专利名称：松杉灵芝蛋白多糖混合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白多糖混合物及其制备方法与应用，特别是涉及从松杉灵芝(Ganoderma tsugae Murrill.)中得到的一种蛋白多糖混合物及其提取方法和该蛋白多糖混合物作为注射或口服药物活性成分的应用。
背景技术：
目前临床上治疗肿瘤疾病，主要采用三种方式手术、放疗和化疗，但放疗、化疗严重杀伤人体正常细胞和组织，使许多患者体质迅速下降，甚至不能持续治疗。长期以来，人们在不断寻找新的毒性小、抑瘤率高的抗癌药物，并取得了一定的成效。由于肿瘤的发生和扩散与人体的免疫功能有密切关系，因此产生了肿瘤免疫治疗法。二十世纪中后期，发现了一些来源于真菌类的多糖药物，如云芝多糖、香菇多糖、裂褶菌多糖等，它们均具有提高机体免疫力及抗肿瘤的作用。这些药物的作用机制一方面是通过宿主中介，激活机体的各种免疫活性细胞，促进各种淋巴因子的分泌，提高机体的抵抗力，达到吞噬和消除肿瘤细胞的作用，另一方面某些多糖，特别是蛋白-多糖对癌细胞有直接杀伤作用，其特点是有效剂量小，抑瘤率高，毒性很小，甚至无毒，与化疗药物共同使用还可以降低化疗药物的毒副作用。与化疗相比，免疫疗法没有白血球降低，呕吐，免疫力下降等毒副作用。
松杉灵芝(Gamoderma tsugae Murrill.)是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属的一种真菌，具有悠久的民间用药历史，药理活性广泛，且毒性极小。子实体为其地上部分，包括菌盖和菌柄，一起入药，松杉灵芝子实体的化学成分复杂，有三萜类，核苷类，生物碱类，呋喃类，氨基酸类及微量元素等等。水溶性成分主要有多糖类，糖-蛋白类，蛋白-多糖类等等。研究表明，多糖及糖-蛋白或蛋白-多糖类复合物具有提高机体免疫功能和抗癌作用。由于多糖的来源不同，分子量大小及空间三维螺旋结构不同，特别是与蛋白质结合方式不同，在药理活性方面，表现出较大差异。MIZUNO等人从赤芝子实体中获得分子量为100万和45万两种水溶性多糖，经小鼠腹腔注射给药，以S180瘤株做实验，具有显著的抑瘤作用。李荣芷，何云庆等从赤芝中获得分子量分别为16200，24500，35000，和40000四种多糖，该四种多糖均能显著增加正常小鼠脾细胞IL-2的产生。北京医科大学药学院分离出的分子量为7100-9300的灵芝多糖能促进TNFα、TNFγ mRNA的表达，增加TNFα、TNFγ mRNA的分泌等等。目前对赤芝(Ganoderma Lucidum)和紫芝(Ganoderma Sinersis)的研究比较多。对松杉灵芝(Ganoderma tsugae Murrill.)的研究却罕见报道，其中仅有2003年台湾国际扬名大学在美国申报了名称为《Polysaccharide-based extract fromganoderma，pharmaceutical use thereof，and process for preparing the same》的专利，公开了一种获得松杉灵芝水溶性粗提物的工艺，但该工艺只是涉及到水提醇沉和脱蛋白等步骤，得到的产品是松杉灵芝的初级粗制品。
发明内容
本发明的目的是提供一种松杉灵芝蛋白多糖混合物及其制备方法和以该松杉灵芝蛋白多糖混合物为注射、口服或外用治疗肿瘤药物的活性成分。
本发明所提供的松杉灵芝蛋白多糖混合物的分子量为6000-12000道尔顿，是用包括以下步骤的方法得到的1)松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；2)药渣用去离子水提取，收集提取液；3)将提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后进行微滤；5)滤液经过50-80KD(5万-8万道尔顿)的超滤膜后所得滤液用3-5KD膜超滤，膜上的截留物为上柱精制前粗品。
6)为了得到精产品，超滤后，最后截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱液，经3-5KD膜，浓缩冷冻干燥得到蛋白多糖混合物精制品。在该精制过程中，如果采用DEAE-Sepharose(F.F.)层析柱进行层析，一般选用3×80cm规格的层析柱，上样速度应为0.2-0.5ml/min，用去离子水洗脱的速度应为2-4ml/min，如果采用SepharoseCL-6B层析柱进行层析，一般选用3×70cm规格的层析柱，上样速度应为0.2-0.8ml/min，用去离子水洗脱的速度应为1-2ml/min，如果采用DEAE-Cellulose(Cl-)层析柱进行层析，一般选用3×75cm规格的层析柱，上样速度应为0.25ml/min，用去离子水作流动相洗脱柱子的速度应为2-4ml/min。
