专利名称：用于防止由糖尿病引起的微血管疾病的发展或恶化的血管紧张素Ⅱ受体阻断剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及血管紧张素II受体阻断剂(inhibitors of angiotensin II receptorblockers)领域，以及具体涉及所述阻断剂用于防止在糖尿病中影响眼睛(糖尿病性视网膜病)和肾脏(糖尿病性肾病)的微血管疾病(即涉及微血管的疾病)的发展或恶化(progression)的用途。
糖尿病是不能在机体中正常代谢碳水化合物(例如，食物淀粉、糖、纤维素)的病症。该疾病的特征在于，过量的糖存在于血液(高血糖症)和尿中，胰岛素生成和/或利用不足，以及口渴、饥饿和体重减少。糖尿病影响着约2％的人口。这其中的10-15％为胰岛素依赖性(1型)糖尿病，其余的为非胰岛素依赖性(2型)糖尿病。
视网膜病是由微血管改变引起的对视网膜的损伤。糖尿病性视网膜病是1型和2型糖尿病特定的微血管并发症。视网膜病的发病率与糖尿病的持续时间紧密相关联。患糖尿病20年后，几乎所有1型糖尿病患者以及超过60％的2型糖尿病患者具有不同程度的视网膜病。糖尿病患者失明的机率比普通人群高25倍。在新诊断出糖尿病患者中的五分之一具有不同程度的视网膜病。另外，视网膜病发展较早，并且在具有较高收缩血压的糖尿病患者中更严重。通常，在患糖尿病7年后仔细的眼科检查可以发现轻微的视网膜异常，但是威胁视力的损伤通常发生在很多年以后。在许多国家的工作年龄的人群中，糖尿病性视网膜病是最常见引发失明的原因。
在视网膜病的早期，在视网膜中小血管的衰弱导致在血管中的膨胀(微动脉瘤)以及体液(渗出液)和血液的渗漏(出血)。疾病的晚期阶段为增生视网膜病，其涉及在视网膜上和玻璃体中生长出脆的新生血管，以及在眼球中出现胶状物质。这些血管可能破裂并向玻璃体中释放血液，这可以导致视力模糊或暂时性失明。随后可出现的瘢痕组织可能勒紧视网膜并因此引发视网膜剥离，其可导致永久性视力丧失。也可能发生由于在黄斑周围聚集的体液膨胀而导致的黄斑水肿，而视网膜黄斑对于良好的视力是至关重要的。如果不治疗增生视网膜病，病人中的大约一半将会在五年中失明，而在受到治疗的患者中仅有5％。
如果早期检测到，该疾病可以应用激光凝固进行治疗。另外，在任何时候降低由糖尿病引起的高血糖症将显著降低视网膜病的长期发病率和恶化(progression)以及发展成视力丧失。在EUCLID研究中，血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂赖诺普利(lisinopril)能够减少约50％视网膜病恶化的风险，并且可以显著降低增生视网膜病恶化的风险。但是，在EUCLID研究中视网膜病并不是主要目标，所以该研究不能足以得出与眼睛相关疾病的结论。与丧失视力相关的费用相比较，防止该疾病的发展或恶化可以在相对低费用的条件下有效的保护视力。因此，本发明目的在于提供有利于防止糖尿病性视网膜病的发展或恶化的其它方法。
肾病是肾的衰退。糖尿病性肾病是1型和2型糖尿病的特定的微血管并发症。1型糖尿病更容易导致称为晚期肾病的终末期肾脏疾病(ESRD)。糖尿病性肾病有五个阶段，第五阶段为ESRD。从一个阶段发展为下一个阶段可以经过许多年，发展为第五阶段的平均时间长度为23年。糖尿病是导致ESRD的最常见的原因，在美国高于40％的病例会导致ESRD。
