专利名称：聚乙二醇修饰重组人白介素及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种白介素，具体地说是一种聚乙二醇修饰的白介素。
背景技术：
生物技术的迅速发展，促进了蛋白质(酶)类药物的生产与应用。然而由于外源蛋白质属于天然抗原，具有较强的免疫原性，会引发抗体的产生，还会受到各种蛋白酶的攻击而失去生物活性。还有些药物半衰期过短(尤其是小分子蛋白质)，而无法充分发挥其生物功能。这些已成为制约蛋白质药物发展的关键因素。因此研究人员采用了各种药物传递技术来提高蛋白质药物的疗效，包括采用不同的给药途径(如口服，鼻腔给药，透皮吸收)，不同的载体(如微球，脂质体，红细胞，单克隆抗体)，不同高分子材料(如多糖)修饰，不同药物释放技术(如控释缓释技术，前药)。而研究最为广泛的就是聚乙二醇[Poly(ethylene glycol)，PEG]修饰技术。研究表明，蛋白质药物经PEG修饰后，增加了溶解度和稳定性，减弱或消除了免疫原性、抗原性和毒性，改善了药动学性质，增加了体内的半衰期，增加了治疗指数，扩大了临床应用。修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质的氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。其中，氨基(主要为赖氨酸的ε-氨基及N末端的α-氨基)具有较高的亲核反应性，因而是最常被修饰的基团。[参见Inada Y.Furukawa M，Sasaki H，et al.Biomedical and biotechnological applications ofPEG-and PM-modified proteins.TIBTECH.1995，1386-91；Zalipsky S.Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules.Advanced Drug Delivery Reviews.1995，16157-182；K atre NV.Theconjugation of proteins with polyethylene glycol and other polymersAlteringproperties of proteins to enhance their therapeutic potential.Advanced DrugDelivery Reviews.1993，1091-114；Nucci ML，Shorr R，Abuchowshi A.Thetherapeutic value of poly(ethylene glycol)-modified proteins.Advanced DrugDelivery Reviews.1991，6133-151.]。
重组人白介素-2具有促进T淋巴细胞增殖，激活淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)，促进β-干扰素的产生等功能，对免疫应答的产生和调节有重要作用，是目前免疫疗法中重要的细胞因子，但存在半衰期短，反复注射易引起免疫反应等问题，限制了其临床应用。Knauf等最先对重组人白介素-2的氨基进行了PEG修饰研究[The Journal of Biological Chemistry.1988，263(29)15064-15070.]，表明PEG-IL-2半衰期增加了20倍。定点修饰研究也陆续有报道[R.J.Goodson，et al.Bio/Technology.1990，8(4)343-346.；Haruya Sato，et al.Biochemistry.1996，3513072-13080.]。在临床研究方面，已完成了I期临床[F.J.Meyers，et al.Clin.Pharmcol.Ther.1991，49307-313.]和II期临床[R.M.Bukowski，et al.Invest.New Drugs.1993，11211-217.]，临床研究显示出良好的抗肿瘤活性，无中和抗体的产生，半衰期增加了10-20倍。目前正在进行III期临床[王秀贞等.中国生物工程杂志，2003，23(10)23-27.]。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种聚乙二醇修饰重组人白介素及其制备方法，以满足医药领域发展的需要。
本发明的具体的技术方案如下一种聚乙二醇修饰的重组人白介素，其特征在于，重组人白介素上连接有一条、两条或者两条以上的聚乙二醇链，其结构通式如下PEG-rhIL其中PEG代表聚乙二醇，rhIL代表重组人白介素；优选重组人白介素-2，优选的聚乙二醇修饰的重组人白介素结构通式如下PEG-rhIL-2；
PEG连接在重组人白介素-2的氨基上。
所说的聚乙二醇链的分子量为2000-20000。