在提取松杉灵芝蛋白多糖混合物的过程中，所述用于松杉灵芝子实体脱脂的醇为75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量为所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的6-12倍(8-10倍最好)，脱脂在70-80℃条件下进行，回流提取2-3小时，重复3-6次；所述药渣用去离子水提取，收集提取液中，去离子水的重量是所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的10-30倍(15-25倍最好)，于90-100℃(98-100℃最好)，间歇搅拌，提取2-3小时，重复3-7次，提取液浓缩至所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的7-12倍；所述将提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇使其终浓度达到75-85％，边加边搅拌，在4-10℃低温下放置，离心(8000rpm，15min)得到沉淀；所述微滤进行至少二次，滤膜的孔径第一次为10μm，如果进行二次，滤膜的孔径分别是10μm、3μm为宜，如果进行三次，滤膜的孔径分别是10μm、5μm和1μm为宜。
实验证明，以本发明的方法制备的松杉灵芝蛋白多糖混合物为活性成分的药物具有明显的抑制肿瘤的作用以及提高免疫功能作用。
本发明的药物一般制成粉针剂，也可以制成注射液、片剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
以本发明的方法制备的松杉灵芝蛋白多糖混合物是一种奶白色或黄白色的片状物，质轻，易溶于水，纯度高，粘度较小，易于选用各种剂型，给药方便。
实验表明，本发明的药物抑瘤率高，毒性极小，经动物整体实验研究表明，急性毒理LD50未测出，测得最大(注射给药)耐受量125mg/kg(小鼠)，基本无毒，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式
实施例1、制备松杉灵芝蛋白-多糖混合物称取松杉灵芝子实体粉100克，加80％乙醇1升，75-78℃加热回流2小时，重复3次，过滤，向药渣中加去离子水2升，加热煮沸，间隔搅拌，每次提取3小时，重复5次，过滤，合并提取液，浓缩至体积为0.5-1升，冷至室温，加无水乙醇2.5升，边加边搅拌，4℃放置澄清，离心(7000-8000rpm，15min)，取沉淀加水溶解后，10μm和1μm微滤，取滤液，然后超滤过80KD，取滤液，再用3KD膜进行超滤，所得截留物浓缩，冷冻干燥，获得松杉灵芝蛋白-多糖混合物。
实施例2、制备松杉灵芝蛋白-多糖混合物称取松杉灵芝子实体粉100克，加80％甲醇1.5升，80℃加热回流3小时，重复5次，过滤，向药渣中加去离子水4升，加热煮沸，间隔搅拌，每次提取3小时，重复6次，过滤，合并滤液，浓缩至体积1升，冷却，加无水甲醇4升，边加边搅拌，4℃放置澄清，离心(7000-8000rpm，15min)，沉淀溶入水，经10μm、5μm和1μm微滤，取滤液经过超滤膜80KD，取滤液，再用3KD膜进行超滤，所得截留物浓缩，冷冻干燥，获得松杉灵芝蛋白-多糖混合物。
实施例3、制备松杉灵芝蛋白-多糖混合物称取50kg松杉灵芝子实体碎粉于提取罐中，加入450升90％乙醇，搅拌下，于78℃回流提取，每次2小时，重复3次，回收乙醇，药渣加水1000升，加热至100℃，提取3小时，重复5次，过滤，滤液合并，浓缩至体积为250升，在搅拌下，加入5倍体积无水乙醇，置4℃低温处，澄清，离心(7000-8000rpm，15min)，沉淀用去离子水溶解，通过10μm微滤、1μm微滤，然后再经过80KD超滤之后，用3KD膜浓缩，冷冻干燥得松杉灵芝蛋白-多糖混合物。
实施例4、制备松杉灵芝蛋白-多糖混合物精品将实施例1中得到的松杉灵芝蛋白-多糖混合物溶于去离子水后，上已平衡好的DEAE-Cellulose(Cl-)柱(3×75cm)，上样流速为0.25ml/min，然后用去离子水作流动相洗脱柱子，洗脱速度4ml/min，收集流出液，以紫外检测器检测，用记录仪记录流出曲线，流出液通过3KD膜，浓缩后冷冻干燥，得松杉灵芝蛋白-多糖混合物。
实施例5、制备松杉灵芝蛋白-多糖混合物精品将实施例3中得到的松杉灵芝蛋白-多糖混合物溶于去离子水后，上已平衡好的Sepharose-CL6B柱(3×70cm)，上样流速为0.6ml/min，然后用去离子水作流动相洗脱柱子，洗脱速度1.5ml/min，收集流出液，以紫外检测器检测，用记录仪记录流出曲线，流出液通过3KD膜，浓缩后冷冻干燥，得松杉灵芝蛋白-多糖混合物。
实施例6、抑瘤作用实验以不同的癌细胞为实验对象，以环磷酰胺为阳性对照，以生理盐水为阴性对照，研究本发明实施例1～5得到的松杉灵芝蛋白-多糖混合物对癌细胞的抑制作用，其中抑瘤率的计算方法为 实验结果如表1和表2所示，表明松杉灵芝蛋白-多糖混合物对小鼠S180肉瘤、小鼠肝癌H22和小鼠Lewis肺癌的生长均有不同程度的抑制作用对移植于裸鼠的人体肠癌LOVO、胃癌MKN45、肝癌QGY见瘤后开始给药，均具有明显的抗肿瘤作用，量效关系明显。
表1、松杉灵芝蛋白-多糖混合物对鼠的肿瘤生长的抑制作用 表2、松杉灵芝蛋白-多糖混合物对移植于裸鼠的人体肿瘤生长的抑制作用