对于糖尿病性肾病的治疗努力控制并减缓疾病的发展。对攻击性血压的控制在保护肾脏功能中是非常重要的因素。血管紧张素转换酶抑制剂被认为可以为肾脏提供最佳的保护。根据RENAAL研究(Brenner等，The NewEngland Journal of Medicine 345861-869，2001)血管紧张素II受体阻断剂氯沙坦(losartan)可能提供相似的保护，但是现在对于患者人群和结果测定仍很关心。由于在研究中这些方法上的瑕疵和不完善的数据，对于在治疗糖尿病性肾病中有效性和安全性的疑问仍然没有答案(Fisman等，CardiovascularDiabetology 12，2002)。从相似的IDNT研究的数据来看(Lewis等，The NewEngland Journal of Medicine 345851-860，2001)，已经得到如下结论，在保护由2型糖尿病引起的肾病以免发展中血管紧张素II受体阻断剂厄贝沙坦(irbesartan)是有效的。然而，防止疾病发展或恶化具有保护肾脏功能的能力。因此，本发明的另一方面提供其它方法以有利于防止糖尿病肾病的发展或恶化。
血管紧张素II在病理生理学中起重要作用，特别是可以作为人类最有效的血压增高剂。血管紧张素H受体阻断剂，具体为1型受体的阻断剂，用于治疗在哺乳动物中的高血压和充血性心力衰竭。血管紧张素II受体阻断剂(也称为血管紧张素II拮抗剂)的例子描述在EP-A-253310、EP-A-323841、EP-A-324377、EP-A-420237、EP-A-43983、EP-A-459136、EP-A-475206、EP-A-502314、EP-A-504888、EP-A-514198、WO 91/14679、WO 93/20816、US 4,355,040和US 4,880,804中。具体的血管紧张素II受体阻断剂为沙坦类例如坎地沙坦(candesartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)、奥美沙坦(olmesartan)、他索沙坦(tasosartan)、替米沙坦(telmisartan)或缬沙坦(valsartan)。
已经建立了正在进行的糖尿病性视网膜病坎地沙坦试验(DIRECT)项目，以检测由坎地沙坦阻断的AT1-受体是否可以防止糖尿病性视网膜病的发病率和恶化。这个项目涉及血压正常的个体或经治疗的高血压的个体，并将评估AT1-受体阻断剂在保护由糖尿病引起的眼部病理变化中的有效性。(sjlieand Chaturvedi，Joumal of Human Hypertension(August 2002)16 Suppl，pages 42-46)。
本发明的上下文中，血管紧张素II受体阻断剂对视网膜病的发展或恶化中的效果是在避免了广泛临床试验的细胞培养系统中检测的。无论所选择的或可能的血管紧张素II抑制剂是否在防止视网膜病的发展或恶化中有效，该系统均可以检测的。
微脉管系统的血管仅由两种细胞，上皮细胞和周皮细胞所构成。周皮细胞调控共同培养的上皮细胞的生长，并在维持微脉管自我平衡中起到非常重要的作用。例如它们保护共同培养的上皮细胞以产生前列腺环素的功能，并且保护其不受脂质-过氧化物-诱导的损伤。周皮细胞丧失和功能障碍是在糖尿病性视网膜病的早期观察到的特征性的组织病理学标志。
根据本发明的方法可以对血管紧张素II受体阻断剂，具体为对防止糖尿病性视网膜病或肾病发展或恶化的血管紧张素II受体阻断剂进行筛选。该方法包括(a)在存在或不存在有效的血管紧张素II受体阻断剂化合物的情况下，使用或不使用血管紧张素II处理周皮细胞组织培养细胞(b)测量在细胞内产生的活性氧类的量，以及(c)鉴定所述化合物，其抑制由于在培养基中存在血管紧张素II而诱导的细胞内部产生活性氧类。
采用的细胞培养系统基于从哺乳动物视网膜例如牛视网膜分离的周皮细胞。该细胞在商业可得的通常补充胎牛血清的细胞培养基例如Dulbecco′sEagle′s培养基中。术语活性氧类包含分子如过氧化氢，离子如次氯酸根离子，基团如羟基，该羟基是所有它们中最具有反应活性的，以及同时为离子和基团的超氧化物阴离子。该方法的一个重要的方面在于发现了在用血管紧张素II处理培养的细胞后，在周皮细胞中活性氧类的细胞内产生以剂量依赖性方式增加。同时在周皮细胞中由掺入[3H]胸苷测定的DNA合成降低，而血管通透性因子(VEGF)以及血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)的mRNA增加，其中血管通透性因子是在增生糖尿病性视网膜病的发病机理中涉及的上皮细胞的特异性促细胞分裂剂，血小板衍生生长因子-B是视网膜中微血管上皮细胞和胶质细胞的有效的促细胞分裂剂和化学引诱物。