本发明的聚乙二醇修饰的重组人白介素的制备方法包括如下步骤将硼砂缓冲液加入重组人白介素溶液，调节其pH值至6.0-9.0，然后加入碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯在0-25℃下进行反应，反应时间不少于15分钟，一般为15～60分钟，将反应混合液用Sephacryl S-200进行色谱分离，流动相为含氯化钠的醋酸缓冲液，色谱分离可得聚乙二醇修饰的重组人白介素；所说的重组人白介素溶液为重量浓度为1mg/ml的水溶液；碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯与重组人白介素的摩尔比为碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯∶重组人白介素＝1∶1～20；上述的Sephacryl S-200为一种凝胶过滤介质；流动相中氯化钠的摩尔浓度为0.25M，醋酸缓冲液的pH值为3.6～5.8；本发明的聚乙二醇修饰的重组人白介素可用于制备抗病毒和抗肿瘤药物。
本发明的聚乙二醇修饰的重组人白介素能够保留较高的抗病毒活性，同时它与未修饰的重组人白介素相比，免疫原性降低，热稳定性和酶稳定性增加，体内半衰期长，血浆清除率低，因此作为抗病毒、抗肿瘤等药物，它比未修饰的重组人白介素有更大的优越性。本发明的聚乙二醇修饰的重组人白介素的制备方法简单易行。
图1为PEG-IL-2反应液及分离产物的SDS-PAGE图(银染)。
具体实施例方式
实施例1碳酸单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(SC-mPEG)的制备称取14.4g单甲氧基聚乙二醇12,000，三光气0.56g，溶于甲苯20ml和二氯甲烷12ml中，逐滴加入无水三乙胺1ml，搅拌反应过夜。
将反应液抽真空，挥去大部分溶剂，将所得残渣重新溶解于甲苯8ml和二氯甲烷10ml中。加入N-羟基琥珀酰亚胺0.21g，取三乙胺0.3ml，用二氯甲烷3ml稀释，逐滴加入反应液中，继续反应完全后，将反应液过滤并抽真空，所得残渣溶解于50℃乙酸乙酯60ml中，过滤，冷却后所得结晶即SC-PEG粗品。将所得产物用乙酸乙酯反复重结晶。测定产品的红外光谱，有如下特征峰1812，1789(C＝O，琥珀酰亚胺)；1742(C＝O，羧基)；1114(CH2OCH2)。测定产品的核磁共振光谱(H-NMR，CDCl3)，有如下特征峰4.35(m，4H，CH2OCO2)；3.55(s，～500H，PEG)；2.74(s，8H，CH2C＝O)。
实施例2SC-PEG对白介素-2的修饰条件的选择反应时间的选择取4支1.5ml Eppendorf管，每管加入白介素-2浓缩液0.5ml(2.0mg/ml)，再加入等体积0.05M的pH值为8.0硼砂缓冲液，混匀后再分别加入6.0mg的SC-PEG，反应15min、30min、1h、2h后终止反应，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，反应15分钟时修饰率较低，大部分白介素-2没有被修饰，反应30分钟时修饰率有所提高，产物以修饰一条的白介素-2为主，反应1小时，高修饰条带增加，反应2小时与反应1小时相比，高修饰条带略有增加。
反应pH值的选择取5支1.5ml Eppendorf管，每管加入白介素-2浓缩液0.5ml(2.0mg/ml)，再加入等体积0.05M的硼砂缓冲液，pH值分别为6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，每支试管分别加入6.0mg的SC-PEG，反应30分钟后终止反应，进行SDS-PAGE电泳。结果表明当pH为6.0时修饰率过低，大部分白介素-2没有被修饰，而pH为9.0时修饰过度，高修饰产物较多，且不均一，不利于保持活性。
实施例3修饰产物的分离纯化与鉴定取2支1.5ml Eppendorf管，每管加入白介素-2浓缩液0.5ml(2.0mg/ml)，再加入等体积0.05M的pH为7.5的硼砂缓冲液，再加入SC-mPEG固体6.0mg，混匀，于4℃反应30min，终止反应。
取上述反应液分别上柱分离。色谱条件Sephacryl S-200(1cm×50cm)，流动相为50mM醋酸缓冲液(pH6.0)，流速0.3ml/min。收集各洗脱峰。
结果表明，分子量大于标准白介素-2的洗脱峰有两个，分别为单一修饰的白介素-2和多修饰的白介素-2。
将各洗脱峰适当浓缩，采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶15％，浓缩胶5％。结果见图1，各分离组分呈单一条带，表明修饰条带与未修饰条带被完全分离开。图中，Mmarker。1分离前的PEG-IL-2反应液。2，3分离到的PEG-IL-2，其中2为多修饰的PEG-IL-2，3为单修饰的PEG-IL-2。
实施例4分离后各组分的抗病毒活性测定参照中国生物制品规程(2000年版)中的方法，对分离到的单一修饰产物、多修饰产物和未修饰组分的活性(以IU/mg表示)进行测定，并以白介素-2原液的活性为对照，计算活性的保留情况。
结果表明单一修饰产物的活性保留率达60％以上，多修饰产物的活性保留率达30％以上，而未修饰组分的活性保留率达90％以上。说明单一修饰产物活性保留较好，而未修饰组分则可重新加以利用，避免了浪费。