实施例7、松杉灵芝蛋白-多糖混合物的增效作用松杉灵芝蛋白-多糖混合物(1、0.3mg/kg)合并小剂量环磷酰胺(20mg/kg)、甲氨喋呤(2mg/kg)和丝裂霉素C(1mg/kg)后，对小鼠肝癌H22的抑制作用明显强于松杉灵芝蛋白-多糖混合物粉针剂或小剂量化疗药物单独使用。按照Webb氏分数乘积法计算证明松杉灵芝蛋白-多糖混合物粉针剂与上述药物有协同作用。根据以下公式计算抑瘤率
合并用药的效应根据Webb氏分数乘积法计算(fa)1，2＝1-[1-(fa)1][1-(fa)2](fa)1和(fa)2分别为两药的抑瘤率，(fa)1，2为计算的理论相加效应。如果合并用药的效应大于理论相加效应，则表示协同。
试验结果如表3所示，证明小剂量松杉灵芝蛋白-多糖混合物粉针剂合并小剂量化疗对小鼠肝癌H22有一定的协同作用，同时与放疗合并，抑瘤作用也明显强于单独放疗。
表3 松杉灵芝蛋白-多糖混合物合并CTX、MTX、MMC对小鼠肝癌H22的作用
与生理盐水组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例8、松杉灵芝蛋白-多糖混合物对免疫功能的增强作用1、松杉灵芝蛋白-多糖混合物对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的增强作用以云芝糖肽为阳性对照，研究松杉灵芝蛋白-多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的增强作用，结果如表4所示，表明松杉灵芝蛋白-多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖具有较强的增强作用。
表4.松杉灵芝蛋白-多糖混合物对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
与荷瘤组比较**P＜0.01。
2、松杉灵芝蛋白-多糖混合物能明显激活小鼠NK细胞活性。
靶细胞的标记取传代后24小时生长良好的YAC-1细胞，按1×106个/ml细胞悬液加3H-TdR 10uci，于37℃，5％CO2培养箱中培养2小时，每30分钟振荡一次，标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1×102/ml。
NK细胞活性测定C57BL/6小鼠36只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞，随机分为6组，每组6只，即松杉灵芝蛋白-多糖混合物，云芝糖肽胶囊500mg/kg(po×7)，荷瘤对照组(生理盐水对照组)，另设一组正常对照组。给药结束后次日处死动物，无菌条件下取脾，制备脾细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml作效应细胞，另取已培养24小时YAC-1细胞，调整细胞浓度为1×104个/ml作为靶细胞，以靶细胞与效应细胞之比为1∶100的细胞加在96孔细胞培养板上，加入3H-TdR 0.5uci/孔，每只动物设双复孔，37℃，5％CO2条件下培养24小时后，收集细胞，测CPM值，计算特异性抑制百分率(Pi)表示NK细胞活性。结果如表5所示，表明松杉灵芝蛋白-多糖能明显激活小鼠NK细胞活性。
表5.松杉灵芝蛋白-多糖混合物对荷瘤小鼠NK活性的影响
与生理盐水组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2、松杉灵芝蛋白-多糖混合物促进荷瘤小鼠IL-2的产生C57BL/6小鼠24只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞，随机分为4组，每组6只，即松杉灵芝蛋白-多糖，云芝糖肽胶囊，荷瘤对照组(生理盐水对照组)，正常对照组。给药结束后次日处死动物，测定IL-2的产生情况，结果如表6所示，表明松杉灵芝蛋白-多糖能够促进IL-2的产生，同时对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能也有明显的促进作用。
表6.松杉灵芝蛋白-多糖混合物对荷瘤小鼠产生IL-2的影响
权利要求
1.一种松杉灵芝蛋白多糖混合物，是分子量为6000-1.2万道尔顿，用包括以下步骤的方法得到的物质1)松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；2)药渣用去离子水提取，收集提取液；3)将提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后进行微滤；5)滤液经过50-80KD的超滤膜后所得滤液用3-5KD膜超滤，膜上的截留物为产品。
2.根据权利要求1所述的混合物，其特征在于所述超滤后，截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱液，经3-5KD膜，浓缩冷冻干燥得到产品。