血管紧张素II是高血压的引发剂，而已知高血压是糖尿病性视网膜病和肾病的主要危险因素。活性氧类损伤其它分子，并因此破坏细胞结构。通常细胞应用各种防御措施来防止活性氧类的有害作用，包含具有抗氧化特性的小分子例如α生育酚(维生素E)、尿酸和维生素C或两种酶超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。在用血管紧张素II处理周皮细胞时，添加附加量抗氧化剂如N-乙酰半胱氨酸(NAC)将逆转由存在血管紧张素II诱导的活性氧类产生的增加。
基于这些发现，缺乏抗氧化特性的化合物如果在周皮细胞培养中能够抑制由于存在于细胞培养基中的血管紧张素II诱导的活性氧类的细胞内产生，它们将防止糖尿病性视网膜病或肾病的发展或恶化。因此，可以在化合物存在或不存在的条件下，通过使用或不使用血管紧张素II处理周皮细胞1-48小时，优选24小时，来筛选该化合物。治疗后，检测活性氧类的产生。用这种筛选方法已经找到血管紧张素II受体阻断剂如替米沙坦(telmisartan)，以抑制在周皮细胞培养中由血管紧张素II诱导的活性氧类产生的增加，然而仅用受体阻断剂的处理不能影响活性氧类的产生。因此，在周皮细胞中血管紧张素II受体信号传导的激活有助于糖尿病性微血管病的发病机制，使用化合物例如替米沙坦拮抗血管紧张素II通过减少周皮细胞丧失和机能障碍防止了疾病例如糖尿病性视网膜病的发展或恶化。
作为这些发现的结果，本发明教导了一种防止由糖尿病所引起的微血管疾病例如糖尿病性视网膜病或肾病的发展或恶化的方法，包含向需要的个体给药药学有效量的血管紧张素II受体阻断剂。血管紧张素II受体阻断剂可用于制备药物组合物以在需要的个体中防止由糖尿病所引起的的微血管疾病的发展或恶化。
血管紧张素II受体阻断剂优选的例子为坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦或缬沙坦，但是只要能够在周皮细胞培养中抑制由血管紧张素II诱导的活性氧类产生的增加，任何受体阻断剂均可使用。认为需要该治疗的个体被一种或多种的糖尿病性视网膜病危险因素所影响。该危险因素的例子为糖尿病、高血糖水平、蛋白尿、高的血液尿素氮、高的血液肌酐、微白蛋白尿或系统性高血压。
采用的受体阻断剂的量取决于实际的活性成分，并通常相当于用于治疗高血压的量。可以按照经口、含服、非肠胃、吸入喷雾、直肠或局部给药活性化合物，优选经口给药。非肠胃给药可包括皮下、静脉、肌内和胸骨内注射和输注技术。
用于防止糖尿病性视网膜病发展或恶化的药物组合物包含的药学有效量的血管紧张素II受体阻断剂，其基本取决于给药的方式。剂量范围包括0.5-500mg/kg p.o.，优选2-80mg/kg p.o.，以及3mg/kg i.v。
可以经口给药各种不同剂型的活性化合物，即其可使用各种可药用惰性载体来配制成片剂、胶囊、锭剂、含片、硬糖剂、粉末、喷雾剂、含水混悬液、酏剂、糖浆等的形式。所述载体包括固体稀释剂或填料、无菌水性介质以及各种无毒有机溶剂等。而且，这些经口药物制剂可通过使用各种用于此类目的的常用类型的添加剂进行合适的增加甜味和/或调味。通常，本发明的化合物在这些口服剂型中的浓度水平，以全部组合物的重量计为约0.5％-90％，该剂量足以提供期望的单位剂量。本发明化合物的其它适合剂型包含本领域普通技术人员所熟知的控制释放制剂和设备。