实施例5修饰后白介素-2体外稳定性的研究热稳定性取白介素-2、单修饰白介素-2和多修饰白介素-2分别置于4℃、25℃、37℃条件下，定时取样测定活性。结果表明，37℃时，白介素-2在2h内活性不变，单修饰白介素-2在5h内，多修饰白介素-2在8-10h内能够维持活性不变。25℃时，白介素-2在2天内能够活性不变，单修饰白介素-2在5天以上能够维持90％的活性，多修饰白介素-2在10-15天内能够维持活性不变。4℃时，白介素-2在15-20天内可以保持活性不变，单修饰白介素-2在30-35天，多修饰白介素-2在60-65天内可维持抗病毒活性不变(上述稳定性试验是在液体状态，无任何保护剂的条件下进行的)。因此，可以初步认为聚乙二醇修饰可以明显增加白介素-2的热稳定性。
酶稳定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.84)2.7ml，各加入0.3ml白介素-2、单修饰白介素-2，多修饰白介素-2，25℃保温，分别于0、20、40、60、90min和3、4.5、6h取样0.3ml，测定白介素-2的活性。结果表明，白介素-2在3-5min内活性迅速降到原来的50％，而单修饰白介素-2为15-20min，多修饰白介素-2为30-35min。因此，聚乙二醇修饰能够明显增强白介素-2抗胰蛋白酶水解的能力。
实施例6修饰后白介素-2血浆药代动力学研究采用氯胺T氧化法对白介素-2、单修饰白介素-2和多修饰白介素-2进行125I标记。
取昆明种小鼠27只，随机分为3组，每组9只，称重。实验前12小时给每只小鼠腹腔注射1％KI 1ml，以封闭甲状腺。同时，将离心管肝素化。配制1×108cpm的125I-蛋白(白介素-2、单修饰白介素-2和多修饰白介素-2)工作溶液。将小鼠麻醉，尾静脉注射给药(0.2ml/20g体重)，分别于给药后15min、30min、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h从眼球后静脉丛取血0.5ml。离心分离血浆，4℃保存。分别吸取各时间点的血浆100ul，测定放射性计数(cpm)，并绘制曲线。经计算机拟合，结果符合一级消除动力学的二房室模型。单修饰白介素-2和多修饰白介素-2半衰期比白介素-2增加了15-20倍。
实施例7用单甲氧基聚乙二醇2000、单甲氧基聚乙二醇5000、单甲氧基聚乙二醇10000和单甲氧基聚乙二醇20000，代替实施例1中的单甲氧基聚乙二醇12,000，得到与以上实施例1-5相似的结果。
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰重组人白介素，其特征在于，重组人白介素上连接有一条、两条或者两条以上的聚乙二醇链。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰重组人白介素，其特征在于，重组人白介素为重组人白介素-2。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰重组人白介素，其特征在于聚乙二醇连接在重组人白介素的氨基上。
4.根据权利要求1、2或3所述的聚乙二醇修饰重组人白介素，其特征在于所说的聚乙二醇链的分子量为2000-20000。
5.制备权利要求1～4任一项所述的聚乙二醇修饰的重组人白介素的方法，其特征在于，包括如下步骤将硼砂缓冲液加入重组人白介素溶液，调节其pH值至6.0-9.0，然后加入碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯进行反应，反应时间不少于15分钟，将反应混合液用色谱分离，获得聚乙二醇修饰的重组人白介素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应在0-25℃下进行。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所说的重组人白介素溶液为重量浓度为1mg/ml的水溶液。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯与重组人白介素的摩尔比为碳酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯∶重组人白介素＝1∶1～20。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，色谱条件是采用(SephacrylS-200)，流动相为含氯化钠的醋酸缓冲液。
10.根据权利1、2或3所述的聚乙二醇修饰重组人白介素的用途，其特征是，用于制备抗病毒和抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明公开了一种聚乙二醇修饰重组人白介素及其制备方法。其特征是重组人白介素上连接有一条、二条或者二条以上的聚乙二醇链。本发明的聚乙二醇修饰的重组人白介素具有白介素的生理活性，而稳定性优于白介素，它的血浆清除率低，体内半衰期长，可用于制备抗病毒、抗癌等药物。
文档编号A61P31/12GK1651461SQ200410084669
公开日2005年8月10日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者魏东芝, 宫兴文, 何明磊 申请人:华东理工大学