3.根据权利要求1或2所述的混合物，其特征在于所述用于松杉灵芝子实体脱脂的醇为75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量为所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的6-12倍，脱脂在75-80℃条件下进行，回流提取；所述药渣用去离子水提取，收集提取液中，去离子水的重量是所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的10-30倍，于90-100℃，间歇搅拌提取，浓缩提取液；将所述提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇，使其终浓度达到75-85％，离心得到沉淀；所述微滤的滤膜孔径10μm和10μm。
4.一种制备松杉灵芝蛋白多糖混合物的方法，包括以下步骤1)松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；2)药渣用去离子水提取，收集提取液；3)将提取液用醇沉淀；4)沉淀物用去离子水溶解后进行微滤；5)滤液经过50-80KD的超滤膜后所得滤液用3-5KD膜超滤，膜上的截留物为产品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述超滤后，截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱液，经3-5KD膜，浓缩冷冻干燥得到产品。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述用于松杉灵芝子实体脱脂的醇为75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量为所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的6-12倍，脱脂在75-80℃条件下进行，回流提取2-3小时，重复3-6次。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述药渣用去离子水提取，收集提取液中，去离子水的重量是所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的10-30倍，于90-100℃，间歇搅拌，提取2-3小时，重复3-7次，提取液浓缩至所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的7-12倍；所述将提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇，使其终浓度达到75-85％，边加边搅拌，在低温下放置，离心得到沉淀；所述微滤进行至少二次，滤膜的孔径第一次为10μm，第二次为10μm。
8.一种抗肿瘤及增强免疫力的药物，它的活性成分是分子量为6000-1.2万道尔顿，用包括以下步骤的方法得到的物质1)松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；2)药渣用去离子水提取，收集提取液；3)将提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后进行微滤；5)滤液经过50-80KD的超滤膜后所得滤液用3-5KD膜超滤，膜上的截留物为产品。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于所述超滤后，截留物上DEAE-Sepharose(F.F.)、SepharoseCL-6B或DEAE-Cellulose(Cl-)层析柱，用去离子水洗脱，收集洗脱液，经3-5KD膜，浓缩冷冻干燥得到产品；所述用于松杉灵芝子实体脱脂的醇为75-95％的乙醇或甲醇，乙醇或甲醇的重量为所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的6-12倍，脱脂在75-80℃条件下进行，回流提取；所述药渣用去离子水提取，收集提取液中，去离子水的重量是所述松杉灵芝子实体粉碎物重量的10-30倍，于90-100℃，间歇搅拌提取，浓缩提取液；将所述提取液用醇沉淀，是向提取液中加入乙醇或甲醇，使其终浓度达到75-85％，离心得到沉淀；所述微滤的滤膜孔径10μm和10μm。
10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于所述药物为注射剂、口服剂或外用剂型。
全文摘要
本发明公开了松杉灵芝蛋白多糖混合物及其制备方法与应用，本发明的松杉灵芝蛋白多糖混合物，是分子量为6000－1.2万道尔顿，用包括以下步骤的方法得到的物质1)松杉灵芝子实体粉碎物用醇脱脂，得到药渣；2)药渣用去离子水提取，收集提取液；3)将提取液用醇沉淀；4)沉淀物用水溶解后进行微滤；5)滤液经过50－80KD的超滤膜后所得滤液用3－5KD膜超滤，膜上的截留物经DEAE－Cellulose层析分离后得蛋白多糖混合物精制品。本发明的松杉灵芝蛋白多糖混合物具有显著的抑制肿瘤和提高机体免疫功能作用，具有广阔的药用价值。
文档编号A61K38/16GK1715293SQ200410050150
公开日2006年1月4日 申请日期2004年6月28日 优先权日2004年6月28日
发明者张洁, 姜大成, 费晓方 申请人:长春中医学院