为了用于口服给药，包含各种赋形剂例如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙的片剂可以包含各种崩解剂如淀粉优选马铃薯或木薯淀粉、海藻酸和某些复合硅酸盐，以及粘合剂如聚乙烯吡咯酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，润滑剂如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石或相似类型的组合物也可以作为填料被应用软和硬充填明胶胶囊中；该填料包含乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。当希望将含水混悬液和/或酏剂用于口服给药时，其中必须的活性成分可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料，如果需要，乳化剂和/或水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种组合相组合。
为了用于非肠胃给药，可以采用化合物在芝麻油或花生油或者在水性丙二醇中的溶液，以及在相应可药用盐无菌水溶液。如果需要，所述水溶液可以被适当地缓冲，并且该液体稀释剂用足量的盐水或葡萄糖进行等渗。这些具体的水溶液可特别适用于静脉内、肌内和皮下注射目的。在这一方面，采用的无菌水性介质可以容易地由本领域普通技术人员所熟知的标准技术得到。例如，通常使用蒸馏水作为液体稀释剂，并且最终制剂通过合适的细菌过滤器如烧结玻璃滤器或者硅藻土或无釉瓷滤器。此类型的优选滤器包括Berkefeld、Chamberland和Asbestos Disk-Metal Seitz过滤器，其中所述液体在抽吸泵的帮助下被吸入无菌容器。在这些可注射溶液的制备中，需要采取必要的步骤以确保得到的最终产品是无菌状态。为了用于透皮给药，具体化合物的剂型可以包含例如溶液、洗液、软膏、霜剂、凝胶剂、栓剂、限速的持续释放制剂及其设备。这些剂型包含具体化合物，还可包含乙醇、水、渗透促进剂和惰性载体例如产生凝胶的物质、液状石蜡、乳化剂、苯甲醇等。
血管紧张素II受体阻断剂可以按照每天剂量为10mg(或0.143mg/kg，以人体重为70kg计)至500mg(7.143mg/kg)经口给药，和以约20mg(0.286mg/kg)非肠胃给药，优选以20mg(0.286mg/kg)至100mg(1.429mg/kg)经口给药。特别优选的是按照每天剂量为40mg(0.571mg/kg)至80mg(1.143mg/kg)或特别为约80mg(1.143mg/kg)经口给药。
一些血管紧张素II受体阻断剂已经面市并可用于给药，例如Approvel、Atacand、Blopress、Cozaar、Diovan、Karvea、Lortaan、Lorzaar、Losaprex、Micardis、Neo-Lotan或Oscaar、以及Teveten。
实施例所有的值表示为平均值±标准误(SE)。使用史蒂顿特氏t试验对于成对的比较进行统计学显著性的评价，P＜0.05被认为是显著的。
实施例1 在周皮细胞中活性氧类的检测正如在Yamagishi等，Circulation 871969，1993中所描述的那样，从牛视网膜中分离周皮细胞，并在补充有20％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′sEagle′s培养基中培养。
血管紧张素II的处理在包含2％FBS的培养基中进行。在存在或不存在10-7M替米沙坦的条件下，使用或不使用10-7或10-6M血管紧张素II处理周皮细胞24小时。然后使用荧光探针CM-H2DCFDA(Molecular Probes Inc，Eugene，OR)按照由Yamagishi等，A J Biol Chem 27625096，2001所描述的方法检测活性氧类的细胞内产生。
