪轰击后包裹DNA的金颗粒在组织细胞中的位置。结果表明，组织切片H&E染色光镜观察及透射电镜显示金颗粒主要位于上皮层内，少数可深入到真皮的上层。金颗粒位于胞浆或直接进入了胞核，金颗粒周围无明显膜样结构，表明金颗粒是由高压惰性气体的轰击直接进入而非通过胞吞等过程进入到细胞内。
免疫后抗HBsAg抗体及亚类检测免疫日始每隔2周从小鼠眼眶后眦静脉丛采血，分离血清，ELISA法检测其中抗体IgG及亚类IgG1、IgG2a。将每组内各小鼠血清等量混匀，作梯度稀释，间接法ELISA检测IgG总血清滴度。图4显示了免疫接种后HBsAg特异性体液免疫水平。其中E组为基因枪接种1μg质粒DNA(8.34×10-7μmol)的IgG2a水平为0.396±0.287远低于注射器肌肉或皮内接种50μg质粒DNA(4.17×10-5μmol)(G组2.915±0.117和H组2.269±0.307)。基因枪接种加入1或10μg对照GpC-ODN并不能增加IgG2a水平(B组0.29±0.153和D组0.354±0.184)。而基因枪接种加入CpG-ODN则能增加抗-HBs IgG2a水平(A组0.541±0.234和C组1.545±0.111)，其中C组为加用10μg CpG-ODN(2.2×10-3μmol)比E组的增高有统计显著差异(p＜0.01)。加用CpG-ODN后抗-HBsAg总IgG也有所增强。监测HBsAg-特异性抗体滴度，加强免疫后，C组IgG应答反应比A组或E组要更快早更强。接种后第14周，A组、C组、E组、G组及H组HBsAg特异性的IgG抗体滴度分别为1∶2400，1∶4800，1∶2400，1∶4800，1∶4800。
检测免疫后细胞免疫功能每组随机挑取2只小鼠，处死，无菌取脾脏，制成单细胞悬液。调整浓度为4×106/ml，备检测细胞因子及CTL活性用。IFN-γ检测为加HBsAg 10μg/ml，培养48小时收集上清，采用IFN-γ ELISA定量检测试剂盒(购自上海茂元科技有限公司)检测IFN-γ水平。Calcein荧光标记CTL杀伤实验以70 Gy的γ射线灭活对数生长期P815-s细胞制成刺激细胞。在脾细胞中加入刺激细胞，比例为20∶1，培养6天，加mIL-225u/ml维持。用Ficoll分离液纯化刺激后效应细胞，以无酚红培养液重悬。以5~10uMcalcein AM(购自美国Molecular Probe公司)37℃水浴标记对数生长期P815-s，P815细胞，D-Hank’s液洗后以无酚红培养液重悬制成标记靶细胞。在96孔圆底培养板中按效/靶比例50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀释效应细胞与标记好的靶细胞。设完全释放组其中加细胞裂解液，与自发释放组其中加无酚红培养液，孵育4.5小时后离心，将上清移入新板孔中，荧光测量仪检测荧光值。按下述公式计算杀伤率和特异性杀伤率，
杀伤率＝(试验组的FI-自发释放的FI)/(阳性对照的FI-自发释放的FI)×100％。
特异性杀伤率为P815-s的值减去P815的值。
图5显示了免疫接种后HBsAg特异性细胞免疫水平。其中注射器肌肉或皮内接种50μg质粒DNA的G组和H组有较高水平的CTL活性，基因枪接种1μg质粒DNA的E组或加入对照GpC-ODN的B组和D组CTL活性都很低。而基因枪接种加用10μg CpG-ODN的C组其CTL活性明显提高。效/靶比为50/1时，A组、B组、C组、D组、E组、G组、H组和I组分别是7.89％，3.44％，21.84％，4.17％，4.02％，31.47％，33.15％和4.14％。
免疫后8周小鼠脾细胞在HBsAg刺激后IFN-γ的释放能力检测结果表明，E组抗原特异性IFN-γ释放水平仅为236.4pg/ml。而G组和H组分别为2609.1pg/ml和1878.5pg/ml。加用GC-ODN的B组和D组IFN-γ水平没有增高甚至反而有所下降，分别为95.0pg/ml和159pg/ml。而基因枪接种加用10μg CpG-ODN的C组其IFN-γ水平大大增高，为1046.2pg/ml。但仅加用1ug CpG-ODN的A组其IFN-γ水平为258.1pg/ml，比E组没有明显升高。
权利要求
1.一种可增强基因枪接种DNA疫苗诱生细胞免疫应答的方法，其特征是在基因枪接种质粒DNA疫苗的同时，导入免疫刺激元件作为佐剂，其比例为1∶1-10，将质粒DNA与免疫刺激元件包裹于金颗粒表面，用高压惰性气体轰击，直接导入表皮层细胞内。
2.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的免疫刺激元件是合成的寡核苷酸CpG-ODN。
3.按权利要求1和2所述的方法，其特征是所述的CpG-ODN与质粒DNA疫苗比例为1∶1。
4.按权利要求1和2所述的方法，其特征是所述的CpG-ODN与质粒DNA疫苗比例为1∶10。
5.按权利要求1和2所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸CpG ODN在用于基因枪接种DNA疫苗时作为佐剂。
6.按权利要求1和2所述的方法，其特征是所述的细胞免疫应答是Th1型免疫应答，包括总IgG，IgG2a，特异性CTL活性和抗原特异的IFN-γ产生能力。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，提供了一种可增强基因枪接种DNA疫苗诱生的Th1型免疫应答的方法，本发明也涉及制备质粒DNA－CpG寡聚核苷酸包裹金颗粒的方法。本发明在基因枪接种质粒DNA疫苗的同时共导入一定比例的合成的寡核苷酸CpG DNA(CpG ODN)作为佐剂。动物免疫实验证实本发明能增强基因枪接种DNA疫苗的Th1型免疫应答水平，包括总IgG，IgG2a，特异性CTL活性，抗原特异的IFN－γ产生能力。本发明有利于克服基因枪接种DNA疫苗诱生低水平Th1型免疫应答的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的治疗。
文档编号A61K48/00GK1513559SQ03142099
公开日2004年7月21日 申请日期2003年8月6日 优先权日2003年8月6日
发明者袁正宏, 周晓辉 申请人:复旦大学, 上海复旦悦达生物技术有限公司