血管紧张素II以剂量依赖性方式增加了活性氧类在细胞内的产生。10-6M血管紧张素II导致了约1.3倍的增加。已经发现替米沙坦可以完全抑制在周皮细胞中由血管紧张素II诱导的活性氧类产生的增加，而仅替米沙坦不能影响该产生。
实施例2 检测在周皮细胞中的[3H]胸苷掺入在存在或不存在1mM N-乙酰半胱氨酸(NAC)的条件下，使用或不使用10-7M血管紧张素处理周皮细胞24小时，然后按照在Yamagishi等，FEBSLett 384103，1996中所描述的方法检测细胞中[3H]胸苷掺入。
血管紧张素II显著地抑制了在周皮细胞中的DNA合成。NAC显著地防止了在周皮细胞中由血管紧张素II诱导的在DNA合成方面的疾病。
实施例3 VEGF m-RNA的定量逆转录PCR用于检测VEGF和β-肌动蛋白mRNAs的序列和引物描述于Yamagishi等，J Biol Chem 2728723，1997中。
Poly(A)+RNAs由细胞分离，该细胞在存在或不存在10-7M替米沙坦或1mM NAC的条件下，使用或不使用10-7M血管紧张素II处理4小时，并且该Poly(A)+RNAs按照Yamagishi等，Diabetologia 411435，1998所描述的定量逆转录PCR(RFPCR)进行分析。poly(A)+RNA模板的量(约30ng)以及扩增的细胞分裂周期数(VEGF基因28周期，β-肌动蛋白基因22周期)被选择在定量的范围，是进行线形反应，其是按照在Yamagishi等，J BiolChem 27720309，2002中描述的通过将信号强度作为模板量和细胞周期数的函数作图而进行检测的。
已经报导从单个VEGF基因中存在有五种可选的剪接产物(splicedproduct)。它们被称为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206。由于RNA印记分析不能清晰地区别这五种mRNA产物，我们采用在Okamoto等，FASEB J 161928，2002中描述的更加敏感的半定量RT-PCR技术。在这些实验中，486和618碱基对长度的cDNA产物分别由VEGF121和VEGF165的mRNA扩增。血管紧张素II在周皮细胞中能显著地正调节VEGF mRNA水平的这些分泌形式。当暴露于10-7M血管紧张素II时，VEGF mRNA水平比基本水平约高1.5倍。已经发现替米沙坦和NAC完全抑制在周皮细胞中由血管紧张素II-诱导的VEGF mRNA水平的正调节。
实施例4 牛PDGF-B部分cDNA的分子克隆牛PDGF-B部分cDNA使用引物序列进行克隆，该引物序列是由在人和羊PDGF-B中保守氨基酸序列GELESL和NNRNVQ设计的。上游和下游引物分别为5′-GGCGAGCTGGAGAGCTT-3′和5′-CTGCACGTTGCGGTTGT-3′。按照生产商(Promega，Madison，WI，USA)的说明使用pGEM-T Easy Vector System，由30ng牛视网膜周皮细胞Poly(A)+RNA扩增和克隆得到213-碱基对的RT-PCR产物。克隆的PCR产物按照生产商说明(DNA序列测定试剂盒，Applied Biosystems，Foster，CA，USA)使用链终止方法进行测序。克隆的牛cDNA片段显示出与人和羊PDGF-B惊人的序列相似性。与人和羊PDGF-B相比较，核苷酸鉴定分别为91％和94％，氨基酸鉴定分别为91％和96％。
实施例5 PDGF-B m-RNA的定量逆转录PCR为了研究血管紧张素II在培养的视网膜周皮细胞中对PDGF-B基因表达的作用，将Poly(A)+RNA从细胞中分离出来并按照在Yamagishi等，KidneyInt 63464，2003中所描述的RT-PCR进行分析，其中所述细胞在存在或不存在10-7M替米沙坦或1mM NAC的条件下，使用或不使用10-7M血管紧张素II处理4小时。Poly(A)+RNA模板的量(约30ng)和用于扩增的细胞周期数(PDGF-B基因28周期，β-肌动蛋白基因22周期)被选择在定量的范围，是进行线形反应，其是按照在Yamagishi等，J Biol Chem 27720309，2002中的描述通过将信号强度作为模板量和细胞周期数的函数作图而进行检测的。用于检测牛β-肌动蛋白mRNA的引物序列与在Okamoto等，FASEB J161928，2002中的相同。
在血管增生视网膜病中涉及PDGF-B，半合视紫质启动因子/PDGF-B转基因小鼠显示出导致视网膜剥离的血管细胞、胶质细胞和视网膜色素上皮细胞增生。在本实验中发现血管紧张素II在周皮细胞中显著地正调节PDGF-B mRNA水平。当暴露于10-7M血管紧张素II时，PDGF-B mRNA水平比基本水平高大约5倍。发现替米沙坦或NAC显著地抑制由血管紧张素II诱导的对PDGF mRNA水平的正调节。由此得出如下结论，在通过超表达PDGF-B的增生糖尿病性视网膜病的视网膜剥离的发病机理中涉及血管紧张素II与1型受体的相互作用，以及由血管紧张素II受体阻断剂拮抗血管紧张素II的作用通过在机体中减少PDGF-B的表达从而延迟或甚至防止了糖尿病性视网膜病的恶化。
权利要求
1.一种防止由糖尿病引起的微血管疾病发展或恶化的方法，包括向需要的个体给药药学有效量的血管紧张素II受体阻断剂。
2.权利要求1的方法，其中血管紧张素II受体阻断剂为在周皮细胞培养中抑制活性氧类在细胞内产生的受体阻断剂，该活性氧类在细胞内的产生是由存在于培养基中的血管紧张素II诱导的。
3.权利要求2的方法，其中血管紧张素II受体阻断剂选自坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦或缬沙坦。
4.权利要求1的方法，其防止糖尿病性视网膜病的发展或恶化。
5.权利要求1的方法，其中所述个体受到一种或多种危险因素的影响，该危险因素为糖尿病、高血糖水平、蛋白尿、高的血液尿素氮、高的血液肌酐、微白蛋白尿或系统性高血压。
6.一种用于防止由糖尿病引起微血管疾病发展或恶化的血管紧张素II受体阻断剂的筛选方法，包括(a)在存在或不存在有效血管紧张素II受体阻断剂化合物的条件下，使用或不使用血管紧张素II处理周皮细胞组织的培养细胞，(b)测量在细胞内产生的活性氧类的量，以及(c)鉴定所述化合物，该化合物抑制由于在培养基中存在血管紧张素II而诱导的细胞内部产生活性氧类。
7.用于防止由糖尿病引起微血管疾病例如糖尿病性视网膜病发展或恶化的药物组合物，包含药学有效量的血管紧张素II受体阻断剂。
8.血管紧张素II受体阻断剂在制备药物组合物中的用途，该组合物在需要的个体中防止由糖尿病引起的微血管疾病例如糖尿病性视网膜病的发展或恶化。
9.权利要求8的用途，其中血管紧张素II受体阻断剂为在周皮细胞培养中抑制活性氧类在细胞内产生的受体阻断剂，该活性氧类在细胞内的产生是由存在于培养基中的血管紧张素II诱导的。
10.权利要求9的用途，其中血管紧张素II受体阻断剂选自坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦或缬沙坦。
11.权利要求8的用途，其中所述个体受到一种或多种危险因素影响，该危险因素为糖尿病、高血糖水平、蛋白尿、高的血液尿素氮、高的血液肌酐、微白蛋白尿或系统性高血压。
全文摘要
本发明涉及血管紧张素II受体阻断剂领域，以及具体涉及所述阻断剂用于防止在糖尿病中影响眼睛(糖尿病性视网膜病)和肾脏(糖尿病性肾病)的微血管疾病(即涉及小血管的疾病)的发展或恶化的用途。
文档编号A61P3/00GK1784225SQ200480011878
公开日2006年6月7日 申请日期2004年4月30日 优先权日2003年5月2日
发明者山岸松一 申请人:贝林格尔.英格海姆国际有限公司